低溫環(huán)境下酪氨酸和半胱氨酸聯(lián)合刺芒柄花素調(diào)控小鼠肝臟產(chǎn)熱的機(jī)制

李仕韋，徐彬，張博熙，李士澤

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，大慶 163319）

中國北方地區(qū)緯度較高、白晝短，臨近冬季風(fēng)發(fā)源地，冬季寒冷且漫長，常導(dǎo)致畜禽暴露于低溫環(huán)境中。冷暴露與機(jī)體健康密切相關(guān)，適當(dāng)?shù)牡蜏丨h(huán)境對于某些種植業(yè)的發(fā)展具有一定優(yōu)勢，但對于養(yǎng)殖業(yè)來說恰恰相反。在寒冷地區(qū)的冬季、春初或秋末，由于氣溫變化幅度大，畜禽出現(xiàn)冷應(yīng)激現(xiàn)象的幾率非常高。研究上，將機(jī)體對寒冷刺激做出的非特異性應(yīng)答反應(yīng)，稱之為冷應(yīng)激。冷應(yīng)激可對畜禽的健康和生產(chǎn)力造成不利影響，導(dǎo)致家畜生長緩慢、生產(chǎn)效能下降、飼養(yǎng)效率降低和免疫功能障礙[1]。當(dāng)畜禽處在冷應(yīng)激狀態(tài)下時(shí)，為保持機(jī)體正常的生存體征，機(jī)體中的能量首先被用于保持體溫，這就導(dǎo)致沒有多余的能量來促進(jìn)機(jī)體生長發(fā)育，進(jìn)而導(dǎo)致動物體重下降、增長緩慢甚至?xí)l(fā)多種疾病。綜上可知，冷應(yīng)激已成為制約我國北方畜牧業(yè)發(fā)展的重要因素之一。

機(jī)體在感受環(huán)境中的冷熱溫度刺激后，自身可以進(jìn)行體溫調(diào)節(jié)，從而將體溫控制在一定范圍內(nèi)以適應(yīng)環(huán)境的變化。其中產(chǎn)熱過程主要通過肝臟、棕色脂肪組織（BAT）、骨骼肌等組織及器官在生理代謝及運(yùn)動做功過程中釋放能量來實(shí)現(xiàn)，可分為非戰(zhàn)栗產(chǎn)熱（non-shivering thermogenesis，NST）和戰(zhàn)栗產(chǎn)熱（shivering thermogenesis）。質(zhì)子漏產(chǎn)熱作為NST 的三大途徑之一，主要發(fā)生在BAT、肝臟、骨骼肌和腎等組織器官中。線粒體可以通過三羧酸循環(huán)氧化機(jī)體的營養(yǎng)物質(zhì)，電子傳遞鏈泵出的H+在線粒體內(nèi)膜上所形成的濃度差和電位差用于儲存氧化所得的能量。當(dāng)線粒體內(nèi)膜上存在質(zhì)子漏時(shí)，H+會通過質(zhì)子漏泄漏回線粒體基質(zhì)中，此過程降低電位差并且不伴隨ATP 合成，因此將電勢能轉(zhuǎn)化為了熱能。生熱過程中的一個(gè)關(guān)鍵角色是解偶聯(lián)蛋白-1（UCP1），它將ATP 合成與氧化磷酸化解偶聯(lián)，將后者過程中產(chǎn)生的質(zhì)子直接轉(zhuǎn)回線粒體內(nèi)膜，進(jìn)而產(chǎn)生熱量[2-3]。嚙齒動物中的BAT 比人類更豐富，它在冷暴露中的激活有助于全身脂質(zhì)清除和血糖控制，但在冷暴露后嚙齒動物產(chǎn)熱調(diào)節(jié)的研究方面大量學(xué)者很少考慮到BAT 以外的器官。肝臟作為NST 的主要產(chǎn)熱組織器官之一，也是機(jī)體暴露在冷環(huán)境下的重要產(chǎn)熱組織，但其生理功能有局限性，故在冷環(huán)境中NST 產(chǎn)熱增加量也受到限制，因此促進(jìn)冷環(huán)境下肝臟組織產(chǎn)熱能力對動物機(jī)體維持體溫恒定有著重要的意義。

酪氨酸是一種非必需氨基酸，也是一種抗氧化劑，能清除體內(nèi)的自由基并抑制脂質(zhì)過氧化。半胱氨酸作為谷胱甘肽的前體物質(zhì)，具有創(chuàng)傷修復(fù)，抗菌消炎和解毒的功能[4-6]。刺芒柄花素［7-羥基-3（4-甲氧基苯基）色酮］是一種異黃酮化合物，廣泛存在于天然植物中，它是多種中草藥中的主要生物活性化合物之一。已有研究表明，刺芒柄花素具有抗氧化[7]、抗炎[8]、抗細(xì)胞凋亡[9]等作用。研究發(fā)現(xiàn)，刺芒柄花素通過TFEB 介導(dǎo)的溶酶體生物合成改善肝臟脂肪變性[10]；黃芪組分刺芒柄花素作為核激素受體PPARγ 的激動劑，能夠有效調(diào)控白色脂肪細(xì)胞褐色化，減少肥胖及其相關(guān)代謝疾病的發(fā)生[11]。新合成的刺芒柄花素類似物XH601 可降低高脂血癥小鼠的脂肪重量和血清甘油三酯、總膽固醇和低密度脂蛋白水平，同時(shí)增加血清高密度脂蛋白水平[12]。

刺芒柄花素在臨床中具有穩(wěn)定性好、副作用小等特點(diǎn)。介于上述背景，刺芒柄花素在冷暴露中尚未有研究。因此，試驗(yàn)選擇刺芒柄花素為治療藥物，探究其在冷暴露條件下聯(lián)合酪氨酸和半胱氨酸對小鼠肝臟產(chǎn)熱能力的影響，為提高畜禽冬季抗冷應(yīng)激能力提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

主要試劑：4%多聚甲醛、蘇木精染色劑、伊紅染色劑、油紅O 染色試劑盒、RIPA 裂解液、PMSF 蛋白酶抑制劑、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE 制膠試劑盒、SDA-PAGE 蛋白上樣緩沖液（5X）均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；蛋白marker、底物發(fā)光液、PVDF 膜購自美國MILLIPORE 公司；PGC-1α鼠單克隆抗體、PPAR-γ 兔多克隆抗體、UCP1 兔多克隆抗體、β-Tubulin 鼠單克隆抗體、HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG 和山羊抗鼠IgG 均購自美國proteintech 公司。

主要儀器：37 ℃恒溫培養(yǎng)箱，臺式低速離心機(jī)，低溫離心機(jī)，倒置生物顯微鏡，制冰機(jī)，-80 ℃超低溫冰箱，4 ℃冰箱，-20 ℃冰箱，MM400 混合型球磨儀，酶標(biāo)儀，電泳槽，轉(zhuǎn)膜儀，搖床，電子天平。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物

4 周齡雄性SPF 級C57BL/6J 小鼠購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司。將其隨機(jī)分為常溫對照組（RT 組）、冷暴露組（CE 組）、冷暴露+8 mg/kg/d 刺芒柄花素組（CE+FMN8 組）及冷暴露+16 mg/kg/d 刺芒柄花素組（CE+FMN16 組），每組10 只，晝夜交替光照12 h，自由飲水，室溫（26±1）℃預(yù)飼一周后對加藥組小鼠進(jìn)行相應(yīng)濃度的灌胃，灌胃結(jié)束后與冷暴露組一起每天置于4 ℃人工氣候室中冷刺激3 h，為期28 d。4 周后處死小鼠并采集肝臟組織。

1.3 實(shí)驗(yàn)飼料

半胱氨酸純度99.66%，酪氨酸純度＞98%，購自浙江一諾生物科技有限公司。在1 kg 鼠糧中添加60 g的酪氨酸混合半胱氨酸（1∶1 混合），加工自沈陽前民飼料廠。

1.4 H&E 染色

將肝臟組織固定于4%多聚甲醛緩沖液，置于包埋盒中，流水沖洗30 min，利用不同濃度的酒精脫水，在二甲苯溶液中使組織透明后，將透明組織放在石蠟中，包埋后進(jìn)行切片。染色前，采用二甲苯溶液脫蠟后，放入由高到低濃度梯度的酒精中，用蒸餾水清洗。將切片置于蘇木精染液中幾分鐘，放于鹽酸乙醇和氨水中各30 s 進(jìn)行分色，用伊紅染色液染色2～3 min，通過不同濃度的酒精脫水，利用二甲苯溶液透明后封片。在200 放大倍率下觀察各組肝臟組織病理形態(tài)。

1.5 免疫組織化學(xué)技術(shù)

將固定后的肝臟組織進(jìn)行固定和脫水處理，將處理后的組織包埋在石蠟中，包埋后的肝臟組織用切片機(jī)切成5 μm 厚的切片，將處理后的切片進(jìn)行脫蠟和抗原修復(fù)。處理完畢后，對切片進(jìn)行血清封閉然后加一抗4 ℃孵育過夜。一抗孵育結(jié)束后加入二抗37 ℃孵育30 min，二抗孵育結(jié)束后加入SABC 37 ℃孵育30 min，孵育結(jié)束后加入顯色劑，將顯色后的切片加入蘇木精復(fù)染，復(fù)染結(jié)束后進(jìn)行脫水和封片。

1.6 產(chǎn)熱因子表達(dá)水平的檢測

用RIPA 提取肝臟組織中的總蛋白質(zhì)，提取后在4 ℃和12 000 RCF 的條件下離心10 min。離心結(jié)束后收集上清液用BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，加入上樣緩沖液使其變性。以上試劑均購自碧云天生物技術(shù)有限公司。將每個(gè)樣品等量的加入SDS-PAGE 凝膠上并進(jìn)行電泳。電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，用5%脫脂奶粉封閉PVDF 膜2 h，封閉結(jié)束后孵育一抗（1∶1 000）8 小時(shí)，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔和山羊抗鼠（1∶10 000 稀釋）孵育1 h。用Chemi Doc XRS+（Bio-Rad，USA）凝膠成像系統(tǒng)檢查印跡，并用Image-J 軟件分析目的蛋白與內(nèi)參的灰度比值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 26.0 進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差（Mean±SEM）表示，組間Western Blot 結(jié)果比較分析用 One-way ANOVA，P＜0.05 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠肝臟組織病理變化

肝臟組織形態(tài)是評價(jià)肝損傷的重要方法和依據(jù)，圖1 為小鼠肝臟HE 染色結(jié)果圖。通過HE 染色可以發(fā)現(xiàn)，RT 組小鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)相近，細(xì)胞核大小相似，分布均勻，肝細(xì)胞輪廓清晰，肝索自中央靜脈呈放射狀排列。CE 組肝組織出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤，肝細(xì)胞出現(xiàn)點(diǎn)狀壞死，并且有部分細(xì)胞出現(xiàn)核皺縮。CE+FMN16 組肝索結(jié)構(gòu)清晰，未見明顯炎性細(xì)胞浸潤和肝細(xì)胞壞死。由此可以判斷慢性冷暴露誘導(dǎo)了小鼠的肝損傷，這種損傷可以被酪氨酸和半胱氨酸聯(lián)合刺芒柄花素所緩解。

圖1 小鼠肝臟組織HE 染色形態(tài)圖（200×）Fig.1 HE staining morphology of liver tissue in mice（200×）

2.2 UCP1 的IHC 結(jié)果

為探究慢性冷暴露對小鼠肝臟產(chǎn)熱能力的影響，研究采用免疫組化法對肝組織UCP1 蛋白的表達(dá)量進(jìn)行量化統(tǒng)計(jì)。免疫組化結(jié)果顯示，相比于RT 組，CE 組中肝臟UCP1 陽性染色表達(dá)量顯著降低（圖2）；與CE 組相比，CE+FMN16 組中肝臟UCP1 陽性染色表達(dá)量顯著升高，表明冷暴露條件下酪氨酸和半胱氨酸聯(lián)合刺芒柄花素后，小鼠肝臟組織中的UCP1 表達(dá)量顯著增強(qiáng)，進(jìn)而促進(jìn)小鼠肝臟組織發(fā)揮產(chǎn)熱作用。

圖2 小鼠肝臟組織IHC 結(jié)果圖（200×）Fig.2 IHC results of mouse liver tissue（200×）

2.3 產(chǎn)熱因子表達(dá)水平

通過Western Blot 方法檢測產(chǎn)熱相關(guān)因子的表達(dá)水平，結(jié)果如圖3 所示。與RT 組相比，慢性冷暴露對小鼠肝組織中PGC-1α 和UCP1 的表達(dá)水平無顯著影響，但顯著上調(diào)了PPAR-γ 的表達(dá)；與CE 組相比，酪氨酸和半胱氨酸聯(lián)合16 mg/kg/d 刺芒柄花素顯著上調(diào)了產(chǎn)熱因子PGC-1α、PPAR-γ 和UCP1 的表達(dá)水平。綜上所述，添加刺芒柄花素可以顯著增強(qiáng)肝臟產(chǎn)熱相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)肝臟產(chǎn)熱來維持體溫。

圖3 Western blot 檢測各組小鼠肝臟中產(chǎn)熱蛋白的表達(dá)水平Fig.3 Western blot detection of the expression levels of thermogenic proteins in the liver of each group of mice

3 討論

寒冷是北方地區(qū)動物面臨的最常見的應(yīng)激因素之一，寒冷因素給機(jī)體帶來的損傷是不可估量的。動物長期處于寒冷環(huán)境中，會破壞機(jī)體內(nèi)環(huán)境的平衡狀態(tài)，同時(shí)也會增加機(jī)體的產(chǎn)熱，降低動物的生產(chǎn)性能和飼料利用效率，嚴(yán)重制約了畜牧業(yè)的發(fā)展。在寒冷環(huán)境下，細(xì)胞、器官會協(xié)調(diào)一致的維持體溫恒定，以平衡內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)[13-14]，肝臟是機(jī)體暴露在冷環(huán)境下的重要產(chǎn)熱組織，但其生理功能有局限性，故在冷環(huán)境中NST 的產(chǎn)熱增加量也受到限制，因此促進(jìn)冷環(huán)境下肝臟組織產(chǎn)熱對動物機(jī)體抗冷應(yīng)激進(jìn)而維持體溫恒定有著重要的意義。

寒冷引起的壓力和細(xì)胞反應(yīng)，通常被稱為適應(yīng)性產(chǎn)熱，對于維持體溫從而確保正常的器官功能至關(guān)重要。產(chǎn)熱程序的表達(dá)是由一個(gè)復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄機(jī)制調(diào)控的，它涉及到大量的轉(zhuǎn)錄因子、共同激活物和共同抑制物。最早發(fā)現(xiàn)適應(yīng)性產(chǎn)熱的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子之一是過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）共激活因子1-α（PGC1α）。PGC1α 在冷暴露、運(yùn)動或禁食時(shí)被誘導(dǎo)，主要通過核受體PPARγ 發(fā)揮適應(yīng)性產(chǎn)熱作用，也可通過甲狀腺激素受體發(fā)揮作用[15-17]。最近研究表明，PGC-1α 在皮下白色脂肪組織中對β-腎上腺素信號和冷暴露等生熱刺激有誘導(dǎo)作用，并通過與關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子PPAR-γ 結(jié)合刺激生熱基因的表達(dá)，促進(jìn)白色脂肪細(xì)胞向米色脂肪細(xì)胞的轉(zhuǎn)化[18]。此外，在白色脂肪細(xì)胞中過表達(dá)PGC1α 可誘導(dǎo)UCP1和呼吸鏈關(guān)鍵線粒體酶的表達(dá)[15]。相反，小鼠脂肪特異性PGC1α 缺失導(dǎo)致冷暴露后的產(chǎn)熱反應(yīng)減弱，核心體溫降低，脂肪庫中產(chǎn)熱基因表達(dá)減弱。研究發(fā)現(xiàn)，酪氨酸和半胱氨酸聯(lián)合刺芒柄花素的處理增加了小鼠肝臟中產(chǎn)熱因子PGC-1α、PPAR-γ 和UCP1的表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)小鼠肝臟的產(chǎn)熱能力。

UCP1 是冷介導(dǎo)的產(chǎn)熱的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，也是非顫栗性產(chǎn)熱的標(biāo)志蛋白[19-21]。研究發(fā)現(xiàn)，在冷敏感試驗(yàn)中，缺乏UCP1 基因的小鼠體溫下降顯著，而具有UCP1 基因的正常小鼠能維持機(jī)體正常體溫，這說明冷刺激下小鼠體溫主要通過UCP1 蛋白產(chǎn)熱來維持[22]。PGC-1α 作為一個(gè)共激活因子，可以與PPARγ相互作用，PPARγ 可以結(jié)合到UCP1 啟動子區(qū)域，調(diào)控UCP1 的表達(dá)。UCP1 可以將氧化呼吸電子傳遞鏈產(chǎn)生的質(zhì)子動力勢能轉(zhuǎn)化為熱量，增加非戰(zhàn)栗產(chǎn)熱消耗能量[23-24]。通常情況下，機(jī)體的體溫調(diào)節(jié)依賴于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)控和外周效應(yīng)器的生熱作用。在研究酪氨酸和半胱氨酸聯(lián)合刺芒柄花素增強(qiáng)冷環(huán)境下小鼠肝臟產(chǎn)熱能力的作用機(jī)理方面，試驗(yàn)從效應(yīng)器著手，分析了肝臟產(chǎn)熱組織的產(chǎn)熱因子表達(dá)變化情況，研究發(fā)現(xiàn)，酪氨酸和半胱氨酸聯(lián)合刺芒柄花素可以激活肝臟組織內(nèi)UCP1 蛋白的表達(dá)，并最終促進(jìn)機(jī)體生熱。

4 結(jié)論

研究表明，日糧中補(bǔ)充氨基酸可以提高肝臟組織產(chǎn)熱的能力，對機(jī)體起到保護(hù)作用。冷暴露下酪氨酸和半胱氨酸聯(lián)合刺芒柄花素通過增強(qiáng)產(chǎn)熱因子PGC-1α、PPARγ 和UCP1 的表達(dá)水平，促進(jìn)小鼠肝臟產(chǎn)熱，促進(jìn)能量輸出，為提高畜禽的抗冷應(yīng)激能力提供一定的理論基礎(chǔ)。