豬流行性腹瀉病毒Nsp7 基因真核表達載體的構(gòu)建及表達

魏佳琪，高振秋，鄭亮，牛欣雨，武峰峰，吳春宇，王志昊，張華，曹宏偉，，

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院；3.鹽城師范學(xué)院）

豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的病毒性疾病，該病極具傳染性。PEDV 主要是引發(fā)腸道炎癥，對腸道造成損害，包括絨毛萎縮和脫落[1-2]。PEDV 為有囊膜的5’端加帽、3’端ploy（A）尾的單股正鏈RNA 病毒，是α 冠狀病毒家族中的一員，基因組核苷酸大約28 000 nt[3-4]。在PEDV 的基因組中，有三分之二的基因編碼非結(jié)構(gòu)蛋白，即復(fù)制酶蛋白1a 和1b。它們在自身編碼的剪切酶的作用下被剪切成16 個非結(jié)構(gòu)蛋白（Nsp1-Nsp16），這些非結(jié)構(gòu)蛋白在PEDV 復(fù)制、裝配和逃避宿主天然免疫中發(fā)揮重要的作用[5]。PEDV 編碼的23個病毒蛋白中，已被證實有11 個蛋白能夠拮抗干擾素的產(chǎn)生，從而逃避宿主天然免疫[6]。

PEDV Nsp7 蛋白分子量約為10 kDa，編碼83 個氨基酸，屬于疏水性蛋白質(zhì)。PEDV Nsp7 蛋白與病毒的復(fù)制以及病毒粒子的組裝有關(guān)[7-9]。研究發(fā)現(xiàn)，冠狀病毒Nsp7 可以抑制宿主天然免疫，拮抗IFN 免疫應(yīng)答[10]。冠狀病毒編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白在病毒RNA 的合成、加工以及病毒-宿主相互作用中發(fā)揮多種功能，其中Nsp7 至Nsp10 蛋白可以作為這些酶的關(guān)鍵輔助因子[11]。

到目前為止，關(guān)于冠狀病毒Nsp7 作用機制方面的研究報道較少，對于PEDV Nsp7 蛋白也是如此。為進一步研究PEDV Nsp7 蛋白的生物學(xué)功能，研究構(gòu)建了PEDV Nsp7 基因的真核表達質(zhì)粒，并通過Western Blot 及間接免疫熒光技術(shù)確定PEDV Nsp7蛋白在細胞中成功表達。研究為后續(xù)制備抗PEDV Nsp7 蛋白的多克隆抗體以及PEDV Nsp7 蛋白的生物學(xué)功能研究奠定了一定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細胞與質(zhì)粒

豬小腸上皮細胞（IPEC-J2）、人腎上皮細胞（HEK-293T）均保存于實驗室；胎牛血清（FBS）和DMEM 培養(yǎng)基購自Gibco 生物公司；質(zhì)粒pCMVMyc 由實驗室保存；感受態(tài)細胞DH5α 購自北京天根生物技術(shù)有限公司；患有PED 的仔豬病料采集于黑龍江省大慶市某豬場，并保存在實驗室-80 ℃冰箱。

1.2 主要試劑與抗體

MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶、PCR 試劑盒、限制性內(nèi)切酶、無縫克隆酶2×Seamless、M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶、ExTaq 熱啟動DNA 聚合酶購自Takara 公司；LipofectamineTM2000購自Invitrogen 公司；DNA 膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購于Omega 公司；基因特異性引物的合成及重組質(zhì)粒的序列測定均由擎科（北京）公司完成；小鼠抗Myc 標(biāo)簽單體克隆抗體（TA-01）購自碧云天生物技術(shù)有限公司；兔抗β-actin 單克隆抗體（ZM-0001）、HRP 標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG（ZB-2305）、HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG（ZB-2301）、FITC 標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG（ZB-0312）購自中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 引物的設(shè)計

以已經(jīng)發(fā)表在GenBank 網(wǎng)站中的PEDV 毒株基因序列為根據(jù)，利用軟件Primer 5.0 進行PEDV Nsp7基因上、下游引物設(shè)計。特異性上游引物序列：5′-GCCATGGAGGCCCGAATTCGGATGTCTAAACTGA -CTGATATTAAGTGTA-3′（包含EcoRⅠ酶切位點），特異性下游引物序列：5′-CGCGGCCGCGGTACCTCGAGAACTCTGCAACATA C TATTGTC ATTAA-3′（包含XhoⅠ酶切位點）。

1.4 PEDV Nsp7 基因的RT-PCR 擴增

將保存的病變豬小腸用液氮研磨，將其放于1.5 mL EP 管中，進行劇烈搖晃1 min 后靜止15 min，將EP 管放入冰盒中，加入200 μL 三氯甲烷，快速搖晃20 s 后靜置15 min。將低溫靜置后的EP 管置于轉(zhuǎn)速為12 000 r·min-1的4 ℃離心機中離心15 min。離心后取出EP 管，再將EP 管中的上清液轉(zhuǎn)移至空的EP 管中，向新的管中加入600 μL 異丙醇，輕輕搖晃，搖晃后靜置12 min。靜置結(jié)束，將EP管離心15 min，轉(zhuǎn)速為12 000 r·min-1。離心后取出EP 管，將管中的上清液舍棄，向管中加入由DEPC 水配制的75%乙醇溶液600 μL，靜置5 min。靜置后將EP 管4 ℃離心5 min，轉(zhuǎn)速為7 500 r·min-1。離心結(jié)束，取出EP 管，將上清液舍棄，繼續(xù)12 000 r·min-1離心1 min。棄取上清液，將其余液體吹干，去除酒精，加入20 μL DPEC 水進行溶解，溶解后靜置15 min，放入-80 ℃冰箱中保存。

RNA 提取完畢后，加入DEPC 水2 μL、Specific Primer（特異性下游引物）2 μL、Random Primer 1 μL、提取好的RNA 模板1 μL。PCR 條件為70 ℃10 min，共1 個循環(huán)。再向上述PCR 管中加入混合液：5×MMLV Buffer 2 μL、dNTP mix（10 mM）0.5 μL、RNase inhibitor 0.5 μL、M-MLV 1 μL、DEPC 水1 μL，PCR反應(yīng)過程為30 ℃保溫10 min，42 ℃保溫60 min，70 ℃保溫15 min，共1 個循環(huán)。得到含PEDV 全基因組的cDNA 溶液。

以得到的cDNA 為模板，加入模板1 μL、上游引物0.2 μL、下游引物0.2 μL、Buffer 3 μL、dNTP 2 μL、酶0.13 μL、ddH2O 13.47 μL，總反應(yīng)體系為20 μL。Nsp7 基因擴增反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，57.1 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共25 個循環(huán)；72 ℃保溫7 min。將所得到的PCR 產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，切下目的條帶，利用膠回收試劑盒對目的產(chǎn)物膠回收，在-20 ℃冰箱中保存。

1.5 Nsp7 基因真核表達載體的構(gòu)建及鑒定

將pCMV-Myc 載體使用EcoRⅠ與XhoⅠ進行雙酶切，酶切條件為37 ℃、2 h，然后將酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，隨后利用Omega 膠回收試劑盒將目的條帶進行膠回收。將切下的DNA 膠用700 μL Binding Buffer 溶解，條件為60 ℃、10 min。將溶解后的混合液倒入吸附柱中，轉(zhuǎn)速12 000 r·min-1離心1 min，重復(fù)該步驟一遍。離心結(jié)束后棄掉下管液體，向上管中加入300 μL Binding Buffer，繼續(xù)12 000 r·min-1離心1 min。棄下管液體，加入700 μL Wash Buffer于上管中，轉(zhuǎn)速12 000 r·min-1離心1 min，此過程重復(fù)1 次。丟棄下管液體，13 700 r·min-1離空2 min。離心后向上管加入30 μL 已經(jīng)加熱到60 ℃左右的去離子水，靜止溶解5 min，13 700 r·min-1離心2 min，得到純化后的基因片段和載體片段。

準(zhǔn)備PCR 管，放入兩種純化后的產(chǎn)物，同時加入無縫克隆酶2×Seamless、Buffer 和去離子水，總體系為10 μL，放入水浴鍋中，連接溫度為50 ℃，連接時間為15 min。產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α，平板涂布，培養(yǎng)箱培養(yǎng)10 h。挑取單菌落，在液體LB 培養(yǎng)基中37 ℃搖床培養(yǎng)10～12 h 后，將菌液進行PCR 鑒定。PCR 結(jié)果顯示，擴增出的條帶與目的基因大小相符，隨后用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，并將提取后的質(zhì)粒進行雙酶切鑒定。將鑒定成功的樣品送至公司進行測序，將測序結(jié)果與理論序列進行比對，結(jié)果證明重組質(zhì)粒正確構(gòu)建，可做后續(xù)實驗，將正確質(zhì)粒命名為pCMVMyc-Nsp7。

1.6 Western Blot 檢測

待IPEC-J2 細胞、HEK-293T 細胞密度為80%時，開始轉(zhuǎn)染。首先將質(zhì)粒在13 000 r·min-1轉(zhuǎn)速下離心10 min，達到除菌的目的。將細胞板中原有的培養(yǎng)基換成DMEM 培養(yǎng)基，放在細胞培養(yǎng)箱備用。將質(zhì)粒取出，根據(jù)質(zhì)粒的濃度計算加到24 孔細胞培養(yǎng)板中的體積。轉(zhuǎn)染空載體pCMV-Myc 質(zhì)粒和pCMVMyc-Nsp7 質(zhì)粒各800 ng，并設(shè)置空白對照。準(zhǔn)備兩個EP 管，管1 中加入50 μL DMEM 和800 ng 質(zhì)粒溶液。管2 中加入50 μL DMEM 和1 μL 脂質(zhì)體。靜置5 min 后，將兩管液體混合，再靜置20 min。靜置結(jié)束后，將混合液分別加入到24 孔板的細胞培養(yǎng)液中，放入37 ℃培養(yǎng)箱中，轉(zhuǎn)染4～6 h，換成500 μL 10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基。置于5% CO2培養(yǎng)箱中，37 ℃培養(yǎng)24 h，收取樣品。樣品收集：將轉(zhuǎn)染后的細胞培養(yǎng)板放置于冰盒上，棄掉培養(yǎng)液，用500 μL的PBS 洗滌2 次，在細胞板每孔中加入40 μL 的RIPA 裂解液，將細胞板放置于4 ℃裂解30 min，裂解工作完成后，將每孔中被裂解的細胞從細胞板上刮下，分別加入到1.5 mL 離心管中，在4 ℃離心機中12 000 r·min-1離心10 min，吸取上清，棄沉淀。加入10 μL 的5×Loading Buffer，最后把蛋白質(zhì)和染料煮沸10 min，使得蛋白完全發(fā)生變性，可直接進行電泳。跑膠：配置聚丙烯酰胺凝膠，等待膠凝固以后，組裝膠和電泳槽，在確定不漏的情況下倒入1×SDS電泳液，插上電極，分離蛋白樣品，將蛋白樣品煮沸10 min，12 000 r·min-1離心10 min。吸取10 μL 上層樣品點樣，設(shè)置電壓80 V，跑完上層膠，再把電壓改為120 V，當(dāng)目標(biāo)蛋白完全分離后，關(guān)閉電源。轉(zhuǎn)膜：將膠板撬開，按照條帶大小切下對應(yīng)膠條，切下的凝膠和濾紙放到轉(zhuǎn)膜液中，打開轉(zhuǎn)膜儀，底層鋪入浸泡過轉(zhuǎn)膜液的墊網(wǎng)，然后鋪上浸泡過的三層濾紙，在濾紙上淋加轉(zhuǎn)移液，驅(qū)趕濾紙下層氣泡。用鑷子將PVDF 膜平鋪在濾紙上，采用先中間再兩邊的鋪放辦法，避免氣泡的產(chǎn)生（膜要提前進行切角做標(biāo)記，以記住反正面），然后將膠輕輕的鋪放在PVDF 膜上，用手調(diào)整，使膠各邊緣與膜平齊，用玻璃棒趕出多余氣泡。再鋪一層濾紙及墊網(wǎng)，將轉(zhuǎn)膜夾合緊，放在轉(zhuǎn)膜槽中，將轉(zhuǎn)膜槽放入冰浴的轉(zhuǎn)膜盒中電壓200 V、電流100 mA，2 h 后將膠體取出（可以看到轉(zhuǎn)移到膜上的Marker）。封閉：將PVDF 膜放入0.5%的脫脂奶粉中，在搖床上封閉孵育2 h。封閉結(jié)束后，需要用1×TBST 溶液洗膜4 次，每次洗膜5 min。孵育抗體：按照說明書配置一抗和二抗，將PVDF 膜先后置于配置好的一抗和二抗中孵育，一抗孵育時間為2 h，1×TBST溶液洗膜2 h，洗膜時間為每次15 min；二抗孵育2 h，1×TBST 溶液洗膜2 h，洗膜時間為每次15 min。曝光：用AI600 儀器曝光，保存結(jié)果圖片。

1.7 間接免疫熒光

在細胞板中放入爬片，接種細胞，待細胞密度達到60%左右時，開始轉(zhuǎn)染，用Lipofectin2000 將pCMV-Myc 和pCMV-Myc-Nsp7 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至IPECJ2、HEK-293T 細胞中，4～6 h 后更換含有10%胎牛血清的DMEM 500 μL。在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h，取出細胞培養(yǎng)板，棄掉培養(yǎng)液，PBS 洗2 次；向24 孔細胞培養(yǎng)板中每孔加入500 μL 的4%多聚甲醛溶液，10 min 后棄掉溶液，加入PBS 清洗3 次，每次15 min，均放置于水平搖床上；棄掉PBS，加入500 μL的0.1%曲拉通溶液，靜置20 min，增加細胞膜的通透性；將曲拉通吸棄，用PBS 洗3 次，每次15 min。每孔加入500 μL 的5% BSA 溶液，靜置2 h 后加入PBS，搖床清洗細胞板，每次15 min，清洗3 次；然后用1%BSA 溶液稀釋特異性抗體，每孔加入500 μL，靜置孵育2 h，加入PBS 清洗細胞板；再加FITC 熒光標(biāo)記的二抗，室溫避光孵育2 h。回收二抗稀釋液，加入PBS，將細胞板放在搖床上清洗3 次，每次15 min，最后制片。制片操作如下：首先用鑷子取出干凈的載玻片，向載玻片上滴加少量DAPI 封片劑，然后挑出細胞爬片，放在封片劑中央，用干凈的紙巾輕輕壓在細胞爬片上，吸干多余的封片劑，避光放置30 min。待晾干后，黑暗條件下用激光顯微鏡觀察細胞的情況，最后拍照并保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-PCR 擴增Nsp7 基因全長序列

從病變豬小腸提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄出cDNA，利用設(shè)計的特異性Nsp7 的上、下游引物，并以cDNA為模板對目的基因進行PCR 擴增，所得目的條帶為252 bp 的PEDV Nsp7 基因片段，結(jié)果如圖1 所示。

圖1 Nsp7 基因片段的PCR 擴增Fig.1 PCR amplification of Nsp7 gene fragment

2.2 真核表達載體pCMV-Myc 雙酶切

為構(gòu)建PEDV Nsp7 基因的真核表達載體，試驗將利用EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ兩種限制性內(nèi)切酶對pCMV-Myc 載體進雙酶切，將酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，顯示真核表達載體雙酶切成功，結(jié)果如圖2 所示。

圖2 pCMV-Myc 載體的雙酶切Fig.2 Digestion of pCMV-Myc vector

2.3 重組質(zhì)粒pCMV-Myc-Nsp7 的鑒定

利用無縫克隆酶2×Seamless 將目的基因和載體的酶切產(chǎn)物進行連接，連接產(chǎn)物用感受態(tài)DH5α 轉(zhuǎn)化，過夜培養(yǎng)，挑取單菌落擴大培養(yǎng)，37 ℃搖床10～12 h，對其進行菌液PCR 鑒定，瓊脂糖凝膠電泳后在250 bp 附近出現(xiàn)明亮單一的條帶，結(jié)果如圖3 所示。菌液鑒定成功后，提取質(zhì)粒，進行雙酶切鑒定。酶切體系：EcoRⅠ1 μL、XhoⅠ1 μL、10×H Buffer 1 μL、質(zhì)粒2 μL、去離子水5 μL，總體系10 μL，置于37 ℃水浴鍋中2 h。雙酶切產(chǎn)物電泳后在3 000 bp 和250 bp附近出現(xiàn)兩條條帶，得到試驗條帶與預(yù)期理論設(shè)計結(jié)果相符，結(jié)果如圖4 所示。結(jié)果均顯示重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，將其命名為pCMV-Myc-Nsp7。

圖3 重組質(zhì)粒pCMV-Myc-Nsp7 的菌液PCR 鑒定Fig.3 Identification of recombinant plasmid pCMV-Myc-Nsp7 by PCR

圖4 重組質(zhì)粒pCMV-Myc-Nsp7 的雙酶切鑒定Fig.4 Double enzyme digestion identification of recombinant plasmid pCMV-Myc-Nsp7

2.4 重組質(zhì)粒pCMV-Myc-Nsp7 的測序及其序列分析

為比較構(gòu)建的重組質(zhì)粒與原始Nsp7 基因序列的同源性，將篩選的陽性重組質(zhì)粒pCMV-Myc-Nsp7取10 μL 送至生物公司進行測序。將NCBI 網(wǎng)站上的PEDV Nsp7 基因序列與所得到的測序結(jié)果進行序列比對，最終結(jié)果顯示，其同源性高達99%，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。序列比對結(jié)果如圖5 所示。

圖5 pCMV-Myc-Nsp7 與CV777 毒株Nsp7 基因序列比對Fig.5 Sequence alignment between pCMV-Myc-Nsp7 and CV777 strain Nsp7

2.5 重組質(zhì)粒的Western Blot 鑒定

為檢測重組質(zhì)粒pCMV-Myc-Nsp7 在細胞中的表達情況，將重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至HEK-293T 細胞、IPEC-J2 細胞中，先后利用鼠抗Myc 單抗及山羊抗小鼠熒光二抗標(biāo)記，檢測空載體pCMV-Myc 及重組表達載體pCMV-Myc-Nsp7 的表達情況。Western Blot 結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒pCMV-Myc-Nsp7 在IPEC-J2 細胞、HEK-293T 細胞均能夠成功表達，結(jié)果如圖6 表示。

圖6 Western Blot 鑒定蛋白融合表達Fig.6 Identification of fusion protein expression by Western Blot

2.6 重組蛋白Nsp7 的免疫熒光鑒定

研究以間接免疫熒光技術(shù)探究了pCMV-Myc-Nsp7 在IPEC-J2 細胞和HEK-293T 細胞中的分布情況。免疫熒光結(jié)果顯示，重組表達載體pCMVMyc-Nsp7 質(zhì)粒在IPEC-J2 細胞和HEK-293T 細胞中成功表達，結(jié)果如圖7 所示。

圖7 重組蛋白Nsp7 在細胞中表達的免疫熒光鑒定Fig.7 Immunofluorescence identification of recombinant protein Nsp7 expression in cells

3 討論

豬腸道冠狀病毒（SECoV）包括豬流行性腹瀉病毒（PEDV），傳染性胃腸炎病毒（TGEV）和豬δ 型冠狀病毒（PDCoV），占新生豬致命性水樣腹瀉的大部分，并給世界帶來重大的經(jīng)濟和公共衛(wèi)生負擔(dān)。冠狀病毒感染的共同特征是逆轉(zhuǎn)宿主細胞周期，以促進病毒復(fù)制，但具體機制在很大程度上仍未知。雖然這三種SECoV 主要感染體內(nèi)腸上皮，并引起相似的臨床體征，但其細胞向性和致病性存在明顯差異[12]。PEDV 最初在20 世紀(jì)70 年代報道，導(dǎo)致新生仔豬死亡率最高。主要表現(xiàn)為嘔吐、腹瀉、厭食、消瘦，年齡越小，癥狀則越為明顯，對養(yǎng)殖業(yè)以及畜牧業(yè)造成巨大的威脅。該病在英國被首次發(fā)現(xiàn)，與豬胃腸炎病癥狀極為相似，給豬進行診斷和治療帶來了極大的困難[13-14]。而兩者主要區(qū)別是豬流行性腹瀉主要針對于幼豬，對幼豬威脅較大，對成年豬而言，癥狀較輕，不致死[15-16]。自豬流行性腹瀉在歐洲多個國家爆發(fā)以來，使得農(nóng)場中豬的產(chǎn)量直線下降，造成了非常大的影響[17]。在PEDV 流行期間，不同的出版物引用了與PEDV 快速傳播相關(guān)的幾個風(fēng)險因素（動物運動，卡車污染，屠宰場污染，受污染的飼料和飼料廠，以及農(nóng)場員工等），控制PEDV 感染最有效的途徑之一是接種疫苗[18]。

豬流行性腹瀉病毒核酸型為RNA，編碼的5 種結(jié)構(gòu)蛋白為S 蛋白、E 蛋白、M 蛋白、N 蛋白、ORF3蛋白，其中ORF3 蛋白是其唯一編碼的輔助性蛋白。該病毒還編碼非結(jié)構(gòu)蛋白，即Nsp1-Nsp16。這些非結(jié)構(gòu)蛋白在病毒復(fù)制、裝配、拮抗天然宿主免疫中發(fā)揮重要的作用?，F(xiàn)在關(guān)于PEDV 編碼的各種蛋白的表達及生物學(xué)功能研究的文獻相對較少。有研究表明，CoV 的Nsp7 蛋白是相對保守的，由于蛋白構(gòu)象的緣故，發(fā)揮功能時可能受到Nsp8 的影響，或是與Nsp8相互作用[17]。但在PEDV 中，Nsp7 抑制干擾素的產(chǎn)生，與Nsp8 無關(guān)[19]。豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）的Nsp7 在病毒組裝過程中發(fā)揮重要作用，其定位在細胞質(zhì)，下調(diào)豬小腸上皮細胞中IL-8 的表達[20]。豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）的Nsp7 在誘導(dǎo)宿主體液免疫應(yīng)答中起重要作用[21]。在SARS-CoV-2 中，Nsp7、Nsp8 和Nsp12 為RNA 轉(zhuǎn)錄復(fù)合物（RTC）的三個組分，負責(zé)識別和處理RNA，用于新病毒的繁殖和病毒蛋白的核糖體轉(zhuǎn)錄[22]。

Nsp7 在病毒生命周期中發(fā)揮重要作用，由于與已知結(jié)構(gòu)的同源性非常低，導(dǎo)致對Nsp7 的功能和結(jié)構(gòu)機制知之甚少。為探討Nsp7 蛋白功能，研究利用基因克隆技術(shù)構(gòu)建了pCMV-Myc-Nsp7 真核表達載體，并驗證Nsp7 蛋白在細胞中能正常表達，為豬流行性腹瀉病毒Nsp7 蛋白的功能研究奠定了良好的基礎(chǔ)。