BVDV 非結(jié)構(gòu)蛋白NS4B 的結(jié)構(gòu)分析及其蛋白表達(dá)與鑒定

柳凱月，董亞尊，吳雙雙，馬一瑄，劉鴻雁，王北艷，于立權(quán)，宋佰芬，馬金柱

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院）

牛病毒性腹瀉病毒（Bovine Viral Diarrhea Virus，BVDV）為黃病毒科瘟病毒屬的成員[1]，是牛病毒性腹瀉病的病原，會(huì)引起牛的流產(chǎn)、先天性缺陷、腸炎、呼吸系統(tǒng)疾病、不孕癥和乳房炎等癥狀[2-6]。BVDV 傳染性極強(qiáng)，呈世界性流行，嚴(yán)重阻礙了農(nóng)場(chǎng)養(yǎng)殖業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展，給各個(gè)國(guó)家的養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

BVDV 是單股正鏈RNA 病毒，全基因組長(zhǎng)約12.4 kb，共編碼11 種蛋白，包括4 種結(jié)構(gòu)蛋白和7種非結(jié)構(gòu)蛋白。NS4B 是BVDV 編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白之一。研究表明[7-8]，NS4B 是誘導(dǎo)膜交替的完整膜蛋白，可作為形成病毒復(fù)制復(fù)合物的支架[7-8]。BVDV NS4B蛋白顯著抑制RIG-I 樣受體（RLR）介導(dǎo)的干擾素-β（IFN-β）啟動(dòng)子活性和內(nèi)源性MDA5 mRNA 水平，BVDV NS4B 蛋白直接與MDA5 的N 末端CARD 相互作用，定位于細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮免疫抑制功能[9]。此外，NS4B 蛋白能顯著抑制RIG-I 或Cardif 誘導(dǎo)的IFNβ 啟動(dòng)子的激活，而STING 誘導(dǎo)的IFN-β 激活則被NS4B 蛋白抑制，這表明NS4B 蛋白在幫助BVDV 逃逸宿主免疫方面，也發(fā)揮著重要的作用[10]。

目前為止，關(guān)于牛病毒性腹瀉病毒NS4B 作用機(jī)制的研究報(bào)道較少。對(duì)BVDV ns4b 基因進(jìn)行了結(jié)構(gòu)分析，該序列全長(zhǎng)為1 041 bp，可編碼347 個(gè)氨基酸，且編碼的蛋白是疏水性的穩(wěn)定蛋白。同時(shí)成功克隆出BVDV ns4b 基因全長(zhǎng)序列，構(gòu)建了p3×Flag-CMV10-ns4b 真核表達(dá)載體，并在HEK-293T 細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。實(shí)驗(yàn)為后續(xù)研究BVDV NS4B 蛋白在抗病毒反應(yīng)中所發(fā)揮的作用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 生物信息學(xué)分析軟件

使用 Prot-Param 在線分析軟件分析 BVDV ns4b 基因編碼的氨基酸組成、理論分子質(zhì)量、等電點(diǎn)等基本理化性質(zhì)；利用在線分析工具TExpasy 對(duì)BVDV NS4B 蛋白進(jìn)行親疏水性分析；采用SignalP-4.1 程序?qū)Φ鞍踪|(zhì)進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)；用SOPMA 在線程序?qū)VDV NS4B 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)；通過(guò)SWISS MODEL 程序?qū)VDV NS4B 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

1.2 材料

PCR 試劑、內(nèi)切酶（NotⅠ和XbaⅠ）購(gòu)于New England Biolabs 公司；大腸桿菌（Escherichia coli，E.Coli）感受態(tài)細(xì)胞DH5α 購(gòu)于上海唯地生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒購(gòu)于Omega 公司；pcDNA3.1-ns4b 重組質(zhì)粒由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院朱戰(zhàn)波教授惠贈(zèng)；T4 連接酶購(gòu)于TaKaRa 公司；p3×Flag-CMV10 載體質(zhì)粒購(gòu)于長(zhǎng)春庫(kù)美生物公司；LB 培養(yǎng)基購(gòu)于海博生物公司；DMEM（Dulbecco’s Modified Eagle Medium）高糖培養(yǎng)基、青霉素鏈霉素混合液購(gòu)于美國(guó)HyClone公司；胰蛋白酶-EDTA（0.25%）購(gòu)于美國(guó)Gibco 公司；胎牛血清購(gòu)于浙江天杭生物科技有限公司；Ultra－Fection 3.0 高效轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)于北京四正柏生物公司；鼠源Flag 抗體、鼠源β-actin 抗體購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG購(gòu)于Cell Signaling Technology 公司；ECL 顯影液購(gòu)于Biosharp 公司；HEK-293T 細(xì)胞由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院免疫制劑與分子免疫實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 目的基因獲得

根據(jù)GenBank 上提供的BVDV ns4b 基因序列（登錄號(hào)：NP_776269.1）設(shè)計(jì)特異性引物，并分別在上下游引物的5′端添加NotⅠ和XbaⅠ的酶切位點(diǎn)和保護(hù)性堿基，上游引物序列：5′-CCCGCGGCCGCTGCGTCGGGTGACGTGGAAAAAATC-3′（下劃線為NotⅠ酶切位點(diǎn)），下游引物序列：5′-CCGGCTCTAGAGCCAGGTTCCTTATTTTCCCTTGTGAGTCC-3′（下劃線為XbaⅠ酶切位點(diǎn)），引物由長(zhǎng)春庫(kù)美生物公司合成。以pcDNA3.1-ns4b 重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)體系20 μL：5×Q5 Reaction Buffer 4 μL，2 mM dNTPs 2 μL，上下游引物（10 μmol·L-1）各1 μL，模板1 μL，Q5 High-Fidelity DNA polymerase 0.5 μL，ddH2O 11.5 μL。PCR 反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性4 min，96 ℃變性30 s，66 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35 個(gè)循環(huán)，72 ℃終止10 min。獲得的目的基因ns4b PCR 產(chǎn)物置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 重組表達(dá)載體構(gòu)建與鑒定

將獲得的PCR 產(chǎn)物和p3×Flag-CMV10 表達(dá)載體分別用NotⅠ和XbaⅠ進(jìn)行雙酶切，酶切條件是37 ℃、2 h。載體酶切體系組成：10×buffer 2 μL、NotⅠ內(nèi)切酶0.5 μL、Xba Ⅰ內(nèi)切酶0.5 μL、p3×Flag-CMV10 1 μg、去離子水加至20 μL。目的片段酶切體系組成：10×buffer 2 μL、NotⅠ內(nèi)切酶0.5 μL、XbaⅠ內(nèi)切酶0.5 μL、ns4b 1 μg、去離子水加至20 μL。純化后的酶切載體和目的片段采用T4 連接酶在恒溫器中16 ℃過(guò)夜連接。連接體系組成：T4 連接酶1 μL、10×buffer 1 μL 載體50 ng、目的片段37.5 ng、去離子水加至10 μL，最后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中并涂布在含有氨芐抗性的LB 固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h。挑取大小飽滿的單一菌落，于37 ℃搖床培養(yǎng)8～12 h 后，用Omega 試劑盒按照操作說(shuō)明書(shū)提取質(zhì)粒，并采用PCR 擴(kuò)增和酶切的方法驗(yàn)證獲得的重組質(zhì)粒是否正確。PCR 擴(kuò)增方法如上所述。重組質(zhì)粒酶切體系：NotⅠ內(nèi)切酶0.5 μL、XbaⅠ內(nèi)切酶0.5 μL、重組質(zhì)粒1 μg、10×buffer 2 μL、去離子水加至20 μL。酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，將驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒郵寄長(zhǎng)春庫(kù)美公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果正確的質(zhì)粒命名為p3×Flag-CMV10-ns4b。

1.5 HEK-293T 細(xì)胞培養(yǎng)

從液氮罐中取出HEK-293T 細(xì)胞，在37 ℃水浴鍋中輕輕晃動(dòng)至細(xì)胞融化，將細(xì)胞液轉(zhuǎn)移至5 ml DMEM 高糖培養(yǎng)基中，室溫下1 000 rpm 離心5 min。離心后，棄去上清，用5 ml 含10%胎牛血清和1%青霉素鏈霉素混合液的DMEM 高糖培養(yǎng)基吹懸細(xì)胞團(tuán)，置于T25 細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，于5 % CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)至培養(yǎng)瓶底部80%～90%融合度，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)、傳代及凍存。

1.6 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK-293T 細(xì)胞

將HEK-293T 細(xì)胞以5×104cell·mL-1的密度鋪板在24 孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞長(zhǎng)至培養(yǎng)孔底部70%左右融合度時(shí)，用UltraFection 3.0 試劑轉(zhuǎn)染。首先棄掉培養(yǎng)基，每孔加入500 μL 新鮮的DMEM 培養(yǎng)基饑餓處理細(xì)胞30 min，期間準(zhǔn)備UltraFection 3.0/DNA復(fù)合物：將0.5 μg p3×Flag-CMV10-ns4b 和0.5 μg p3×Flag-CMV10 質(zhì)粒分別加入至 25 μL 的無(wú)血清培養(yǎng)基中，漩渦震蕩混勻；將1.5 μL UltraFection 3.0試劑加入至25 μL 無(wú)血清培養(yǎng)基中，旋渦震蕩混勻；將后者加入前者中，漩渦震蕩混勻10 s，室溫下孵育10 min，最后將上述Ult-raFection 3.0/DNA 混合物加入每孔中，輕柔晃動(dòng)使其分散均勻，37 ℃培養(yǎng)6 h 后更換新鮮的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)18 h。

1.7 Western blot 鑒定目的蛋白表達(dá)

制取蛋白樣品：棄掉原有的完全培養(yǎng)基，用提前預(yù)冷的PBS 清洗細(xì)胞3 次，將細(xì)胞培養(yǎng)板置于冰上，向每孔中加入RIPA 裂解液50 μL 裂解細(xì)胞30 min。裂解完成后，4 ℃條件下12 000 g 離心10 min，收集上清裂解液，經(jīng)BCA 試劑盒蛋白定量后，加入6×Loading Buffer，100 ℃沸水浴處理10 min，隨后12 000 g離心5 min。蛋白采用5%濃縮膠和10%分離膠進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，結(jié)束后將凝膠濕轉(zhuǎn)NC 膜。轉(zhuǎn)膜條件：電壓100 V，時(shí)間42 min。將NC 膜放入3% BSA封閉液中室溫下孵育2 h。洗膜之后，采用鼠源Flag抗體（1∶2 000）和鼠源β-actin 抗體（1∶2 000）分別4度過(guò)夜孵育，之后，用羊抗小鼠辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記IgG（1∶3 000）抗體室溫孵育2 h，每次孵育結(jié)束后用1×TBST 洗膜3 次，每次10 min，最后顯影曝光，保存結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 BVDV NS4B 的結(jié)構(gòu)分析

2.1.1 BVDV ns4b 編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)預(yù)測(cè)及分析

預(yù)測(cè)和分析BVDV ns4b 編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，結(jié)果顯示，該蛋白質(zhì)的原子數(shù)是5 458，分子式為C1748H2752N444O505S9；分子量為38.4 kDa；理論等電點(diǎn)為7.95；含有347 個(gè)氨基酸，帶正電荷（Arg+Lys）的氨基酸殘基總數(shù)為37，帶負(fù)電荷（Asp+Glu）的氨基酸殘基總數(shù)為36；脂肪指數(shù)為98.16；不穩(wěn)定指數(shù)為31.51，屬于穩(wěn)定性蛋白。

2.1.2 蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)

運(yùn)用SignalP-4.1 程序預(yù)測(cè)BVDV ns4b 氨基酸序列，結(jié)果顯示，NS4B 蛋白不存在信號(hào)肽，因此推測(cè)，該蛋白不屬于分泌蛋白（圖1）。

圖1 BVDV NS4B 蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)Fig.1 Signal peptide prediction of BVDV NS4B

2.1.3 BVDV NS4B 蛋白親疏水性預(yù)測(cè)

運(yùn)用ExPASY 工具里面的ProtScale 對(duì)BVDV ns4b的氨基酸序列進(jìn)行親疏水性分析，結(jié)果顯示，BVDV NS4B 蛋白氨基酸序列最低分值是-2.767（位于第132 位氨基酸），親水性最強(qiáng)，最高分值是2.422（位于第285 位氨基酸），疏水性最強(qiáng)。總體看來(lái)，該蛋白整條肽鏈大部分為疏水區(qū)域，表現(xiàn)為疏水性，因此，BVDV NS4B 蛋白是疏水性蛋白（圖2）。

圖2 BVDV NS4B 蛋白親疏水性預(yù)測(cè)Fig.2 Hydrophobicity prediction of BVDV NS4B

2.1.4 BVDV NS4B 蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)

利用Netphos 3.1 Server 在線軟件對(duì)該蛋白磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，結(jié)果顯示，BVDV NS4B 蛋白有49 個(gè)位點(diǎn)可能會(huì)被磷酸化（圖3）。

2.1.5 BVDV NS4B 蛋白糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)

利用NetNGlyc 1.0 對(duì)BVDV NS4B 蛋白糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)分析，結(jié)果顯示，NS4B 蛋白存在6 個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，分別位于第57、120、155、158、255 和277位氨基酸處（圖4）。

圖4 BVDV NS4B 蛋白N-糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)Fig.4 N-glycosylation site prediction of BVDV NS4B protein

2.1.6 BVDV NS4B 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

運(yùn)用SOPMA 在線程序?qū)VDV NS4B 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，BVDV NS4B 的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要為α-螺旋（66.57%），其余還有無(wú)規(guī)則卷曲（17.29%）、延伸（10.66%）和β-轉(zhuǎn)角（5.48%）（圖5）。

圖5 BVDV NS4B 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.5 Secondary structure prediction of BVDV NS4B

2.1.7 BVDV NS4B 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

通過(guò)SWISS MODEL 程序?qū)VDV NS4B 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，NS4B 蛋白含有α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲等復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，與其二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果一致（圖6）。

圖6 BVDV NS4B 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.6 Tertiary structure prediction of BVDV NS4B

2.2 目的基因擴(kuò)增結(jié)果

利用特異性引物進(jìn)行BVDV ns4b 基因擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR 產(chǎn)物，在1 000 bp 處左右出現(xiàn)明顯條帶，結(jié)果與預(yù)期基因片段大小相符，表明目的基因擴(kuò)增正確（圖7）。

圖7 BVDV 的ns4b 基因PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.7 PCR products of ns4b gene of BVDV

2.3 表達(dá)載體構(gòu)建及驗(yàn)證

2.3.1 PCR 方法鑒定

利用獲得的重組質(zhì)粒p3×Flag-CMV10-ns4b 為模板進(jìn)行PCR 鑒定，結(jié)果顯示在1 000 bp 左右有明顯條帶，擴(kuò)增片段大小與預(yù)期相符，表明重組質(zhì)粒p3×Flag-CMV10-ns4b 構(gòu)建正確（圖8）。

圖8 重組質(zhì)粒p3×Flag-CMV10-ns4b 的PCR 鑒定Fig.8 PCR identification of recombinant plasmid p3×Flag-CMV10-ns4b

2.3.2 酶切鑒定

用NotⅠ、XbaⅠ內(nèi)切酶進(jìn)一步驗(yàn)證PCR 方法鑒定正確的重組表達(dá)質(zhì)粒p3×Flag-CMV10-ns4b，酶切產(chǎn)物經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果如圖3 所示，分別在6 400 bp 和1 000 bp 處左右出現(xiàn)了明顯條帶，大小與目的片段1 041 bp 相符，表明重組質(zhì)粒p3×Flag-CMV10-ns4b 構(gòu)建正確（圖9）。

圖9 重組質(zhì)粒p3×Flag-CMV10-ns4b 酶切鑒定Fig.9 Digestion identification of recombinant plasmid p3×Flag-CMV10-ns4b

2.3.3 重組表達(dá)載體序列比對(duì)分析

將上述鑒定正確的p3×Flag-CMV10-ns4b 重組質(zhì)粒郵寄庫(kù)美生物公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI Blast 比對(duì)分析，結(jié)果顯示，測(cè)序結(jié)果與目的基因序列一致，與NCBI 上公布的BVDV NADL 株同源性為100%，表明重組表達(dá)載體p3×Flag-CMV10-ns4b 構(gòu)建成功（圖10）。

圖10 p3×Flag-CMV10-ns4b 與BVDV NADL株ns4b 序列比對(duì)Fig.10 Sequence comparison between p3×Flag-CMV10-ns4b and ns4b of BVDV NADL strain

2.4 Western blot 檢測(cè)目的蛋白表達(dá)

利用Western blot 方法，檢測(cè)重組質(zhì)粒p3×Flag-CMV10-ns4b 在HEK-293T 細(xì)胞中的表達(dá)情況，先后利用鼠源抗Flag 標(biāo)簽抗體與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG 孵育，檢測(cè)NS4B 蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示在38.4 kDa 處出現(xiàn)明顯條帶，與預(yù)期蛋白大小相符。表明重組質(zhì)粒p3×Flag-CMV10-ns4b 在HEK-293T 細(xì)胞中成功表達(dá)（圖11）。

圖11 Western blot 鑒定目的蛋白表達(dá)Fig.11 Identification of target protein expression by western blot

3 討論

1946 年，美國(guó)紐約州的Olafson 等[11]首次發(fā)現(xiàn)BVDV，隨后在各個(gè)國(guó)家被陸續(xù)報(bào)道。1980 年，李佑民等[12]分離出1 株與國(guó)外報(bào)道相同的BVDV，這是我國(guó)首次報(bào)道該病毒，并命名為184V 株。此后，此病毒正式傳入我國(guó)，在我國(guó)牛群中廣泛流傳。近年來(lái)，牛病毒性腹瀉病/黏膜?。˙ovine Viral Diarrhea-mucosal disease，BVD-MD）在北京、河北、江蘇等20 多個(gè)省、市和自治區(qū)均有報(bào)道，并有多個(gè)省份血清陽(yáng)性率有逐年上升的趨勢(shì)[13]。

按照BVDV 分離培養(yǎng)過(guò)程中能否穩(wěn)定繁殖并引起細(xì)胞病變，BVDV 可以分為致細(xì)胞病變型（CP）和非致細(xì)胞病變型（NCP）兩種生物型[14]。依據(jù)BVDV 的全基因組5′端非翻譯區(qū)核酸序列（5′-UTR）和抗原性的不同，國(guó)際病毒分類(lèi)委員會(huì)將BVDV 分為2 種基因型，即BVDV-Ⅰ型和BVDV-Ⅱ型[15]。如今，我國(guó)牛群最主要感染的為BVDV-Ⅰ型，北美洲、西班牙主要流行BVDV-Ⅱ型[16]。BVDV 基因組含有一個(gè)大的開(kāi)放閱讀框（Open Reading Frame，ORF），該蛋白前體能夠大概形成11 種成熟的蛋白質(zhì)，它們?cè)谡麄€(gè)基因組上的排列為（從N 端到C 端）NH2-Npro-capsid-Erns-E1-E2-P7 -NS2 -NS3 -NS4A -NS4B -NS5A -NS5B-COOH，其 中，Npro、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B 為非結(jié)構(gòu)蛋白，其他為結(jié)構(gòu)蛋白，參與BVDV 囊膜和外殼[17-18]的組成。隨著對(duì)BVDV 基因組結(jié)構(gòu)以及功能研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)BVDV 的非結(jié)構(gòu)蛋白參與病毒的形成，在誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生天然免疫方面發(fā)揮重要作用[19-24]。近幾年，有研究表明BVDV 基因組編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白NS4B 能夠介導(dǎo)細(xì)胞膜重排的過(guò)程[25]。NS4B 蛋白在CP 型和NCP 型兩種生物型病毒之間的定位沒(méi)有差異，NS4B 蛋白對(duì)病毒的復(fù)制起著重要的作用，若BVDV NS4B 區(qū)域中第15 位密碼子從酪氨酸突變?yōu)榘氚彼?，可使CP 型的BVDV 轉(zhuǎn)化為NCP 型的BVDV，表明NS4B 蛋白參與BVDV逃逸宿主免疫，這表明此位氨基酸突變是研究BVDV疫苗的一個(gè)新作用靶點(diǎn)。因此，BVDV NS4B 重組質(zhì)粒的構(gòu)建對(duì)后續(xù)的功能研究具有重要的作用。

由于NS4B 蛋白在BVDV 形成和抗宿主免疫過(guò)程發(fā)揮重要作用，因此，采用Prot-Param、TExpasy、SignalP-4.1 等生物信息學(xué)軟件對(duì)BVDV ns4b 的理化性質(zhì)以及蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測(cè)和分析，結(jié)果表明BVDV NS4B 是含有347 個(gè)氨基酸的穩(wěn)定性蛋白，不是分泌性蛋白；NS4B 蛋白有6 個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，整條肽鏈大部分為疏水區(qū)域，表現(xiàn)為疏水性蛋白；NS4B蛋白是多磷酸化蛋白，具有49 個(gè)磷酸化位點(diǎn)，提示這些磷酸化位點(diǎn)可能參與BVDV 與宿主代謝的調(diào)控過(guò)程。另外，NS4B 蛋白結(jié)構(gòu)較復(fù)雜，主要由α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)組成。上述這些分析結(jié)果為進(jìn)一步研究BVDV NS4B 蛋白的特性與生物學(xué)功能提供了參考。此外，研究通過(guò)PCR 的方法獲得BVDV ns4b 基因，將目的基因ns4b 插入到真核表達(dá)載體p3×Flag-CMV10 中，成功構(gòu)建了重組表達(dá)載體p3×Flag-CMV10-ns4b，并將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HEK-293T 細(xì)胞中，Western blot 結(jié)果表明，p3×Flag-CMV10-ns4b 能夠在細(xì)胞中表達(dá)NS4B 蛋白，大小為38.4 kDa，與預(yù)期大小相符，表明p3×Flag-CMV10-ns4b 在HEK-293T 細(xì)胞中能夠成功表達(dá)。為今后研究NS4B 蛋白在BVDV 形成和抗宿主免疫反應(yīng)中的作用奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)對(duì)進(jìn)一步預(yù)防BVDV 感染具有重要意義。