李藝璇,牛靜軼,李 港,萬 超,方仁東,葉 超

(西南大學動物醫(yī)學院 動物健康與動物性食品安全國際合作聯(lián)合實驗室,重慶 400715)

偽狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)是導致動物患偽狂犬病或奧葉茲基氏病的感染性致病因子,它能感染多種家畜以及野生動物,從而引發(fā)偽狂犬病。豬是PRV的自然宿主,感染PRV會導致豬的致死性腦炎、呼吸障礙、母豬繁殖障礙和新生仔豬的高死亡率。PRV的致病性還與其潛伏感染的特性有密切聯(lián)系,初次感染時病毒的基因組可在神經(jīng)元內(nèi)建立潛伏感染,在應激刺激后,病毒可以被重新激活并產(chǎn)生裂解感染[1]。由于其具有較強的致病性以及潛伏感染的特性,PRV在世界范圍內(nèi)給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。

PRV的學名是豬皰疹病毒1型,屬于皰疹病毒科,甲型皰疹病毒亞科,水痘病毒屬。PRV包含一個約143 kb的雙鏈DNA基因組,由長獨特區(qū) (unique long region, UL)、短獨特區(qū) (unique short region, US)、末端重復序列 (terminal repeat, TR) 以及內(nèi)部重復序列 (internal repeat, IR) 組成,至少包含72個基因[2-4]。成熟的病毒粒子從內(nèi)而外依次由基因組DNA、衣殼、內(nèi)膜蛋白層和囊膜組成。內(nèi)膜蛋白層是皰疹病毒特有的蛋白質(zhì)層,位于囊膜和核衣殼之間,是連接病毒衣殼和囊膜的重要間質(zhì),因此又稱為被膜蛋白或間質(zhì)蛋白[5-7]。PRV編碼至少18種內(nèi)膜蛋白基因,分別為US2、US3、UL13、UL7、UL11、UL14、UL16、UL21、UL23、UL36、UL37、UL41、UL46、UL47、UL48、UL49、UL50、UL51;其中,UL13、UL21、UL36、UL37、UL7、UL11、UL14、UL16、UL50、UL51為病毒的核心基因,在皰疹病毒科成員中高度保守,其編碼的蛋白質(zhì)參與皰疹病毒復制的基本過程;而US2、US3、UL23、UL41、UL46、UL47、UL48、UL49為病毒非核心基因,也可在PRV感染和復制過程中起重要調(diào)控作用[8-9]。作為皰疹病毒的一種獨特結構,目前研究表明內(nèi)膜蛋白在病毒生命周期的多個方面發(fā)揮著重要作用,包括參與核衣殼移位到細胞核、病毒粒子組裝[10-11]、病毒入侵和病毒粒子形態(tài)形成過程以及宿主先天免疫的調(diào)節(jié)等[12-13]。

1 核心基因編碼內(nèi)膜蛋白的生物學功能

1.1 pUL13的生物學功能

軸突轉(zhuǎn)運對于神經(jīng)侵入性皰疹病毒在外周神經(jīng)節(jié)中成功建立感染(逆行運輸)以及病毒隨后從潛伏期重新激活后擴散到暴露的體表(順行轉(zhuǎn)運)至關重要。pUL13作為內(nèi)膜蛋白中重要的蛋白激酶,也是病毒軸突轉(zhuǎn)運的潛在調(diào)節(jié)因子。通過對UL13和US3雙基因突變病毒在背根神經(jīng)節(jié) (dorsal root ganglion, DRG) 神經(jīng)元上復制情況進行研究,發(fā)現(xiàn)突變病毒感染后新組裝的衣殼逆行運輸明顯增多,這阻止了衣殼被有效地遞送到遠端軸突[14],表明病毒蛋白激酶pUL13和pUS3能促進病毒衣殼向軸突遠端的運輸,因此缺失UL13的PRV與野生型相比病毒滴度會有所降低。另外,研究表明單純皰疹病毒1型(herpes simplex virus type 1, HSV-1)的US3具有調(diào)控UL31和UL34在核周定位的作用,而pUL13能夠使US3磷酸化,進而控制UL31和UL34在核周邊相互作用形成復合物,該復合物可進一步介導病毒核衣殼從核內(nèi)轉(zhuǎn)運到胞質(zhì)的過程,因此UL13在HSV-1病毒出核中發(fā)揮重要作用[15]。類似的,單純皰疹病毒2型(herpes simplex virus type 2, HSV-2)的UL13基因單獨也可以引起核纖層蛋白A和C的構象變化,并使核纖層蛋白B1從核邊緣重新分布到核內(nèi)顆粒結構中。此外,HSV-2UL13在體外直接磷酸化核纖層蛋白A、C和B1,HSV-2感染也發(fā)現(xiàn)了UL13單獨表達時導致的核纖層蛋白改變,表明HSV-2UL13能通過改變核纖層蛋白從而允許病毒出核[16]。研究人員通過CRISPR/Cas9技術在PRV的UL13基因上插入用于融合表達的eGFP標簽構建PRV UL13-eGFP病毒,然后通過試驗觀察到在病毒增殖過程中,融合蛋白UL13-eGFP聚集在核衣殼附近,證明pUL13也可能參與PRV的出核[17]。

pUL13 還參與調(diào)控宿主天然免疫,其可通過抑制轉(zhuǎn)錄因子核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)的活化來抑制RIG-I和MDA5的表達,從而作為RIG-I樣受體 (RIG-I like receptors, RLR) 介導的抗病毒反應的拮抗劑。具體表現(xiàn)為過表達pUL13會顯著抑制RIG-I和MDA5的mRNA和蛋白質(zhì)水平,進而抑制RIG-I或MDA5介導的免疫反應[18]。此外,豬源CCHC型鋅指蛋白3 (CCHC-type zinc finger protein 3, ZCCHC3) 是一種抗病毒分子,可與RIG-I和cGAS相互作用以調(diào)節(jié)針對病毒感染的先天免疫信號傳導,而PRV編碼的pUL13和pUL24蛋白能夠抑制ZCCHC3的表達,從而拮抗ZCCHC3的抗病毒作用[19]。

pUL13還能夠通過調(diào)控干擾素基因刺激因子 (stimulator of interferon genes, STING) 激活來抑制STING介導的干擾素 (interferon, IFN) 抗病毒信號傳導。在機制上,pUL13與STING的CDN結構域相互作用,并募集E3泛素蛋白連接酶 (E3 ubiquitin protein ligase, RNF5) 以促進K27-/K29-連接的泛素化和STING的激活[20]。此外,UL13還可以通過靶向干擾素調(diào)節(jié)因子3 (interferon regulatory factor 3, IRF3)進行泛素化和磷酸化來抑制cGAS-STING介導的IFN-β的產(chǎn)生[21-22]。UL13還可以通過調(diào)節(jié)DNA損傷標志物γH2AX引起DNA損傷反應 (DNA-damage response, DDR) 誘導細胞凋亡,其介導的γH2AX磷酸化在促進PRV復制和增殖中起著關鍵作用[23]。UL13也可以與過氧化物還原酶1 (peroxiredoxin 1, PRDX1) 相互作用,PRDX1是一種細胞抗氧化酶,可以通過與TANK結合激酶1 (TANK binding kinase 1, TBK1) 和IκB激酶ε (inhibitor κB kinase-ε, IKKε) 相互作用來促進IFN激活,而pUL13會使PRDX1泛素化,從而使其通過蛋白酶體途徑被降解,最終降低PRDX1的表達和IFN激活[24]。由此可見,pUL13能夠通過多種機制抑制宿主IFN抗病毒通路的激活。

1.2 pUL21的生物學功能

UL21基因在整個甲型皰疹病毒亞科中非常保守,其編碼一種內(nèi)膜蛋白。該蛋白對于PRV等病毒在培養(yǎng)細胞中的復制是非必需的,但其C末端可以與細胞質(zhì)動力蛋白 (cytoplasmic dynein) 的輕鏈Roadblock-1相互作用,進而促進PRV在體內(nèi)外的逆行性軸突轉(zhuǎn)運,從而有助于PRV神經(jīng)侵襲[25]。此外,在PRV減毒疫苗株Bartha-K61株(存在UL21基因的點突變)中用野生型病毒序列修復UL21位點后,病毒粒子恢復了體外和體內(nèi)的有效跨神經(jīng)元傳播能力[26],表明UL21在促進PRV神經(jīng)性感染方面發(fā)揮重要作用。

同屬甲型皰疹病毒亞科的HSV-2UL21還具有促進病毒基因表達以及促進衣殼從細胞核排出的功能[27],提示pUL21在病毒蛋白表達和病毒粒子組裝中發(fā)揮作用[28-29]。進一步,研究表明pUL21與其他內(nèi)膜蛋白存在互作。例如將UL21、UL16和UL11同時突變后,病毒粒子的核內(nèi)成熟階段不受影響,胞質(zhì)內(nèi)的病毒粒子形態(tài)也只是發(fā)生了輕微變化,但是pUL21增強了pUL16和pUL11在三重轉(zhuǎn)染細胞中的相互作用[30]。當pUL21與pUL11和gE形成復合體時,可能會對HSV-1在細胞間擴散以及二次包膜中發(fā)揮作用[31]。此外Michael等[32]研究發(fā)現(xiàn),缺乏pUL21的PRV病毒粒子中,內(nèi)膜層中pUL46、pUL49和pUS3的含量大大減少。由此可知,pUL21可通過與多種內(nèi)膜蛋白互作招募其他蛋白參與病毒粒子組裝。

UL21在PRV抵御宿主先天免疫方面也發(fā)揮了一定的作用,最近的研究發(fā)現(xiàn)pUL21通過Toll互作蛋白 (toll-interacting protein, TOLLIP) 介導的選擇性自噬觸發(fā)cGAS降解來抑制先天免疫。pUL21蛋白可作為支架招募E3泛素連接酶E3C催化cGAS在Lys384處的K27連接泛素化,此復合體后被TOLLIP識別并在溶酶體中降解,其中pUL21的N末端在該過程中發(fā)揮主要作用[33]。

1.3 pUL36的生物學功能

蛋白質(zhì)pUL36(VP1/2)是最大的內(nèi)膜蛋白,屬于高度保守的內(nèi)膜蛋白,一般通過與其他內(nèi)膜蛋白互作,在病毒核衣殼的胞核內(nèi)轉(zhuǎn)運、出核以及出核后二次包膜化過程中均起重要作用[34]。而pUL36的合成則可能與pUL11和pUL16有關,Michael等[35]分析了PRV的7個單基因缺失突變體,確定了病毒粒子總體組成在缺失目的蛋白之后的變化,與野生型相比缺失pUL21、pUL49、pUL51、pUS3或pUS8的突變體中,pUL36的含量無明顯變化,而缺失pUL11或pUL16的病毒粒子中的全長pUL36則少于野生型病毒粒子。

PRV的pUL36 N端區(qū)域可與第二大保守的被膜蛋白pUL37相互作用,共同構成內(nèi)膜層的內(nèi)層,影響病毒粒子的組裝[36]。pUL36的N末端具有去泛素化活性,即逆向調(diào)控泛素化修飾,阻止蛋白質(zhì)的降解[37]。N端去泛素酶編碼結構域會使病毒在上皮細胞系中的增殖速率和在原代感覺神經(jīng)元軸突中的轉(zhuǎn)運頻率降低,而C端則與感染細胞核中的衣殼組裝有關[38-39]。此外PRV的pUL36中包含去泛素化特異性蛋白酶,將第26位氨基酸的保守活性部位半胱氨酸突變?yōu)榻z氨酸后,pUL36蛋白N端的去泛素化活性被消除,病毒在體內(nèi)外的復制減少,神經(jīng)侵襲能力減弱,且二次包膜也會受到影響[40-42]。

1.4 pUL37的生物學功能

pUL37和pUL36一樣,是一種高度保守的內(nèi)膜蛋白,通常在病毒粒子的組裝、定向運輸以及二次包膜過程中發(fā)揮作用,pUL37通過與pUL36互作來控制病毒粒子形態(tài),使核衣殼呈現(xiàn)出更有序的二十面體形態(tài),二者的復合物可影響病毒的核衣殼出核以及后續(xù)的二次包膜,同時也會影響成熟的病毒粒子在胞質(zhì)中的運輸[43-46]。pUL37的N端(pUL37N)是緊湊的豆形β-螺旋結構,其中包含神經(jīng)侵襲所必需的表面區(qū)域,C端則是一種構象靈活的單體,由一個細長的折疊核心和一個非結構化的C端尾部組成[47],這種動態(tài)結構可以使其在病毒復制過程中發(fā)揮不同的作用。

pUL37影響核衣殼的運動,研究表明pUL37的 N 末端與多亞基系連蛋白復合物 (multisubunit tethering complexes, MTCs) 具有結構相似性,MTCs通過將細胞內(nèi)的運輸囊泡捕獲至特定的靶膜來控制真核細胞中的囊泡運輸,pUL37可模擬MTCs功能介導病毒核衣殼沿著軸突長距離運動[48-49]。據(jù)報道,HSV-1以及PRV的pUL37末端有三個進化上保守的表面暴露區(qū)域:R1、R2 和 R3,其中,R2區(qū)域介導的神經(jīng)侵襲的機制是調(diào)節(jié)軸突中的微管運輸并將核衣殼運輸至神經(jīng)元胞體,從而促進病毒在胞內(nèi)的運輸[49-50]。若UL37區(qū)域發(fā)生突變,病毒將無法通過軸突逆行運輸被運送到機體的外周神經(jīng)節(jié)。通過免疫金法標記以及通過免疫電子顯微鏡觀察其侵入過程,發(fā)現(xiàn)pUL36、pUL37和pUS3蛋白在PRV侵入細胞后存在于胞質(zhì)內(nèi)的衣殼中,而pUL11、pUL47、pUL48和pUL49內(nèi)膜蛋白則丟失,提示病毒主要通過這三種衣殼相關的內(nèi)膜蛋白與細胞質(zhì)動力蛋白相互作用,將核衣殼轉(zhuǎn)運到細胞核[51]。

pUL37影響完整病毒形態(tài)以及病毒的增殖,缺失UL37將會影響PRV病毒的粒子形態(tài),導致被感染細胞胞質(zhì)中只能檢測到少量能進行二次包膜的成熟病毒粒子,與此同時,無囊膜的核衣殼在胞質(zhì)中大量聚集。此外,缺失突變體PRV-ΔUL37可以在Vero細胞以及RK13細胞中進行高效的復制,但同屬甲型皰疹病毒亞科的HSV-1在缺失UL37后則無法進行有效復制,提示UL37在HSV-1復制過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)功能[52]。

pUL37還會影響病毒的二次包膜。甲型皰疹病毒的二次包膜通常發(fā)生在后高爾基體膜。有研究通過分析反式高爾基體 (trans-Golgi network, TGN) 的細胞標記物和破壞其功能,證明了TGN可作為HSV-1、PRV和VZV二次包膜的位點[53-54]。HSV-1感染細胞的免疫沉淀試驗表明pUL37與gK和 pUL20能發(fā)生相互作用。pUL37和gK-pUL20復合體之間的相互作用可能會將pUL36-pUL37復合體與包膜聯(lián)系起來,從而促進病毒粒子的二次包膜[55]。

1.5 pUL7、pUL11、pUL14、pUL16、dUTPase和pUL51的生物學功能

UL7及其同源基因在甲、乙、丙型皰疹病毒中是保守的,編碼的pUL7是一種分子量大小約為29 ku的蛋白質(zhì),該蛋白主要影響PRV的病毒滴度,且不影響核衣殼的形成。使用UL7缺失病毒感染細胞,發(fā)現(xiàn)與使用野生型病毒相比,病毒滴度和蝕斑大小都有所降低[56]。使用PRV感染小鼠,發(fā)現(xiàn)感染缺失株的小鼠存活時間明顯延長,可至70～72 h[57]。

UL11基因編碼的內(nèi)膜蛋白及其同系物在甲型皰疹病毒亞科中同樣是保守的,其主要影響PRV的二次包膜[58-59]。PRVUL11編碼一種分子量為10～13 ku的蛋白質(zhì),該蛋白質(zhì)主要在病毒復制過程中在細胞質(zhì)膜上被檢測到。與野生型病毒相比,UL11缺失病毒滴度降低了約10倍,蝕斑大小減小了60%[60]。pUL11、gE和gM參與發(fā)生在細胞質(zhì)中核衣殼的二次包膜,同時缺失UL11與gM的PRV感染細胞后,病毒的增殖量顯著下降,電子顯微鏡觀察到雙缺失病毒在細胞質(zhì)中的二次包膜過程中斷[61]。

在甲型皰疹病毒中,UL14也屬于較為保守的基因,在病毒感染后期表達。缺失UL14的HSV-1的二次包膜受到影響[62],而對缺失UL14的PRV研究表明,PRV的pUL14蛋白同樣影響病毒的二次包膜與蝕斑大小,但對病毒的侵襲力沒有影響,同時,缺失UL14延緩了小鼠的死亡時間[63]。UL14編碼的pUL14在HSV-1、HSV-2中表現(xiàn)出一定的抗凋亡活性、而在PRV中pUL14則并沒有表現(xiàn)出相應的抗凋亡活性[64-65]。

pUL16是皰疹病毒中的保守內(nèi)膜蛋白,可通過與其他病毒蛋白和宿主蛋白互作來影響病毒和細胞的增殖。pUL16會與富含亮氨酸的三角狀五肽重復結構蛋白 (leucine rich pentatricopeptide repeat containing, LRPPRC) 相互作用,從而參與半胱天冬酶非依賴性的細胞凋亡[66]。pUL16與UL35編碼的囊膜蛋白VP26之間存在相互作用,有助于VP26易位到細胞核中,從而影響PRV的增殖和病毒滴度[67]。使用UL16、UL21雙缺失病毒感染細胞,病毒復制幾乎不受影響,但蝕斑大小和病毒滴度都有所下降。通過電鏡觀察發(fā)現(xiàn),胞質(zhì)中病毒粒子形態(tài)發(fā)生輕微變化,而細胞核內(nèi)的病毒組裝不受影響[30],表明pUL16在維持病毒粒子形態(tài)和感染性方面發(fā)揮重要作用。

UL50在PRV中編碼脫氧尿苷三磷酸核苷酸水解酶(deoxyuridine 5′-triphosphate nucleotidohydrolase, dUTPase),dUTPase可以通過降解dUTP降低尿嘧啶在DNA中的錯誤摻入。研究表明敲除PRV的UL50基因后,其編碼的內(nèi)膜蛋白不影響病毒在細胞中的復制,但是在一定程度上延緩了病毒的增殖速度,對感染仔豬的致死率也有所降低[68-69]。dUTPase還可以通過促進IFN受體1的溶酶體降解,抑制Ⅰ型IFN信號傳導,從而有助于PRV的免疫逃避[70]。

pUL51是甲型皰疹病毒亞科中的保守蛋白,其功能主要與病毒的二次包膜有關。Klupp等[71]分離并分析了一種缺乏UL51開放閱讀框主要部分的突變體PRV-ΔUL51F。PRV-ΔUL51F的細胞試驗顯示,其滴度僅略有降低,但病毒蝕斑大小明顯減小,約達到野生型PRV蝕斑大小的30%,同時,細胞質(zhì)中存在大量處于不同包膜階段的不完整結構,表明缺失UL51后病毒在細胞質(zhì)中的二次包膜效率降低。

哺乳動物和禽類皰疹病毒基因組的系統(tǒng)發(fā)育分析表明,甲、乙、丙型皰疹病毒包含來源于共同祖先病毒的40個基因,這些基因被認為是核心基因[72]。在PRV編碼內(nèi)膜蛋白的基因中有UL7、UL11、UL13、UL14、UL16、UL21、UL36、UL37、UL50、UL51這10個已知的核心基因,均位于UL區(qū)域,且在進化上非常保守[8]。作為PRV基因組中高度保守的核心基因,它們參與皰疹病毒復制的基本步驟和感染的重要過程(表1),其中pUL36和pUL37對病毒的組裝起決定性的作用;pUL13、pUL21、pUL36、pUL37則能促進PRV在神經(jīng)元中的逆行運輸;pUL13、pUL21、pUL36共同參與病毒的出核,幫助在細胞核內(nèi)完成基因組復制的核衣殼脫離產(chǎn)生于細胞核內(nèi)的初次包膜,被釋放到胞質(zhì)中,進一步在pUL11、pUL14、pUL21、pUL36、pUL37、pUL51的協(xié)助下完成二次包膜的過程;pUL13、pUL16、pUL21和dUTPase同時對宿主的天然免疫也存在一定程度的影響;同時,pUL36、pUL37、pUL7、pUL14、pUL16均能影響病毒的復制。

表1 核心基因編碼的內(nèi)膜蛋白生物學功能

2 非核心基因編碼內(nèi)膜蛋白的生物學功能

2.1 pUS2的生物學功能

目前已知使用最為廣泛的PRV減毒疫苗株Bartha-K61株基因組的US區(qū)缺失了部分US2基因。作為PRV疫苗株中的缺失基因,US2的缺失會使感染的上皮細胞釋放更多的感染性病毒粒子至胞外,從而導致漿細胞樣樹突狀細胞過度活化,引發(fā)宿主的免疫反應[73-75]。另外,pUS2 蛋白序列不存在可識別的信號序列或跨膜結構域,但在感染早期,pUS2合成并定位于細胞質(zhì)囊泡和質(zhì)膜,位于其C末端的四個氨基酸包含一個CAAX基序,該序列是膜融合所必需的蛋白質(zhì)異戊二烯化的表征信號,且pUS2蛋白也被包裝為成熟病毒體內(nèi)膜的一部分[76]。此外,PRV在感染期間會激活絲裂原活化蛋白激酶/細胞外信號調(diào)節(jié)激酶 (MAPK/ERK) 信號通路,研究表明pUS2可與感染細胞中的活化的ERK的CD結構域結合,并通過將ERK隔離在細胞膜上而抑制ERK的激活[77-78]。

2.2 pUS3的生物學功能

pUS3是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶,參與調(diào)節(jié)廣泛的細胞過程,包括病毒出核、逆行運輸、病毒入侵與增殖、以及參與宿主的免疫調(diào)節(jié)等[79-81]。首先,包括PRV和HSV-1在內(nèi)的甲型皰疹病毒編碼的pUS3蛋白可作為激酶介導細胞中mRNA的m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復合體中幾種組分的磷酸化,并對m6A甲基化mRNA水平產(chǎn)生抑制[82]。研究表明,PRV的US3基因可轉(zhuǎn)錄成兩個mRNAs,編碼兩種不同的pUS3亞型,分別是pUS3a和pUS3b,這兩種蛋白的N末端序列和豐度不同。PRV的出核依賴較小的pUS3異構體和其完整的激酶活性,而缺乏較大的異構體對病毒復制沒有顯著影響[83]。

隧道納米管(tunneling nanotubes, TNTs)是連接真核細胞并介導細胞間通訊的長橋狀結構。Jansens等[84]的研究發(fā)現(xiàn)PRV pUS3誘導的隧道納米管含有穩(wěn)定的乙?；兔摾野彼峄⒐?通過鈣黏蛋白與鄰近細胞相互作用,并允許細胞間分子通訊,促進細胞間病毒的入侵。pUS3還可以通過激活絲切蛋白(cofilin, CFL)介導肌動蛋白細胞骨架的重排來促進病毒的侵襲[85]。有研究表明,PRV的pUS3蛋白激酶使RhoA蛋白的S188位點被磷酸化修飾,抑制Rho GTPase信號傳導,并引起宿主細胞骨架的重組,從而增強病毒通過基底膜到呼吸道黏膜等表面黏膜的上皮細胞中的增殖[86-87]。

另外,PRV pUS3在促進核衣殼有效逆行運輸方面具有重要作用。逆行運輸是指甲型皰疹病毒在進入軸突細胞質(zhì)后,其核衣殼和相關的內(nèi)膜蛋白啟動細胞逆行運輸機制促進病毒粒子組分向細胞核進行長距離移動,然后病毒DNA在細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄并完成裂解性感染或潛伏感染的過程。研究發(fā)現(xiàn),當US3缺失時,只有較少的核衣殼在軸突移動,且它們在停止前移動的時間較短,這導致較少的核衣殼晚12 h后才到達細胞體產(chǎn)生裂解性感染,這表明pUS3對于核衣殼逆行運輸是必需的。進一步發(fā)現(xiàn),軸突中的Akt磷酸化是PRV核衣殼有效逆向轉(zhuǎn)運所必需的,而pUS3能激活磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)-mTORC1通路并進而誘導在病毒感染早期軸突中的局部翻譯[88],而PRV感染后軸突mRNA的局部翻譯是促進核衣殼通過軸突的有效逆向運輸?shù)年P鍵因素。綜上,US3在PRV感染過程中能夠參與誘導軸突局部翻譯,從而在核衣殼運輸?shù)郊毎w的過程中發(fā)揮關鍵作用。

pUS3在PRV等甲型皰疹病毒逃避宿主天然免疫中發(fā)揮重要作用。研究表明,PRV的pUS3蛋白激酶通過與NK細胞上依賴CD300a的氨基磷脂配體以及CD300a的結合,可以保護被感染細胞免受NK細胞介導的裂解[89]。而且,PRV的pUS3可以在 PRV 感染早期激活PI3K/Akt 和 NF-κB 通路,并保護細胞免受病毒誘導的細胞凋亡[90]。與PRV同屬于甲型皰疹病毒亞科的HSV-1 US3具有與Akt相似的活性,可以直接靶向Akt信號通路下游的分子,導致被感染細胞Akt底物mTORC1等的磷酸化,從而刺激宿主細胞的翻譯和病毒復制[91]。另外,PRV的pUS3蛋白是抑制干擾素β (IFN-β)表達的關鍵拮抗病毒因子,可阻斷Ⅰ型IFN抗病毒應答。其pUS3蛋白可與IRF3相互作用并通過蛋白酶體途徑降解IRF3 蛋白表達來抑制Ⅰ型IFN產(chǎn)生。此外,pUS3還可以抑制IRF3磷酸化并阻止其核轉(zhuǎn)位,然后負向調(diào)節(jié) IFN-β 的產(chǎn)生。因此 PRV pUS3 可以通過多種機制抑制 IFN-β的產(chǎn)生,參與PRV的先天免疫逃避[92]。此外,PRV 的pUS3蛋白可以通過激活感染細胞中的AKT/mTOR途徑來降低自噬水平,從而逃避機體通過自噬這種抗病毒機制對PRV的清除[93]。

2.3 UL23編碼的胸苷激酶(thymidine kinase,TK)的生物學功能

UL23普遍存在于甲型皰疹病毒中,在PRV中UL23是重要的毒力基因。編碼的內(nèi)膜蛋白TK是一種胸苷激酶,含有320個氨基酸,屬于非必需蛋白,可以催化脫氧胸苷磷酸化為dTTP從而參與DNA合成,如阿昔洛韋等皰疹病毒治療常用藥物,就是依賴TK激活的,并產(chǎn)生抑制病毒復制的作用[8]。

作為重要的毒力因子,TK可以影響PRV對小鼠和豬的致病性,接種TK缺失株的豬出現(xiàn)短暫的發(fā)熱情況,而接種野生型PRV組則出現(xiàn)較為典型的臨床癥狀,病理診斷發(fā)現(xiàn)三叉神經(jīng)節(jié)出現(xiàn)急性炎癥[94]。使用小鼠進行的感染試驗也可證明TK缺失株可降低PRV的毒力和致死率[95]。TK缺失雖然會降低PRV的毒力,但幾乎不影響PRV的復制[96],因此在構建PRV疫苗時,編碼TK的UL23基因一般是首選基因,最初使用TK缺失株作為減毒疫苗的有保加利亞的MK25株等[97],目前國內(nèi)許多團隊也構建了缺失TK以及gE/gI的三基因缺失疫苗以應對臨床上PRV變異株的廣泛流行,如Cong等[98]構建的PRV-TJΔgE/gI/TK株、Wang等[99]構建的PRV-XJ5ΔgE/gI/TK毒株、Zhao等[100]構建的PRV-NYΔgE/gI/TK株。此外,雖然TK幾乎不影響病毒的復制,但能參與PRV在潛伏期的重新激活,也會影響PRV的神經(jīng)侵襲能力[1,97]。TK缺失株可以在豬的三叉神經(jīng)節(jié)建立潛伏感染,地塞米松可以激活野生型PRV造成的潛伏感染,但不能完全激活TK缺失株造成的潛伏感染[101-103]。而且缺失TK的PRV感染豬后,該突變株向中樞神經(jīng)系統(tǒng)的遷移會顯著減少[104],提示TK可以減弱PRV的神經(jīng)侵襲能力。

2.4 pUL41的生物學功能

UL41基因是PRV復制的非必需基因,UL41基因編碼的pUL41又被稱為宿主關閉蛋白 (virion host shutoff protein, vhs),pUL41在體內(nèi)外均具有核糖核酸酶活性,可降解宿主細胞的mRNA,抑制宿主基因表達。在HSV-1和PRV中,pUL41通過在感染早期降解宿主mRNA和在感染后期降解病毒mRNA來抑制蛋白質(zhì)表達,導致宿主的應答關閉[105-106]。與HSV-1不同的是,PRV中的pUL41還可以靶向rRNA進行降解[107]。宿主關閉蛋白vhs也可以影響TNF-α等宿主抗病毒的關鍵蛋白的編碼,缺失UL41的PRV在Vero細胞中表現(xiàn)出較低的病毒滴度,感染缺失病毒的小鼠脾中TNF-α表達量升高,說明pUL41可能通過抑制TNF-α的表達促進病毒感染[108]。本課題組成員前期研究發(fā)現(xiàn)pUL41對PRV的復制不是必需的,但缺失UL41基因的PRV仍會減弱PRV在體內(nèi)外的復制和感染能力,在體內(nèi)試驗中發(fā)現(xiàn),相較于接種親本PRV毒株或UL41回補病毒的小鼠,接種UL41缺失株的小鼠的感染進程有一定程度的延遲,且缺失UL41的PRV在小鼠三叉神經(jīng)節(jié)中的復制和感染受到顯著抑制[109]。

2.5 pUL46、pUL47、pUL48和pUL49的生物學功能

UL46是PRV的晚期基因,編碼一個95 ku的蛋白,主要在病毒感染后期發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn),UL46的缺失不影響病毒滴度,也不影響病毒粒子形態(tài),只是病毒蝕斑大小有所降低,表明UL46對病毒復制不起決定性作用[110]。在感染后期的胞質(zhì)中可檢測到UL46產(chǎn)物(VP11/12),進一步研究發(fā)現(xiàn)VP11/12可作為一種穿梭蛋白同時定位在細胞核和細胞質(zhì)內(nèi),并可與EP0、pUL48以及STING發(fā)生相互作用,而且pUL46的核定位信號是與pUL48互作的重要部位[111-112]。此外,VP11/12能夠誘導細胞外調(diào)節(jié)激酶1/2 (ERK1/2) 的磷酸化,從而刺激ERK1/2信號通路,并促進核膜崩解,但不能激活PI3K-Akt途徑[113]。PRVUL47基因編碼一個97 ku的蛋白質(zhì)pUL47(VP13/14),其構成病毒內(nèi)膜的主要組成部分。研究表明UL47產(chǎn)物在細胞質(zhì)中呈彌散狀而在細胞核中成斑點狀分布。缺失UL47基因的PRV病毒滴度與野生株相比下降將近10倍,病毒蝕斑也相應變小,而且胞質(zhì)內(nèi)由不完全內(nèi)膜覆蓋的病毒衣殼明顯增多,表明UL47在維持病毒基本形態(tài)及病毒粒子的組裝過程中發(fā)揮重要作用[110]。

PRVUL48基因編碼的蛋白可在病毒感染的細胞或純化的病毒粒子中檢測到,大小為53～57 ku。免疫熒光研究表明,PRV pUL48蛋白主要定位于感染細胞的細胞質(zhì),但也在細胞核中出現(xiàn)。此外,它是細胞外病毒顆粒的組成部分,不存在于初級有包膜的核周病毒顆粒中。UL48缺失的PRV感染細胞后形成的空斑大小明顯變小,增殖減慢,病毒滴度顯著降低;UL48基因缺失最顯著的影響是會使病毒粒子形態(tài)產(chǎn)生嚴重缺陷,UL48缺失株感染細胞后,可在電鏡下觀察到新形成的核衣殼滯留在宿主細胞質(zhì)中,胞質(zhì)內(nèi)或胞外包膜完整的病毒顆粒很少;相反,無衣殼的粒子被大量產(chǎn)生和釋放。這些發(fā)現(xiàn)表明pUL48蛋白在病毒粒子形成過程中可以促進核衣殼與后續(xù)的二次包膜有關的內(nèi)膜蛋白的組裝,在維持病毒粒子形態(tài)的完整性中起著重要作用[114]。除了能確保病毒粒子的結構完整性外,HSV-1的內(nèi)膜蛋白pUL48還可以在進入細胞后和病毒蛋白從頭合成之前在細胞內(nèi)執(zhí)行一系列功能。例如,即刻早期基因的轉(zhuǎn)錄就依賴宿主細胞因子HCF-1和OCT-1以及內(nèi)膜蛋白pUL48之間形成的轉(zhuǎn)錄復合體來進行激活[115-117]。

UL49基因所編碼的內(nèi)膜蛋白VP22對病毒復制的影響很小,UL49的缺失對病毒的成熟、出核以及二次包膜幾乎沒有影響[10]。VP22的C端可與gE、gM的胞質(zhì)結構域相互作用,是gE、gM定位所必須的,缺失gE、gM的病毒突變體無法摻入UL49編碼的VP22蛋白[118]。研究表明PRV VP22蛋白有三種不同的亞型,主要亞型不發(fā)生磷酸化并存在于病毒粒子中,而其他兩種類型被磷酸化且不存在于病毒粒子中。VP22在感染后6 h定位于細胞核內(nèi),其在細胞核內(nèi)的免疫熒光呈點狀彌漫性分布。點狀細胞核定位是其最明顯的染色形式,并不是只定位于病毒DNA復制的位點。缺失UL49的突變體在感染細胞中的復制與野生型病毒沒有明顯差異,感染小鼠后所表現(xiàn)出的毒力和神經(jīng)侵襲性也與野生型病毒幾乎沒有差別[119]。

與核心基因不同,目前并沒有相關報道表明非核心基因普遍存在于所有皰疹病毒中,同時非核心基因也并不像核心基因一樣高度保守[8],US2、US3、UL23、UL41、UL46、UL47、UL48、UL49是存在于PRV中的非核心基因,編碼pUS2、pUS3、TK、pUL41、pUL46 (VP11/12)、pUL47 (VP13/14)、pUL48 (VP16)、pUL49 (VP22)這幾種內(nèi)膜蛋白(表2)。非核心基因編碼的內(nèi)膜蛋白功能主要集中在影響病毒組裝和宿主先天免疫方面,其中pUL47、pUL48、pUL49在維持病毒粒子完整性,在參與病毒粒子組裝等過程中發(fā)揮一定作用;TK是PRV重要的毒力因子,影響PRV的潛伏感染和神經(jīng)侵襲過程;pUS3則會影響病毒出核以及逆行運輸;同時pUS2、pUS3、pUL41、pUL46通過不同的機制幫助病毒抵御宿主天然免疫,影響宿主的免疫應答。

表2 非核心基因編碼的內(nèi)膜蛋白生物學功能

3 小結與展望

PRV作為一種皰疹病毒編碼近百種蛋白,分別構成了衣殼、囊膜和內(nèi)膜。由于囊膜糖蛋白主要位于病毒表面,并具有良好的抗原性,長期以來,科研人員主要針對PRV的糖蛋白開展基礎和應用研究,對糖蛋白在PRV感染中的功能和作用有了較深入了解,并研發(fā)了敲除糖蛋白gE或gI的基因工程疫苗。但是,近年相關研究表明,內(nèi)膜蛋白作為皰疹病毒粒子的重要組成部分,在維持病毒形態(tài)結構的穩(wěn)定、促進病毒的復制、出核以及二次包膜、以及對抗宿主免疫系統(tǒng)等方面也可發(fā)揮重要的作用。

本文通過對PRV的核心基因與非核心基因編碼的內(nèi)膜蛋白生物學功能進行歸納總結,發(fā)現(xiàn)核心基因編碼的內(nèi)膜蛋白在病毒的組裝、神經(jīng)元中的逆行運輸、病毒的出核、二次包膜以及調(diào)控宿主的天然免疫方面有較大影響;而非核心基因編碼的內(nèi)膜蛋白則主要影響病毒的組裝和宿主先天免疫應答。由此可見,核心與非核心基因編碼的內(nèi)膜蛋白在PRV感染宿主的基本過程以及逃逸和適應宿主免疫過程中均扮演重要角色,相關研究有望為未來PRV新型疫苗研發(fā)、靶向治療性藥物研究和潛伏感染機制等方面研究提供新的思路。

此外,PRV作為甲型皰疹病毒分子生物學研究中的一種模式病毒,對其內(nèi)膜蛋白生物學功能的系統(tǒng)研究將有助于對整個甲型皰疹病毒科的內(nèi)膜蛋白進行系統(tǒng)的功能分析,并進一步回答有關病毒生命周期、傳播方式以及病毒發(fā)病機制等關鍵問題,這些研究有望在皰疹病毒的診斷檢測、疫苗研發(fā)以及靶向性抗病毒藥物研發(fā)等方向進行應用。