陳富斌,徐國偉,王 磊,劉 琴,馮海鵬 ,張 康,郭志廷,韓松偉,劉佳惠,古雪艷,張景艷*,李建喜*,Huub F. J. Savelkoul

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所,蘭州 730050;2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,蘭州 730070;3.荷蘭瓦赫寧根大學(xué)細胞生物與免疫學(xué)教研組,荷蘭瓦赫寧根市)

黃芪多糖(APS),作為豆科黃芪屬植物的主要成分之一,是免疫活性最強的一類生物大分子[1],具有免疫調(diào)節(jié)、促進免疫器官發(fā)育[2-3],增加免疫球蛋白和T淋巴細胞的數(shù)量、增強疫苗保護效力等生物學(xué)功能[4-5],已被廣泛應(yīng)用于畜禽生產(chǎn)中[6]。天然免疫是機體重要的防御屏障,對抵抗病原微生物感染發(fā)揮至關(guān)重要的作用[7-8]。巨噬細胞是機體天然免疫調(diào)控的主要執(zhí)行者,并參與特異性免疫過程[9],能消滅侵入機體的細菌、吞噬異物顆粒,消除體內(nèi)衰老、損傷的細胞和細胞間質(zhì)變性、殺傷腫瘤細胞,并參與免疫反應(yīng)[10]。研究表明,APS對正常小鼠的細胞免疫、體液免疫及巨噬細胞功能均有明顯的增強作用[11]。然而有關(guān)其對雞巨噬細胞(HD11細胞)的調(diào)節(jié)作用機制研究尚不深入。HD11細胞是一種通過復(fù)制缺陷型禽白血病病毒MC29毒株轉(zhuǎn)化雞骨髓細胞形成的永生化細胞系,常被作為開展家禽天然免疫調(diào)控研究的模式細胞。作者研究發(fā)現(xiàn),12.5～800.0 μg·mL-1APS對HD11細胞增殖活性有促進作用;100 μg·mL-1APS處理HD11細胞12 h,可能通過識別TLR2、TLR4及TLR15促進HD11細胞增殖與極化,發(fā)揮免疫增強作用[12-13]。然而相關(guān)分子機制有待于進一步的研究證實。

研究表明,巨噬細胞的糖酵解、氧化磷酸化等糖代謝途徑與其極化、免疫增強等生物學(xué)過程有緊密的相關(guān)性[14-15]。劉小琳等[16]研究發(fā)現(xiàn)在RAW264.7細胞中PI3K/AKT信號通路通過激活mTOR信號通路,激活糖酵解,從而激活巨噬細胞M1極化過程。轉(zhuǎn)錄組學(xué)與代謝組學(xué)是一門新興技術(shù),該技術(shù)的應(yīng)用可為疾病發(fā)生、藥理學(xué)作用等領(lǐng)域的深入研究提供重要依據(jù)[17-18]。通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn),在β-葡聚糖(β-glucan)和卡介苗(BCG)誘導(dǎo)的單核巨噬細胞訓(xùn)練免疫形成中糖酵解代謝過程的重編程發(fā)揮關(guān)鍵作用[19]。當(dāng)糖酵解途徑被抑制后,天然免疫細胞的表觀遺傳修飾及免疫記憶均會被抑制[20]。在進一步研究發(fā)現(xiàn),50 μg·mL-1APS可誘導(dǎo)HD11細胞形成訓(xùn)練免疫,并對隨后LPS再刺激產(chǎn)生免疫增強的記憶特征。然而APS的這種訓(xùn)練免疫作用是否與代謝重編程有相關(guān)性,尚未見文獻報道。因此,本試驗擬通過轉(zhuǎn)錄組與代謝組分析,探究50 μg·mL-1APS是否通過膜受體的識別,進而介導(dǎo)相關(guān)信號通路和代謝重編程發(fā)揮對HD11的免疫調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用APS由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所中獸醫(yī)實驗室制備,測得試驗 用APS總多糖含量為95.31%±3.55%;還原性多糖含量1.96%±0.03%;蛋白質(zhì)含量為6.50%±0.80%;HD11細胞由西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院王晶鈺老師饋贈;細胞培養(yǎng)液RPMI 1640、雞血清、胎牛血清和胰蛋白酶-EDTA購自Gibco公司;青鏈霉素和PBS購自索萊寶公司。

1.2 方法

1.2.1 HD11細胞復(fù)蘇 將凍存的HD11細胞在37.5 ℃下水浴解凍,1 000 r·min-1離心5 min,棄上清,取沉淀,接于1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、2.5%雞血清和1%青鏈霉素)重懸并移入細胞培養(yǎng)瓶中,標記為第1代,置于41 ℃、體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng),每隔48 h更換1次培養(yǎng)基,在顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)及生長狀況。

1.2.2 HD11細胞傳代 當(dāng)細胞融合度達80%～90%以上時,棄上清,用預(yù)熱的PBS洗一遍,使用胰蛋白酶-EDTA消化3 min,在鏡下可見細胞回縮呈圓形、輕拍細胞瓶可見細胞滑動時,棄去胰蛋白酶-EDTA,加1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、2.5%雞血清和1%青鏈霉素)1 000 r·min-1離心5 min,棄上清,加入1640培養(yǎng)基輕輕吹打混懸細胞,使用細胞計數(shù)器計數(shù),并調(diào)整濃度后,分裝到新的細胞培養(yǎng)瓶中,標記為第2代,貼壁培養(yǎng)24 h。傳至3～5代可進行后續(xù)試驗。

1.2.3 HD11細胞的處理與分組 將消化后的HD11細胞1 000 r·min-1離心5 min,棄上清,取沉淀,接于1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、2.5%雞血清和1%青鏈霉素)中,調(diào)整細胞濃度為1×106·mL-1,按5 mL·瓶-1接于T25細胞培養(yǎng)瓶中,置于41 ℃、體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h,棄上清。將細胞分為空白對照組(CON組)和APS處理組(A50組)。①空白對照組細胞中加入1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、2.5%雞血清和1%青鏈霉素)培養(yǎng)12 h;②50 μg·mL-1APS試驗組中用1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、2.5%雞血清和1%青鏈霉素)將APS濃度調(diào)整為50 μg·mL-1后加入細胞中培養(yǎng)12 h;收集各組上清和細胞,并進行后續(xù)試驗。

1.2.4 轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)及二者關(guān)聯(lián)分析 將培養(yǎng)的細胞去除培養(yǎng)基,用預(yù)冷的PBS清洗2～3次,棄去上清,最后加入1 mL預(yù)冷的80%的甲醇水溶液,使用細胞刮將培養(yǎng)容器中所有細胞都刮干凈,轉(zhuǎn)入2 mL凍存管中,置于液氮中速凍15 min后,保存于-80 ℃冰箱中;轉(zhuǎn)運過程中,將細胞樣本置于足量干冰中運輸。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)分析 轉(zhuǎn)錄組學(xué)差異基因的篩選標準是|log2(Fold change)|≥1且Padj≤0.05。代謝組學(xué)差異代謝物的篩選主要參考VIP、FC和P-value 3個參數(shù),VIP是指PLS-DA模型第一主成分的變量投影重要度,VIP值表示代謝物對分組的貢獻;FC指差異倍數(shù)(Fold change),為每個代謝物在比較組中所有生物重復(fù)定量值的均值的比值;P-value是通過T-test計算得到,表示差異顯著性水平。采用一維方差分析,設(shè)定閾值為VIP>1.0,FC>1.5或FC<0.667的方法篩選差異代謝物。并計算出差異代謝物在兩組間的差異變化倍數(shù) FC(fold change),通過差異變化倍數(shù)判斷差異代謝物的上調(diào)或者下調(diào)。

2 結(jié) 果

2.1 APS處理組與空白對照組的轉(zhuǎn)錄組分析

2.1.1 差異表達基因分析 轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中的共表達維恩圖展示了每個組中唯一表達的基因數(shù)量,重疊區(qū)域展示了兩個組中共表達的基因數(shù)量。APS處理組(A50)與空白對照組(CONT)的唯一表達基因數(shù)量與共表達基因數(shù)如圖1所示,空白對照組總共鑒定出11 116個表達基因,而APS處理組共鑒定出11 021個表達基因,其中二者共同表達的基因數(shù)為10 592個。

圖1 共表達韋恩圖Fig.1 Co-expression Venn diagram

如圖2所示,以|log2(Fold change)|≥1且Padj≤0.05為標準,APS處理組與空白對照組相比較,共篩選到差異基因845個,其中上調(diào)基因415個,下調(diào)基因430個。

圖2 差異表達基因統(tǒng)計Fig.2 Statistics of differentially expressed genes

2.1.2 差異表達基因KEGG富集分析 KEGG通路數(shù)據(jù)庫包括各種生物通路中分子相互作用網(wǎng)絡(luò)和生物體所特有的變化形式,從而確定蛋白質(zhì)參與的最重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和生物代謝通路。將APS處理組與空白對照組的差異表達基因進行KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn),APS處理組與空白對照組的224個差異基因富集于113條KEGG通路,差異表達基因主要富集在細胞因子-細胞因子受體相互作用、Toll樣受體信號通路、吞噬體、AGE-RAGE等信號通路,其中細胞因子-細胞因子受體相互作用、Toll樣受體信號2條通路最為顯著性(圖3)。

點的大小代表注釋到GO term上的基因數(shù),顏色從紅到紫代表富集的顯著性大小The size of the dots represents the number of genes annotated onto the GO term, and the colors from red to purple represent the significance size of enrichment

2.1.3 關(guān)鍵信號通路中差異基因的表達情況 細胞因子-細胞因子受體信號通路與Toll樣受體信號通路是兩條對HD11胞免疫調(diào)節(jié)作用影響的重要途徑,與細胞的免疫調(diào)節(jié)等密切相關(guān)。對APS處理組與空白對照組的差異基因表達進行分析,發(fā)現(xiàn)在細胞因子-細胞因子受體信號通路中富集了19個差異基因,其中上調(diào)基因17個,包括IL-8、CXCL13、CSF1、TNFSF8等,下調(diào)基因2個,包括IL-12B和CCR5(表1);在Toll樣受體信號通路中主要富集了11個差異基因,其中上調(diào)基因5個,包括IL-8、IL8L1、TLR1B、CCL4和TLR1A,下調(diào)基因6個,包括TLR2A、TLR2B、IL-12B、FOS、TLR3和MAP2K7(表2);在其他代謝通路富集的差異基因中ACSS2、iNOS、ATP6V0、MTA為上調(diào)基因,H6PD、PRPS2、CA、MSA為下調(diào)基因(表3)。

表1 細胞因子-細胞因子受體相互作用的基因表達情況

表3 其他代謝途徑基因的表達情況

2.2 APS處理組與空白對照組代謝組分析

2.2.1 代謝組學(xué)多元統(tǒng)計分析 主成分分析(principal component analysis, PCA)是將一組可能存在相關(guān)性的變量,通過正交變換轉(zhuǎn)換為一組線性不相關(guān)變量的統(tǒng)計方法,轉(zhuǎn)換后的這組變量即稱為主成分。依據(jù)PCA模型顯示,第一主成分可顯示30.68%的代謝物信息,第二主成分可顯示25.55%的代謝物信息,APS處理組與空白對照組代謝物的第一主成分和第二主成分在空間中的分布相對獨立,存在顯著差異(圖4)。

圖4 代謝組學(xué)樣本PCA分析圖Fig.4 PCA analysis of metabonomic samples

(圖5 Fig.5)

2.2.2 差異代謝物分析 利用液相色譜-質(zhì)譜技術(shù),參比空白對照組,APS處理組共篩選出623個差異代謝物,其中差異顯著的代謝物總數(shù)為89個。在差異顯著的代謝物中,下調(diào)的差異代謝物為70個,上調(diào)的差異代謝物為19個。根據(jù)組間差異比較組合得到的差異代謝物繪制火柴桿圖,能夠較為清晰的表示代謝物的上、下調(diào)以及差異倍數(shù)變化較大的物質(zhì)。以log2(Fold change)進行排序,分別取前20的上調(diào)/下調(diào)代謝物進行火柴桿圖的展示。其中5′-S-甲基-5′-硫腺苷、腺嘌呤、生物素等顯著上調(diào);谷胱甘肽、神經(jīng)酰胺、麥芽四糖等顯著下調(diào)(圖5)。

2.2.3 差異代謝物KEGG通路富集分析 對APS處理組和空白對照組的差異表達代謝進行KEGG通路富集分析,主要涉及的通路包括細胞轉(zhuǎn)化、環(huán)境信息過程、遺傳信息過程、代謝和有機系統(tǒng)5類,包括氨基酸代謝、類脂物代謝、輔助因子和維生素的代謝、核苷酸代謝等20條通路發(fā)生變化(圖6)。

圖6 KEGG富集柱狀圖Fig.6 KEGG enrichment bar graph

2.3 APS處理組與空白對照組的轉(zhuǎn)錄組和代謝組聯(lián)合分析

2.3.1 基因分析差異結(jié)果 轉(zhuǎn)錄組與代謝組是檢測特定狀態(tài)下生物個體、組織或細胞的基因和代謝物的表達水平。APS處理組與空白對照組比較在上調(diào)中有415個顯著差異的基因,有19個顯著差異的代謝物;在下調(diào)中有430個顯著差異的基因,有70個顯著差異的代謝物。

2.3.2 代謝與轉(zhuǎn)錄KEGG富集分析 基于代謝與轉(zhuǎn)錄同一比較對的KEGG富集結(jié)果,以KEGG pathways為條目,獲取代謝、轉(zhuǎn)錄共同富集到的通路,可信度排名前十的代謝通路主要有嘌呤代謝、碳代謝、磷酸戊糖途徑、谷胱甘肽代謝、組氨酸代謝、氨基糖和核苷酸糖代謝、α-亞麻酸代謝、ABC轉(zhuǎn)運體、鐵死亡和酪氨酸代謝(圖7)。

Meta 代謝(圓點是代謝數(shù)據(jù)),Tran 轉(zhuǎn)錄(三角是轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù);P value是通路富集(轉(zhuǎn)錄或代謝)的P value;value是通路中富集的代謝物或基因的個數(shù),通路中富集的是該通路中富集到的差異代謝物或差異基因與該通路中注釋到的代謝物或基因個數(shù)的比值Meta metabolism (dots are metabolic data), Tran transcription (triangles are transcriptional data; P value is the pvalue of pathway enrichment (transcription or metabolism); Count is the number of metabolites or genes enriched in the pathway, and Ratio is the ratio of differential metabolites or genes enriched in the pathway to the number of metabolites or genes annotated in the pathway

3 討 論

APS是一種具有免疫調(diào)節(jié)活性的多糖,其對機體巨噬細胞的調(diào)節(jié)作用機制研究是近年來的研究熱點。然而有關(guān)其對雞巨噬細胞的調(diào)節(jié)作用機制尚不明確?；谇捌谘芯拷Y(jié)果,作者推測APS可能是通過相關(guān)信號通路和糖代謝相關(guān)途徑的調(diào)控,對HD11細胞發(fā)揮免疫增強和訓(xùn)練免疫作用。因此,本研究利用轉(zhuǎn)錄組和代謝組學(xué)技術(shù),對50 μg·mL-1處理的HD11細胞與對照組HD11細胞進行差異分析,旨在為APS的天然免疫調(diào)節(jié)機制研究提供理論和科學(xué)依據(jù)。在轉(zhuǎn)錄組結(jié)果中,APS處理組與空白對照組共篩選出差異基因845個,APS處理組415個基因表達較空白對照組上調(diào)、430個基因表達下調(diào);APS處理組與空白對照組的224個差異基因富集于113條KEGG通路,差異表達基因主要在細胞因子-細胞因子受體相互作用、Toll樣受體信號通路、吞噬體、AGE-RAGE等信號通路上富集。

炎癥因子主要是由單核/巨噬細胞或淋巴細胞產(chǎn)生的細胞因子,包括IL-1或、IL-6、IL-8、TNF-或等[21-22],參與機體多種疾病的炎癥、感染和免疫等多種生理病理過程[23]。結(jié)果發(fā)現(xiàn),APS處理組促進IL-8、CXCL13及CCL4的轉(zhuǎn)錄,抑制CCR5、IL-12的轉(zhuǎn)錄。Toll樣受體是一類天然免疫模式識別受體,在病原微生物免疫和誘導(dǎo)快速防御反應(yīng)激活中具有重要作用[24]。TLRS在不同宿主中存在多態(tài)性,且由于宿主生存環(huán)境存在的差異,導(dǎo)致TLRS信號途徑介導(dǎo)的宿主免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)分子機制具有差異性[25]。在Toll樣受體信號通路中,以往植物多糖的研究主要集中在TLR4上[26-28],而本研究結(jié)果顯示,APS促進HD11雞巨噬細胞IL-8L1、TLR1B、CCL4和TLR1A的轉(zhuǎn)錄,抑制TLR2A、TLR2B、IL-12B、FOS、TLR3和MAP2K7的轉(zhuǎn)錄。作者在前期研究中也發(fā)現(xiàn),與哺乳類動物不同,APS和LPS抑制TLR2和TLR4的轉(zhuǎn)錄,且APS對TLR2 mRNA更加敏感[29]。另在LPS處理12 h的HD11細胞轉(zhuǎn)錄組分析中,也發(fā)現(xiàn)TLR2信號通路受到主要富集,其中,TLR1和TLR2為下調(diào)差異基因;CCL5、IL-8為上調(diào)差異基因[30-31]。通過與已有試驗結(jié)果和相關(guān)文獻的比對,作者推測50 μg·mL-1APS對HD11細胞的免疫調(diào)節(jié)作用與TLR2信號通路調(diào)控相關(guān)。

近年來研究表明,糖代謝重編程是巨噬細胞極化的根本原因[32],其作為免疫刺激與表觀遺傳修飾的重要鏈接,也是訓(xùn)練免疫形成的重要機制[33]。在轉(zhuǎn)錄組結(jié)果中,作者還發(fā)現(xiàn)ACSS2 (糖酵解關(guān)鍵酶基因)、iNOS(參與細胞傳導(dǎo)和免疫調(diào)節(jié)的關(guān)鍵酶基因)、ATP6V0(在細胞代謝功能和抑炎性表型都具有重要作用)、MTA(一種甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑)顯著性上調(diào),H6PD(H6PDH,是磷酸戊糖途徑NAPDH合成的關(guān)鍵酶,與G6PDH具有相似的反應(yīng)特點)、PRPS2(核苷酸合成途徑中一種重要的限速酶)顯著性下調(diào)。在代謝組結(jié)果中,作者發(fā)現(xiàn)APS處理組顯著性上調(diào)差異表達代謝物主要有5′-S-甲基-5′-硫腺苷、腺嘌呤、生物素等;顯著性下調(diào)差異表達代謝物主要有谷胱甘肽、神經(jīng)酰胺、麥芽四糖等,且差異代謝物主要在5-磷酸核糖-1-焦磷酸代謝、腺嘌呤、次黃嘌呤等通路上富集。在轉(zhuǎn)錄組與代謝組聯(lián)合分析結(jié)果中,作者發(fā)現(xiàn)嘌呤代謝、碳代謝(包括三羧酸循環(huán)、糖酵解)、磷酸戊糖途徑、谷胱甘肽代謝等是APS處理組的主要富集代謝途徑。研究發(fā)現(xiàn)在免疫作用刺激下,細胞中代謝重新編程包括葡萄糖攝取增加,糖酵解速率提高,磷酸戊糖途徑上調(diào)以及通過TCA循環(huán)的氧化磷酸化水平降低[34]。因此,可以看出50 μg·mL-1APS對HD11細胞的免疫調(diào)節(jié)作用與糖酵解、磷酸戊糖的代謝重編程相關(guān)。

4 結(jié) 論

50 μg·mL-1APS對HD11細胞的免疫調(diào)節(jié)作用機制與TLR2受體信號通路、糖酵解、磷酸戊糖的代謝重編程相關(guān),但其分子調(diào)節(jié)機制仍需在蛋白水平、關(guān)鍵代謝基因及代謝產(chǎn)物表達水平上進一步驗證。