黎玉瓊,于有利*,從志鵬,趙正偉,梁小軍,王韋健,李繼東,李勤凡,文 亮,牛曉昊

(1.寧夏農(nóng)林科學院,寧夏銀川 750002;2.西北農(nóng)林科技大學,陜西楊凌 712100;3.華南農(nóng)業(yè)大學,廣東廣州 510642;4.寧夏大學,寧夏銀川 750002;5.寧夏農(nóng)墾乳業(yè)股份有限公司渠口牧場,寧夏銀川 750002)

隱孢子蟲(Cryptosporidium)屬于原生生物界(Protozoa)、頂端復合體亞門(Apicomplexa)、孢子蟲綱(Sporozoasida)、球蟲亞綱(Coccidiasina)、真球蟲目(Eucoccidiorida)、艾美耳亞目(Eimeriorina)、隱孢子蟲科(Cryptosporidiidae)、隱孢子蟲屬(Cryptosporidium)[1],是引起包括人類在內(nèi)的多種脊椎動物腹瀉和胃腸炎的主要病原,尤其是對幼兒和免疫功能低下患者具有很大威脅[2]。目前,主要通過分子生物學方法來評估隱孢子蟲的遺傳多樣性,基于隱孢子蟲gp60基因的PCR方法常被用來區(qū)分同一蟲種的不同亞型[3]。引起牛隱孢子蟲的感染通常與微小隱孢子蟲、牛隱孢子蟲、瑞氏隱孢子蟲和安氏隱孢子蟲有關。微小隱孢子蟲通常感染人和牛,而安氏隱孢子蟲和牛隱孢子蟲偶爾也會感染人[4],因此受感染的?？赡苁侨祟惛腥倦[孢子蟲的潛在的重要宿主。微小隱孢子蟲的常見亞型家族主要包括Ⅱa、Ⅱc和Ⅱd型,其中Ⅱa和Ⅱd型主要存在于人類和反芻動物中,Ⅱc主要存在于人類中[2]。在世界范圍內(nèi),Ⅱa亞型家族主要存在于發(fā)達國家的斷奶前犢牛中,Ⅱd亞型家族主要存在于歐洲和中東國家的綿羊和山羊的羔羊中,而Ⅱc亞型家族主要存在于低收入和中等收入國家的人群中[5]。近年來國內(nèi)諸多研究發(fā)現(xiàn)Ⅱd亞型也是導致我國斷奶前犢牛感染的主要亞型。目前在已檢測到的微小隱孢子蟲亞型家族中,ⅡdA15G1、ⅡdA18G1、ⅡdA19G1、ⅡdA20G1[4,6]較為常見,其中ⅡdA15G1亞型在我國西北地區(qū)較為常見,ⅡdA18G1在中國中西部地區(qū)較為常見[7-8],ⅡdA19G1亞型在我國東部地區(qū)較為常見,ⅡdA20G1亞型曾在我國東北地區(qū)報道過[6]。關于寧夏地區(qū)奶牛中隱孢子蟲的分布情況鮮有報道。本研究通過分子生物學方法調(diào)查寧夏部分地區(qū)奶牛隱孢子蟲的分子流行病學特征,以期明確其傳播風險及危害,從而為進一步制定相應的防控治療方案提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 奶牛糞便樣品 1 174份奶牛新鮮糞便樣品,隨機采集自寧夏石嘴山市(33份)、中衛(wèi)市(16份)、吳忠市(333份)和銀川市(792份)4個地區(qū)10個集約化奶牛場(表1)。采樣方法為直腸采樣或收集地面上剛排泄的新鮮糞便,保存于2.5%重鉻酸鉀溶液的離心管中,同時記錄樣品詳細信息,包括牛的圈舍、牛號、月齡以及糞便性狀等。將樣品置于4 ℃保存,待檢。

表1 奶牛糞便樣品的來源信息

1.1.2 主要試劑 重鉻酸鉀(483044),Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品;CellRed核酸染料(41003),北京沃比森科技公司產(chǎn)品;無水乙醇(E7148),Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品;FastDNA?SPIN Kit for Soil DNA(116560200),MP Biomedicals公司產(chǎn)品;TaqPCR Master Mix(PC1150 ),Solarbio公司產(chǎn)品; DNA Marker DL1000(D526A),日本Takara公司產(chǎn)品;生理鹽水(ST341),Agarose瓊脂糖(ST004L),PBS緩沖液(ST447),上海碧云天有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 小型臺式離心機(5430),Eppendorf公司產(chǎn)品;PCR擴增儀(S1000TM),Bio-Rad公司產(chǎn)品;凝膠成像系統(tǒng)(Gel Doc XR+),美國Bio-Rad公司產(chǎn)品;均質(zhì)破碎儀(MP FastPrep?-24),上海迭戈生物科技有限公司產(chǎn)品;多功能電子天平(JD500-2),沈陽龍騰電子有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 糞便樣品DNA的提取 稱取250.0 mg的糞樣裝入2 mL的滅菌離心管內(nèi),用滅菌雙蒸水混合均勻后12 000 r/min離心10 min,雙蒸水洗滌3次,棄掉上清,糞便沉淀根據(jù)FastDNA?SPIN Kit for Soil DNA試劑盒提取糞便基因組DNA,具體操作步驟參照試劑盒說明書。

1.2.2 目的基因的擴增 基于核糖體小亞基RNA(SSUrRNA)基因鑒定隱孢子蟲陽性樣品[9],基于微小隱孢子蟲表面黏附蛋白gp60鑒定微小隱孢子蟲基因型[10],分別針對SSUrRNA和gp60設計套式PCR引物。引物序列及目的片段大小見表2,引物由上海生工生物工程有限公司合成。第1輪套式PCR反應體系為25 μL:GreenTaqMix高保真酶12.5 μL,上、下游引物各1 μL,DNA模板3 μL,ddH2O 8.5 μL。反應條件為:95 ℃預變性7 min;95 ℃ 30 s,65 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,共35個循環(huán);72 ℃延伸1 min,4 ℃停止反應;隨后將第1輪反應中的2 μL產(chǎn)物作為模板進行第2輪PCR擴增。第2輪套式PCR擴增體系為25 μL:GreenTaqMix高保真酶 12.5 μL,上、下游引物各1 μL,DNA模板2 μL,ddH2O 8.5 μL。第2輪PCR擴增程序:95 ℃預變性7 min;95 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,共35個循環(huán);72 ℃延伸1 min,4 ℃停止反應。分別取10 μL第2輪PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠進行電泳,并按照DNA片段快速膠回收試劑盒說明書進行DNA片段純化。純化的PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

表2 套氏PCR引物序列

1.2.3 隱孢子蟲的遺傳進化分析 根據(jù)SSUrRNA測序結果,經(jīng)Blast序列比對,選用GenBank中C.ryanaeJX416367 DCC-6、C.ryanaeAB777174 isolate 37281、C.ryanaeKP793013 isolate 1226、C.ryanaeKC618591 strain 255C、C.bovisbovine genotype AY7413、C.bovisJX416363 DDC17、C.bovisAB746197 isolate 21、C.felisKJ194109 isolate PS41、C.parvumAF093493、C.parvumKJ808689、C.parvumAB968048、C.andersoniKF826306、C.andersoniKT92229和C.andersoniEU245042為參考序列,并使用ClustalX 2.0.12軟件進行序列比對,確定相關蟲種/基因型或基因亞型并構建種系發(fā)育進化樹。

1.2.4 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析 利用SPSS 23.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,試驗數(shù)據(jù)以“平均值±標準誤”表示。采用卡方檢驗對結果進行差異顯著性分析,P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著,P>0.05表示差異不顯著。

2 結果

2.1 寧夏地區(qū)奶牛隱孢子蟲的感染率

通過對寧夏地區(qū)10個規(guī)模化奶牛養(yǎng)殖場采集的1 174份不同月齡奶牛糞便樣品基因組DNA提取,并針對SSUrRNA基因進行套式PCR擴增,檢測目的片段大小為830 bp(見圖1),共有335份樣品為隱孢子蟲陽性,總感染率為28.5%(335/1 174)。其中中衛(wèi)市隱孢子蟲感染率為25.0%(4/16)、石嘴山市感染率為39.4%(13/33)、吳忠市感染率為58.3%(194/333)以及銀川市感染率為15.7%(124/792)。寧夏4個地區(qū)隱孢子蟲感染率差異極顯著(P<0.001)。通過分析隱孢子蟲在不同月齡段奶牛感染率的結果,如表4所示,隱孢子蟲在0～2月齡犢牛中感染最嚴重,感染率為47.7%(143/300),3～4月齡犢牛感染率為41.9%(106/253),5～7月齡奶牛感染率為19.6%(71/363),8～12月齡奶牛感染率為0%(0/69),12月齡以上奶牛感染率為7.9%(15/189),不同月齡之間奶牛隱孢子蟲感染率差異極顯著(P<0.001)。此外,根據(jù)奶牛的糞便性狀進行劃分為腹瀉樣品(451份)和非腹瀉樣品(723份)。如表5所示,腹瀉樣品中隱孢子蟲的感染率為37.5%(169/451)顯著高于非腹瀉樣品中的感染率13.0%(94/723),差異極顯著(P<0.001)。

M.DNA標準DL 1 000;1～21.部分樣品;-.陰性對照;+.陽性對照

M.DNA標準DL 1 000;1～22.部分樣品;-.陰性對照;+.陽性對照

2.2 寧夏地區(qū)奶牛中隱孢子蟲蟲種分布

針對335份隱孢子蟲陽性樣品基因組DNA進行基于SSUrRNA基因的第2輪套式PCR,共檢測到4種隱孢子蟲蟲種,其中微小隱孢子蟲感染率為40.6%(136/335),牛隱孢子蟲感染率為36.1%(121/335),瑞氏隱孢子蟲感染率為19.4%(65/335),安氏隱孢子蟲感染率為3.9%(13/335)(見表3)。在寧夏的不同地區(qū)奶牛中,牛隱孢子蟲(44.8%,87/194)為吳忠市的優(yōu)勢蟲種;微小隱孢子蟲為石嘴山市(46.2%,6/13)、中衛(wèi)市(100%,4/4)和銀川市(55.6%,69/124)的優(yōu)勢蟲種(表3)。以上數(shù)據(jù)表明微小隱孢子蟲是導致寧夏地區(qū)奶牛感染的優(yōu)勢蟲種。不同月齡段奶牛感染的隱孢子蟲蟲種也不同,其中微小隱孢子蟲(78.3%,112/143)是0～2月齡犢牛的優(yōu)勢蟲種;牛隱孢子蟲是3～4月齡(53.8%,57/106)和5～7月齡(47.9%,34/71)奶牛的優(yōu)勢蟲種;同時瑞氏隱孢子蟲(47.9%,34/71)也是5～7月齡奶牛的優(yōu)勢蟲種;安氏隱孢子蟲(66.7%,10/15)是12月齡以上成年奶牛的優(yōu)勢蟲種(表4)。微小隱孢子蟲僅在0～4月齡以內(nèi)犢牛中發(fā)現(xiàn),未在大于4月齡以上的奶牛中發(fā)現(xiàn)。另外,腹瀉陽性樣品中主要是牛隱孢子蟲,其次是微小隱孢子蟲,非腹瀉樣品中主要是微小隱孢子蟲(表5)。

表3 寧夏地區(qū)奶牛隱孢子蟲感染情況和感染蟲種

表4 不同月齡奶牛隱孢子蟲的感染率和感染蟲種

表5 不同糞便性狀樣品中隱孢子蟲的感染率和感染蟲種

2.3 隱孢子蟲蟲種在寧夏奶牛中的系統(tǒng)發(fā)育分析

基于SSUrRNA基因?qū)幭牡貐^(qū)奶牛隱孢子蟲進行系統(tǒng)發(fā)育分析,結果表明本研究獲得的樣品序列(C.parvumNX cattle,C.bovisNX cattle,C.ryanaeNX cattle和C.andersoniNX cattle)分別與微小隱孢子蟲、牛隱孢子蟲、瑞氏隱孢子蟲和安氏隱孢子蟲位于同一分支上,進一步證實本研究中寧夏奶牛中隱孢子蟲分離株為微小隱孢子蟲、牛隱孢子蟲、瑞氏隱孢子蟲和安氏隱孢子蟲,本研究的部分隱孢子蟲序列用黑色三角形表示(圖3)。

注:黑色三角代表本研究檢出的隱孢子蟲基因型

2.4 寧夏不同地區(qū)奶牛中微小隱孢子蟲的亞型分布

針對136份微小隱孢子蟲陽性樣品基因組DNA基于gp60基因的套式PCR檢測微小隱孢子蟲的基因亞型(圖2),并分別經(jīng)NCBI BLAST序列比對。共檢測出4種基因亞型,其中IIdA15G1感染率為51.5%(70/136),IIdA18G1感染率為19.1%(26/136),IIdA19G1感染率為17.0%(23/136),IIdA20G1感染率為12.5%(17/136)(表6)。在寧夏4個地區(qū)奶牛中,IIdA15G1微小隱孢子蟲是導致奶牛感染的優(yōu)勢蟲種。同樣IIdA15G1微小隱孢子蟲也是0～2月齡和3～4月齡奶牛以及腹瀉樣品和非腹瀉樣品中的優(yōu)勢蟲種(表6)。

表6 微小隱孢子蟲亞型及其分布

3 討論

我國是奶牛養(yǎng)殖大國,寧夏地區(qū)是全國奶業(yè)的優(yōu)勢產(chǎn)區(qū),是公認的“黃金奶源帶”。截至2020年,寧夏地區(qū)的奶牛存欄量位居全國第8位[11]。隨著規(guī)模化奶(肉)牛養(yǎng)殖業(yè)迅猛發(fā)展,由隱孢子蟲等寄生蟲感染引起的奶牛腹瀉和呼吸道疾病發(fā)病率和死亡率急劇攀升,嚴重威脅地區(qū)的公共衛(wèi)生安全。在本次調(diào)查中,寧夏地區(qū)奶牛隱孢子蟲的感染率為28.5%,顯著高于之前其他地區(qū)如甘肅(4.2%)[12]、新疆(16.0%)[13]、廣東省(4.4%)[14]、湖北省(15.5%)[15]、四川省(14.4%)[16]、江西省(12.8%)[17]和河南省(25.1%)[18]報道的奶牛中隱孢子蟲的感染率,但低于黑龍江省(47.7%)[19]奶牛隱孢子蟲的感染率。此外,不同地區(qū)的優(yōu)勢蟲種不同,本此調(diào)查中發(fā)現(xiàn)微小隱孢子蟲是導致寧夏地區(qū)奶牛感染的優(yōu)勢蟲種,這與關于河南省和黑龍江省的報道中牛隱孢子蟲是優(yōu)勢蟲種不同。造成這些不同可能與不同地區(qū)奶牛養(yǎng)殖場的飼養(yǎng)管理以及樣品診斷方法和采樣季節(jié)等多種因素相關。在本研究中,通過對不同月齡奶牛的糞樣進行檢查和分析發(fā)現(xiàn)不同月齡隱孢子蟲感染率差異顯著,其中0～2月齡犢牛隱孢子蟲感染率最高,優(yōu)勢蟲種為微小隱孢子蟲。諸多學者研究表明,微小隱孢子蟲是斷奶前犢牛感染的主要蟲種,斷奶后犢牛、育成牛和12月齡以上奶牛主要感染牛隱孢子蟲、安氏隱孢子蟲和瑞氏隱孢子蟲[20],這與本研究結果一致。本研究基于微小隱孢子蟲gp60基因的序列分析中發(fā)現(xiàn)微小隱孢子蟲的亞型主要為ⅡdA15G1、ⅡdA18G1、ⅡdA19G1和ⅡdA20G1,其中ⅡdA15G1是不同地區(qū)、不同月齡以及不同性狀糞便檢測到最多的,其在寧夏地區(qū)也廣泛流行[21],同本研究結果一致。

近年來,在綠色養(yǎng)殖理念的指導下,減抗在養(yǎng)殖中得到深入的開展,但是由于尚未有效的替抗產(chǎn)品的出現(xiàn),集約化養(yǎng)殖中牛隱孢子蟲的發(fā)病率和死亡率也呈上漲的趨勢[22],如何有效控制奶牛腹瀉病的發(fā)生和發(fā)展成了亟待解決的問題。本研究通過系統(tǒng)的研究了寧夏部分地區(qū)集約化奶牛場隱孢子蟲的流行病學特征及其基因型的分布情況,初步揭示了寧夏地區(qū)奶牛中隱孢子蟲潛在的公共衛(wèi)生安全風險,從而為進一步制定針對隱孢子蟲感染的高效防控方案提供理論依據(jù)。