劉佳寧 李夢 楊新森 吳偉 裴新梧 袁潛華

（1.海南大學熱帶農(nóng)林學院，?？?570228；2.中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究所，北京 100089）

海南山欄稻是黎族人民在長期實踐中選育出來的一種獨特旱稻，具有極其重要的應用價值［1-2］，然而山欄稻的栽培方式單一，傳統(tǒng)的刀耕火種種植手段破壞環(huán)境，當?shù)卣衙髁罱篃綒Я?，山欄稻的種植面積逐年減少，品種失傳率升高［3-4］。為進一步發(fā)展山欄稻產(chǎn)業(yè)，摒棄刀耕火種的種植模式，使這一傳統(tǒng)民族產(chǎn)業(yè)得以發(fā)揚光大，有必要探索新的種植方式，山欄稻水作栽培是山欄稻種植的新模式。

山欄稻水作栽培方式可以有效地減少干旱脅迫，優(yōu)化農(nóng)藝性狀，縮短生育期，顯著增加山欄稻產(chǎn)量。山欄稻水作栽培還顯著提高了劍葉光合速率和孕穗期葉綠素含量。相較于傳統(tǒng)旱作栽培，山欄稻水作栽培提高了稻米加工研磨品質，降低了蒸煮食味品質，而外觀品質沒有明顯變化［5-7］。

根際土壤微生物被稱為植物的第二基因組，對植物至關重要［8］。在田間條件下，地理位置和耕作方式是造成土壤微生物群落變異的主要因素［9］。研究發(fā)現(xiàn)水田和旱地水稻顯著改變了總體細菌和真菌群落組成，從水田到旱地，根系微生物多樣性大大降低，不同的環(huán)境條件和水稻生態(tài)型導致了根系微生物群落的重組［10］。短期不同耕作方式的水稻根際土壤微生物群落結構和多樣性存在差異，不同處理下微生物群落分布受土壤pH 值、有機質、堿解氮和速效磷影響［11］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，根際土壤微生物可以影響宿主的營養(yǎng)發(fā)育和免疫［12-13］，對提高作物產(chǎn)量［14］、維持生態(tài)系統(tǒng)平衡和促進綠色農(nóng)業(yè)發(fā)展具有重大意義［15-16］。同時，土壤微生物在不同栽培方式的變化情況也越來越受到學者的關注。水作和旱作是水稻的兩種主要栽培方式，并且細菌相較于真菌對土壤含水量的改變更加敏感［17-18］，所以本試驗采取不同水分管理栽培方式模擬山欄稻水作和旱作栽培，重點關注根際土壤細菌群落的變化情況，并結合根際土壤理化性質進行分析。

前人針對山欄稻水作栽培做了許多研究，包括對山欄稻水作后的抗病性、源庫流特性、光合作用和產(chǎn)量的研究，但還沒有對山欄稻水作后根際微生物群落的變化開展研究。本試驗研究了山欄稻在不同水分管理栽培方式下的根際土壤細菌群落的變化，分析了土壤理化特性對根際土壤細菌群落豐度的影響，探究山欄稻在不同水分管理栽培方式下根際土壤細菌群落的變化機制，為山欄稻大田水作栽培技術的應用與推廣提供技術支撐，促進山欄稻的發(fā)展和應用。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗選用3 個秈稻品種（灣嶺5 號、黑米白沙、黃葉稻）和3 個粳稻品種（灣嶺2 號、灣嶺3 號、灣嶺4 號）作為材料。其中黃葉稻為西南地區(qū)傳統(tǒng)旱稻，其余均為海南山欄稻。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計與栽培管理 實驗在海南省?？谑忻捞m區(qū)人民大道58 號海南大學農(nóng)科基地（北緯20.05°，東經(jīng)110.32°）開展，本地屬熱帶季風性氣候，年平均氣溫、降水量和平均日照時長分別是24.3℃、2 067 mm 和2 000 h；地塊肥力中等，土壤為砂壤土，有機質含量為 14.13 g/kg，堿解氮含量 94.3 mg/kg，有效磷含量為 24.38 mg/kg，速效鉀含量為 135.51 mg/kg，pH 值為5.68。試驗田以水泥田埂分隔開，分別由獨立的灌溉和排水系統(tǒng)進行水分管理。采用雙因素隨機區(qū)組設計，設置品種和水分2 個因素，每個處理組合隨機排列并設置3 次重復，共36 個小區(qū)，每個小區(qū)面積為1.8 m2（1.5 m×1.2 m）。實驗材料種植的行距為25 cm，株距為20 cm，每個小區(qū)種植5 行，每行種植7 株。

水稻種子浸種、催芽后，育秧至三葉一心至四葉一心時再移栽到2 個田塊中，正常灌溉處理除了分蘗期曬田，其他生育期保持深約 3-5 cm 的水層，成熟期讓水自然落干；干旱管理處理分蘗期曬田后，其他生育期均不進行灌水，降雨后及時進行排水，保持田塊干旱狀態(tài)。各處理播種前按3 000 kg/hm2的量施有機肥作為底肥，撒施粉粒狀有機肥后用旋耕機旋耕田地，松土的同時將有機肥旋打均勻，各處理于分蘗期再追施 1 次尿素（150 kg/hm2）。田間雜草和病蟲害的防治按照常規(guī)水稻的管理方式進行。

1.2.2 根際土壤微生物采集、文庫的構建和高通量測序 每個品種分別在正常灌溉、干旱管理處理中隨機選取3 株水稻，剪掉植株上半部分，輕輕搖晃根部，抖落掉大塊土壤，戴無菌手套進行揉捏，繼續(xù)搖晃根部。將根放入裝有25 mL PBS 緩沖液的50 mL 離心管中，渦旋振蕩15 s。用滅過菌的鑷子將根轉移至一個新的裝有25 mL PBS 緩沖液的50 mL 離心管中，繼續(xù)渦旋振蕩15 s。將2 個50 mL 離心管中收集到的土壤懸濁液用100 μm 尼龍網(wǎng)過濾至另一個新的50 mL 離心管中，10 000 r/min 離心5 min，倒掉上清液，離心管中的沉淀則為收集到的根際土，液氮速凍后放于?80℃冰箱內進行保存。根際土壤采集完成后，將樣品送至百邁客生物科技有限公司，采用3 代16S 測序技術進行測序，按照測序要求使用百邁客云的微生物多樣性平臺分析根際微生物多樣性。

1.2.3 土壤理化性質的測定和分析 分別于2 個不同水分管理栽培處理的2 個田塊隨機取地下20 cm處的土樣，混樣后分成3 份，置于通風處晾干后用于測定土壤理化性質。土壤pH 值采用pH 計測定。有效鉀（available k，AK）的測定參考NY/T 889?2004，采用NH4OAc 溶液浸提，再用火焰光度法進行測定。有效磷（available P，AP）的測定參考NY/T 1121.1?2014，采用NaHCO3溶液浸提，然后鉬銻抗比色法進行測定。有機質（organic matter，OM）的測定參考DB12/T961?2020，采用直接加熱法測定有機質含量。堿解氮（alkeline?n，AN）的測定參考NY/T 1121.24?2012 進行測定。全氮（total nitrogen，TN）的測定采用凱式定氮法測定。測得數(shù)據(jù)后使用SPSS 進行分析。

2 結果

2.1 不同水分管理栽培方式山欄稻根際細菌群落特征比較

根際土壤樣品測序、識別后共獲得479 313 條CCS（circular consensus sequencing）序列，每個樣品至少產(chǎn)生了9 046 條CCS 序列，平均產(chǎn)生13 314 條CCS 序列。使用Usearch 軟件對Reads 在97.0%的相似度水平下進行聚類，共獲得7 418 個OTU（opera?tional taxonomic units）。優(yōu)勢細菌門為Proteobacteria、Firmicutes、Desulfobacterota，不同水分管理栽培方式改變了細菌群落的相對豐度但并未改變優(yōu)勢群落的種類（圖1）。根際細菌群落的α 多樣性不受水分的調節(jié)，兩種栽培方式的Shannon 指數(shù)和Chao1 指數(shù)都未達到顯著差異水平（圖2）。PCoA（主坐標分析）和PERMANOVA（置換多元方差分析）結果發(fā)現(xiàn)不同水分管理栽培處理對山欄稻根際土壤細菌群落組成有較大影響（圖3-4），栽培處理和品種都對根際土壤細菌群落組成有顯著影響，栽培處理對根際細菌群落的影響較大（R2= 0.442，P = 0.001），品種對根際土壤細菌群落的影響較?。≧2= 0.187，P= 0.004）；栽培處理是影響根際土壤細菌群落的主要因素（圖4）。

圖1 不同水分管理處理對根際土壤細菌群落門水平相對豐度的影響Fig.1 Effect of irrigated and drying treatment on the relative abundance of bacterial community in rhizosphere soil at phylum level

圖2 不同水分管理處理的Alpha 多樣性指數(shù)差異箱線圖Fig.2 Box graph of differences in alpha diversity index between irrigated and drying treatment groups

圖3 PcoA 分析Fig.3 PcoA analysis

圖4 PERMANOVA 分析箱型圖Fig.4 PERMANOVA analysis box diagram

2.2 不同水分管理栽培方式山欄稻根際細菌群落物種進化樹分布

挑選出相對豐度TOP80 的特征序列構建系統(tǒng)進化樹，這些OTU 分布在12 個細菌門，除了未分類細菌以外，變形桿菌門（19 個OTU）、脫硫菌門（13個OTU）、厚壁菌門（11 個OTU）、硝化螺旋菌門（10個OTU）、擬桿菌門（9 個OTU）分別為前五的細菌門。可以看出大部分核心OTU 之間的豐度比例有較大差異，極個別核心OTU 豐度比例差異極大，說明不同水分管理栽培處理對這些相對豐度較高的核心群落產(chǎn)生了較大的影響（圖5）。

2.3 不同水分管理栽培方式山欄稻根際細菌群落組成比較

為了研究不同水分管理栽培方式的樣品間根際土壤細菌群落豐度的差異，使用Metastats 軟件對2個處理的物種豐度數(shù)據(jù)進行t 檢驗得到P 值，根據(jù)P 值篩選出導致兩組樣品組成差異的物種，在門水平達到顯著差異的群落共有19 個門（表1），結果表 明Acidobacteriota、Armatimonadota、Fibrobactero?ta、Myxococcota、Gemmatimonadota、Verrucomicrobi?ota、Firmicutes 在正常灌溉中的相對豐度顯著高于干旱 管 理；Bdellovibrionota、Sumerlaeota、Planctomy?cetota、Dadabacteria、Dependentiae、Entotheonellae?ota、Patescibacteria、Nitrospirota、Methylomirabilota、Calditrichota、Proteobacteria、Hydrogenedentes 在 正常灌溉中的相對豐度顯著低于干旱管理。其中相對豐度前10 的菌門中，Acidobacteriota、Myxococcota、Verrucomicrobiota、Firmicutes 在正常灌溉中的相對豐度顯著高于干旱管理；Nitrospirota、Proteobacteria在正常灌溉中的相對豐度顯著低于干旱管理。

表1 不同水分管理栽培處理顯著差異的細菌門群落Table 1 Bacterial phylum communities with significant differences in different water management cultivation treatments

2.4 土壤理化性質與根際土壤細菌群落的相關性分析

為了明確不同水分管理栽培方式對山欄稻根際土壤的影響，測定了影響土壤理化性質的相關指標，使用SPSS 進行獨立樣本t 檢驗，結果顯示干旱管理栽培處理土壤中的氮、磷和有機質含量顯著高于正常灌溉栽培，pH、有效鉀含量顯著低于正常灌溉栽培（表2）。對環(huán)境因子與相對豐度前10 的根際土壤細菌門群落進行Pearson 相關性分析，結果表明有效鉀（AK）、pH 為一類；有效磷（AP）、有機質（OM）、堿解氮（AN）、全氮（TN）為一類。細菌門群落聚為3 類，Nitrospirota、Proteobacteria、unclassified_Bacteria 為一類，Verrucomicrobiota、Acidobacteriota、Myxococcota 為 一 類；Bacteroidota、Desulfobacterota、Chloroflexi、Firmicutes 為 一 類。AK、pH 與Nitro?spirota、Proteobacteria、unclassified_Bacteria 顯著負相關。AK、pH 與Verrucomicrobiota、Acidobacteriota、Myxococcota 顯著正相關。AK、pH 與Bacteroidota、Desulfobacterota、Chloroflexi、Firmicutes 正相關，但只與Firmicutes 具有顯著性。AP、OM、AN、TN 與Nitrospirota、Proteobacteria、unclassified_Bacteria 顯著正相關。AP、OM、AN、TN 與Verrucomicrobiota、Acidobacteriota、Myxococcota 顯著負相關。AP、OM、AN、TN 與Bacteroidota、Desulfobacterota、Chlorofle?xi、Firmicutes 負相關，但只有AP、OM 與Chlorofle?xi、Firmicutes、AN 與Firmicutes 具有顯著性（圖6）。

表2 不同水分管理栽培處理土壤環(huán)境因子的差異Table 2 Differences in soil environmental factors under different water management cultivation treatments

圖6 環(huán)境因子與相對豐度前十的細菌門群落的相關性熱圖Fig.6 Heat map of correlation between environmental factors and the top ten bacterial communities with relative abundance

2.5 不同水分管理栽培方式的相關性網(wǎng)絡分析

根據(jù)正常灌溉和干旱管理栽培中根際土壤細菌屬水平群落的豐度以及變化情況，對2 個處理分別進行斯皮爾曼（Spearman）秩相關分析，并篩選相關性大于0.1 且P 值小于0.05 的數(shù)據(jù)構建物種相關性網(wǎng)絡，正常灌溉處理的網(wǎng)絡圖相較于干旱管理處理的網(wǎng)絡圖擁有更多的節(jié)點數(shù)和更大的模塊性，說明正常灌溉處理中有更多的細菌群落相互作用，正常灌溉處理的相關性網(wǎng)絡更復雜（表3，圖7）。

表3 不同水分管理栽培處理相關性網(wǎng)絡屬性Table 3 Network attributes of different water management cultivation treatment

圖7 屬水平各物種網(wǎng)絡圖Fig.7 Network Diagram of various species at the genus level

3 討論

土壤微生物影響作物的生長發(fā)育［19］，栽培方式的改變會顯著影響土壤微生物。不同水分管理栽培方式主要改變了土壤水分，而細菌群落對土壤水分的變化十分敏感［20］。短期不同耕作方式處理下水稻根際土壤微生物群落結構和多樣性存在差異，不同處理下微生物群落分布受土壤pH 值、有機質、堿解氮和速效磷影響［21］。本研究利用16S rRNA 基因擴增序列探究了不同水分管理栽培方式對山欄稻根際細菌群落影響，鑒定了不同栽培方式下顯著差異的細菌屬，并分析了根際細菌群落和根際土壤理化性質之間的關聯(lián)。

本試驗結果顯示，兩種水分管理栽培方式下根際土壤優(yōu)勢細菌門均為Proteobacteria、Firmicutes、Desulfobacterota，不同水分管理栽培方式改變了細菌群落的相對豐度，但并未改變優(yōu)勢群落的種類。不同水分管理栽培方式對山欄稻根際土壤細菌群落的α 多樣性無明顯影響。這一結論與前人研究結果相似，干旱并不直接導致群落的死亡和新的群落的出現(xiàn)，而是保持根際群落的多樣性相對穩(wěn)定［22］。栽培方式顯著地改變了根際細菌群落的組成，PCoA 分析顯示正常灌溉和干旱管理的根際土壤細菌群落組成間存在明顯差異。PERMANOVA 分析的結果顯示栽培處理和品種都對根際土壤細菌群落組成產(chǎn)生了顯著影響，并且栽培處理的影響大于品種的影響。物種進化樹顯示核心OTU 分布在12 個細菌門，大多數(shù)核心OTU 在兩種栽培方式下存在相對豐度差異。前人研究了野生稻和栽培稻根際細菌群落，表明取樣土壤位置是影響根際細菌群落組成的主要因素，其次是品種［23］。水分會顯著影響根際土壤細菌群落的組成［24］。本試驗中，不同水分管理栽培方式導致了土壤水分的差異，顯著影響了山欄稻根際土壤細菌群落的組成，栽培方式的改變是導致山欄稻根際土壤細菌群落組成變化的主要原因。

相對豐度前10 的菌門中，Acidobacteriota、Myxococcota、Verrucomicrobiota、Firmicutes 在 正 常灌溉中的相對豐度顯著高于干旱管理；Nitrospirota、Proteobacteria 在正常灌溉中的相對豐度顯著低于干旱管理。Nitrosprota 是突發(fā)性旱澇交替后施氮條件下調節(jié)水稻根系氮素吸收的關鍵類群，在調節(jié)水稻氮素吸收方面有重要的作用，可能調控水稻脅迫條件下氮素的吸收［25］，Proteobacteria 對植物在干旱條件下的生存起著重要的作用，在干旱條件下Proteobac?teria 群落豐度比水分充足條件下要更高，而Firmi?cutes 群落豐度更低，進一步研究發(fā)現(xiàn)Proteobacteria門參與了碳和氮循環(huán)［26］。本研究中，Nitrosprota 和Proteobacteria 在正常灌溉中的相對豐度顯著低于干旱管理，這可能是由于從干旱管理到正常灌溉，其水分脅迫因素減少，Nitrosprota、Proteobacteria 的相對豐度降低，這證明了Nitrosprota 和Proteobacteria可能是山欄稻應對干旱脅迫的關鍵細菌類群。Ac?idobacteriota、Myxococcota、Verrucomicrobiota、Firmi?cutes 在正常灌溉中的相對豐度高于干旱管理，其中Firmicutes 門有許多厭氧類群或兼性厭氧類群［27］，本試驗中，F(xiàn)irmicutes 門在正常灌溉中相對豐度顯著高于干旱管理，可能是由于正常灌溉的透氣性低于干旱管理，導致這些厭氧類群或兼性厭氧細菌類群相對豐度升高。

不同水分管理栽培方式對土壤理化性質有較大影響，干旱管理栽培土壤的氮、磷和有機質含量明顯高于正常灌溉栽培，pH、有效鉀含量顯著低于正常灌溉栽培。土壤理化性質與相對豐度前十的根際土壤細菌門群落的Pearson 相關性分析表明，豐度前十的細菌門中大多與各環(huán)境因子顯著相關，這與前人研究結果一致，即栽培方式的改變會導致土壤理化性質的顯著改變，進而影響土壤細菌群落組成的變化［28］。特別是AN、TN 與Nitrospirota、Proteobacteria 顯著正相關，說明這2 個細菌類群可能促進氮素的吸收，可能通過促進水稻根部吸收氮素來增強水稻抗逆性［29］。根據(jù)以上結果，山欄稻由干旱管理轉為正常灌溉后，其與氮素吸收相關的群落Nitrospirota、Proteobacteria 豐度降低了。所以在實際生產(chǎn)中，山欄稻由傳統(tǒng)旱作栽培方式轉為水作栽培方式后要適當增施氮肥。

研究表明長期淹水的水生生態(tài)系統(tǒng)增加了細菌多樣性以及物種生態(tài)網(wǎng)絡的交互度和穩(wěn)定性，增強了微生物抵抗外部環(huán)境干擾的能力，有助于維持農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)功能的穩(wěn)定性和可持續(xù)性［30］。本試驗中不同水分管理栽培處理的相關性網(wǎng)絡分析表明，正常灌溉栽培處理的相關性網(wǎng)絡中的細菌屬群落更多，說明正常灌溉栽培處理中更多細菌群落參與物種生態(tài)網(wǎng)絡，這增強了農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)功能的穩(wěn)定性和可持續(xù)性。

4 結論

山欄稻由干旱管理轉為正常灌溉，根際細菌群落組成發(fā)生了顯著變化，一些與植物抗旱性相關的細菌群落如Nitrosprota、Proteobacteria 相對豐度降低；一些厭氧類群或兼性厭氧細菌類群相對豐度升高。不同水分管理栽培方式土壤理化性質差異顯著，影響了土壤細菌群落組成的變化。Nitrospirota、Proteobacteria 可能通過促進水稻根部吸收氮素來增強山欄稻抗逆性。相關性網(wǎng)絡分析表明正常灌溉處理中具有相關性的細菌屬比干旱管理處理多。