QuEChERS-超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定蜂蜜中硝基咪唑類藥物殘留

劉蘭霞 解迎雙 寇宗紅 王波

為了治療和預(yù)防孢子蟲(chóng)病在蜜蜂群體間的傳播，降低蜜蜂的死亡率，硝基咪唑類藥物曾被廣泛應(yīng)用于蜜蜂養(yǎng)殖過(guò)程中。但硝基咪唑類藥物的違用、濫用和誤用現(xiàn)象導(dǎo)致蜜蜂體內(nèi)產(chǎn)生藥物殘留，并以蜂蜜為媒介進(jìn)入人體，對(duì)人體造成致癌、致畸、致突變作用和遺傳毒性損害，因此各國(guó)已相繼禁止硝基咪唑類藥物在動(dòng)物源性食品中的使用。

目前，檢測(cè)硝基咪唑類藥物殘留的方法主要有氣相色譜質(zhì)譜法、液相色譜法等。本研究建立了QuEChERS-超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜法，以檢測(cè)蜂蜜中多種硝基咪唑類藥物的殘留，對(duì)維護(hù)食品安全、保障消費(fèi)者身體健康具有重要意義。

一、儀器與方法

1.儀器與設(shè)備。高效液相色譜儀，美國(guó)沃特世公司；多管渦旋振蕩器，深圳逗點(diǎn)生物技術(shù)有限公司；低溫冷凍高速離心機(jī)，德國(guó)Sigma公司。

2.試劑與材料。甲醇、乙腈、甲酸、氨水（色譜純），德國(guó)默克公司；丙基乙二胺（PSA）粉末、十八烷基鍵合硅膠（C18）粉末、石墨化炭黑（GCB）粉末，美國(guó)安捷倫公司；無(wú)水硫酸鎂、無(wú)水氯化鈉，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；超純水，本實(shí)驗(yàn)室純水儀制備；32種硝基咪唑類化合物（純度＞99%），德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司；蜂蜜，購(gòu)自當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場(chǎng)或超市，于-20℃冷凍保存，待用。

3.標(biāo)準(zhǔn)溶液配置。（1）標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（濃度100mg/L）。精密稱取32種硝基咪唑類化合物0.01g，用甲醇溶解后，定容至100mL容量瓶?jī)?nèi)，配制成質(zhì)量濃度為100mg/L的單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，置于-20℃冰箱中保存6個(gè)月。

（2）混合標(biāo)準(zhǔn)工作液（濃度1mg/L）。精密量取濃度為100mg/L的上述標(biāo)準(zhǔn)溶液100μL于100mL容量瓶中，用甲醇-水（8∶2）定容，于4℃保存。

4.樣品前處理。（1）提取。準(zhǔn)確稱取5.00g（精確至0.01g）蜂蜜樣品于50mL具塞離心管中，加入5mL水，渦旋5min，使其充分混勻。加入10mL 0.1%氨水-乙腈，渦旋提取5min，超聲提取10min。加入2g氯化鈉渦旋1min，加入4g無(wú)水硫酸鎂渦旋3min，于4℃、12000r/min離心5min。準(zhǔn)確移取上清液5.00mL于另一15mL離心管中，于30℃氮?dú)獯禎饪s至近干，待復(fù)溶，凈化。

（2）凈化。加入1.00mL乙腈復(fù)溶，依次加入50mg PSA、50mg C18、150mg MgSO4渦旋混合1min，以12000r/min離心5min，取上清液于30℃下氮?dú)獯抵两?，加?.00mL 80%甲醇-水溶液復(fù)溶，渦旋混合1min，過(guò)0.22μm濾膜于進(jìn)樣瓶中，上機(jī)檢測(cè)。

5.儀器條件。（1）色譜條件。色譜柱：C18色譜柱（100mm×2.1mm 2.7μm）；柱溫：25℃；流速：0.2mL/min；進(jìn)樣量：5μL；流動(dòng)相：A為甲醇溶液，B為水溶液；梯度洗脫程序：0-5min（5%-10% A），5-20min（10%-40% A），20-25min（40%-90% A），25-26min（90%-5% A），26-30min（5% A）。

（2）質(zhì)譜測(cè)定條件。離子源：ESI源；采集模式：正離子模式；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；毛細(xì)管電壓：3.2kV；離子源溫度：150℃；脫溶劑溫度：350℃；脫溶劑氣流速：500L/Hr；錐孔氣流速：50L/Hr；碰撞氣（氮?dú)猓┝魉伲?0μL/min；其他MRM參數(shù)見(jiàn)表1。

二、結(jié)果與討論

1.樣品提取方式的選擇。本實(shí)驗(yàn)在考察了稱取樣品后，采用了直接加提取試劑提取、用水溶解后再提取試劑兩種方法對(duì)蜂蜜樣品進(jìn)行預(yù)處理。結(jié)果表明：采用第一種方法，硝基咪唑類化合物的回收率較低，在45%-60%；第二種方法的回收率較高，為70%-110%。

2.提取溶劑的選擇。本實(shí)驗(yàn)考察了乙酸乙酯、0.1%乙酸乙腈、0.1%甲酸乙腈、0.1%氨水乙腈（V/V）4種提取溶劑的提取效果，見(jiàn)圖1。根據(jù)圖1可知，選用乙酸乙酯作提取溶劑時(shí)，后期鹽析效果較差，會(huì)影響實(shí)驗(yàn)的回收率，甲硝唑、哌莫硝唑、帕硝唑、卡硝唑、非昔硝唑的回收率均小于40%；選用0.1%乙酸乙腈作為提取溶劑時(shí)，帕硝唑、非昔硝唑的回收率小于30%；選用0.1%甲酸乙腈作為提取溶劑時(shí)，哌莫硝唑、帕硝唑、特尼噠唑、非昔硝唑的回收率均小于20%，米索硝唑的回收率高達(dá)140%；選用0.1%氨水乙腈作為提取溶劑時(shí)，硝基咪唑類化合物的回收率在71.90%-105%，符合方法學(xué)考察的要求，因此本研究選擇0.1%氨水乙腈作為提取溶劑。

3.提取條件的選擇與優(yōu)化。本實(shí)驗(yàn)采用超聲提取法、渦旋法、超聲提取法與渦旋法組合提取三種方式進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)條件分別為：超聲提取：5min、10min、15min；渦旋：3min、5min、10min；超聲與渦旋組合方式：5+3min、5+5min、5+10min、10+3min、10+5min、10+10min、15+3min、15+5min、15+10min。以硝基咪唑類化合物的回收率為指標(biāo)，選擇最優(yōu)實(shí)驗(yàn)方案，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。根據(jù)圖2可知，單一的超聲、渦旋提取方式下硝基咪唑類化合物的回收率均小于組合式。在超聲+渦旋的組合方式中，蜂蜜在超聲5min時(shí)易產(chǎn)生大量泡沫，會(huì)影響下一步實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性及最終結(jié)果的回收率；隨著超聲時(shí)間的增加，泡沫會(huì)逐漸減少。最后以渦旋5min、超聲提取10min為組合的提取方式為最優(yōu)實(shí)驗(yàn)方案，硝基咪唑類化合物的回收率在72%-110%。

三、結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)色譜柱、流動(dòng)相等色譜條件進(jìn)行優(yōu)化，以0.1%氨水乙腈為提取溶劑，采用渦旋震蕩-超聲聯(lián)合提取法進(jìn)行提取，使用PSA、C18、GCB、MgSO4進(jìn)行凈化，建立了QuEChERS-UPLC-MS/MS法，同時(shí)檢測(cè)了蜂蜜中多種硝基咪唑類藥物的殘留。該方法簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確，靈敏度高、準(zhǔn)確性好，有效降低了目標(biāo)化合物的基質(zhì)干擾，增加了同時(shí)檢測(cè)硝基咪唑類原藥的數(shù)量，可為蜂蜜樣品的質(zhì)量評(píng)價(jià)研究提供理論基礎(chǔ)。

基金項(xiàng)目：甘肅省市場(chǎng)監(jiān)督管理局科技計(jì)劃項(xiàng)目：“基于機(jī)器學(xué)習(xí)算法對(duì)靖遠(yuǎn)羊肉元素的分析及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模型的建立”（SSCJG-SP-A202306）。

作者簡(jiǎn)介：劉蘭霞（1968-），女，漢族，甘肅白銀人，大學(xué)本科，研究方向?yàn)槭称钒踩珯z測(cè)。

*通信作者：王波（1982-），男，漢族，甘肅隴南人，博士，研究方向?yàn)槭称钒踩珯z測(cè)和藥物學(xué)分析。