脂肪酶產(chǎn)酸特性對(duì)UHT牛奶質(zhì)量的影響研究

趙美霞 巴根納 樊啟程 賀保平 楊紅彥 高瑞雄

UHT滅菌乳是將生鮮牛奶經(jīng)預(yù)熱、均質(zhì)，在連續(xù)流動(dòng)的情況下加熱到至少132℃以上，保持4-6s殺菌，最后進(jìn)行無(wú)菌灌裝。這是不需要冷鏈儲(chǔ)藏、運(yùn)輸?shù)某匾簯B(tài)奶產(chǎn)品，保質(zhì)期在常溫狀態(tài)下可以達(dá)到6-9個(gè)月。

牛奶中的酸度分為固有酸度和外來(lái)酸度，固有酸度來(lái)源于牛奶本身的酸度，由牛奶中的固有檸檬酸、二氧化碳物質(zhì)溶于水相中而產(chǎn)生；外來(lái)酸度來(lái)源于牛奶中的微生物產(chǎn)生，如細(xì)菌、霉菌、酵母菌、蠟樣芽孢桿菌、嗜冷菌代謝產(chǎn)生的脂肪酶作用于牛奶中的脂肪而產(chǎn)生游離脂肪酸，給牛奶帶來(lái)外來(lái)酸度。脂肪酶產(chǎn)生的脂肪酸會(huì)對(duì)牛奶產(chǎn)品質(zhì)量產(chǎn)生較大影響，一方面導(dǎo)致產(chǎn)品酸度升高，當(dāng)酸度增加到一定程度，pH會(huì)隨之降低到一定值，使牛奶中的酪蛋白發(fā)生酸凝固或酸弱凝膠，牛奶體系發(fā)生崩解，導(dǎo)致牛奶質(zhì)量變劣；另一方面，脂肪酶將牛奶中脂肪甘油酯水解成次級(jí)產(chǎn)物，產(chǎn)生酸苦味道，導(dǎo)致牛奶風(fēng)味變劣。產(chǎn)脂肪酶的常見(jiàn)微生物有三類，包括細(xì)菌類、酵母類、真菌類，本文重點(diǎn)研究細(xì)菌來(lái)源的脂肪酶產(chǎn)酸特性對(duì)UHT牛奶質(zhì)量的影響。

一、材料和設(shè)備

1.試劑。純水、硫酸鈷比色試劑、酚酞試劑（5g/mL）、0.1N的NaOH溶液。

2.原料。無(wú)水奶油/粉、酵母浸膏、硫酸鎂、瓊脂。

3.實(shí)驗(yàn)器材。高壓蒸汽滅菌鍋、0.2?m無(wú)菌過(guò)濾器、無(wú)菌瓶、微生物培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、千分之一感量天平、牛津杯。

4.脂肪酶樣液。脂肪酶標(biāo)品（來(lái)源于酵母菌發(fā)酵，6%含量）、含脂肪酶牛奶無(wú)菌樣液。

二、實(shí)驗(yàn)與方法

1.脂肪酶標(biāo)品對(duì)UHT牛奶質(zhì)量的影響驗(yàn)證。（1）制備0.6%脂肪酶標(biāo)品無(wú)菌液。準(zhǔn)確稱取6g脂肪酶標(biāo)品，加入純凈水194g，充分搖勻，制備成0.6%脂肪酶溶液。通過(guò)0.2?m除菌濾膜過(guò)濾，制成脂肪酶無(wú)菌液。

（2）將脂肪酶無(wú)菌加入U(xiǎn)HT牛奶中的酸度和口感變化情況。在超凈環(huán)境下，將UHT純牛奶分裝在無(wú)菌瓶中，每瓶200mL，按照150ppm、15ppm、12ppm、9ppm、7.5ppm、6ppm、1.8ppm、1.5ppm、0.15ppm梯度濃度，在純牛奶中接入脂肪酶無(wú)菌液。在42℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時(shí)-10天，記錄牛奶樣品酸度變化、口感變化。結(jié)果如表1-表4所示。

（3）測(cè)定滴定酸度。以牛奶吉爾涅爾酸度表征，滴定方法為通過(guò)耗用NaOH溶液的毫升數(shù)來(lái)表征牛奶中的酸度。UHT滅菌乳中的酸度范圍一般為14oT-17oT，當(dāng)pH處于6.30以下時(shí)，滴定酸度會(huì)上升至20oT以上。

2.含有脂肪酶的樣液產(chǎn)酸判定。基于脂肪酶標(biāo)品對(duì)UHT牛奶質(zhì)量影響的研究結(jié)果，可以得出脂肪酶對(duì)牛奶質(zhì)量產(chǎn)生較大影響的結(jié)論。當(dāng)牛奶可能受到脂肪酶污染時(shí)，可以通過(guò)脂肪酶產(chǎn)酸判定實(shí)驗(yàn)來(lái)完成牛奶中含有脂肪酶的定性判定。對(duì)標(biāo)標(biāo)品酶對(duì)牛奶質(zhì)量的影響結(jié)果，可以預(yù)判并完成牛奶樣品的脂肪酶在貨架期后期會(huì)對(duì)牛奶產(chǎn)生哪些影響。

（1）脂肪酶樣液產(chǎn)酸培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。將無(wú)水奶油/粉、酵母膏、硫酸鎂、瓊脂、純水配置成培養(yǎng)基，pH為6.80-7.90，加入1%的中性紅顯色劑，經(jīng)過(guò)121℃、15min高壓滅菌鍋滅菌后，在超凈臺(tái)上倒入平皿中。冷卻至室溫時(shí)，將無(wú)菌牛津杯放入平皿中，在牛津杯中加入100uL含脂肪酶牛奶無(wú)菌液。同時(shí)，設(shè)置1.5%瓊脂+98.5%純水的瓊脂平皿對(duì)照樣，將平皿放置在42℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10-24h。

（2）產(chǎn)酸結(jié)果判定。觀察牛津杯周圍培養(yǎng)基是否變?yōu)榧t色，變?yōu)榧t色且空白平皿樣未變色判定為陽(yáng)性，記錄為“+”，說(shuō)明樣液中含有脂肪酶，反之則為“-”。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5和圖1所示，由此可以判定，該脂肪酶樣液加入牛津杯后，牛津杯周圍培養(yǎng)基出現(xiàn)明顯的紅色區(qū)域，說(shuō)明脂肪酶樣液中的脂肪酶水解了培養(yǎng)基中的無(wú)水奶油，產(chǎn)生游離酸，游離酸使得牛津杯附近培養(yǎng)基的pH下降，培養(yǎng)基中的指示劑顏色發(fā)生變化。

圖1：脂肪酶產(chǎn)酸實(shí)驗(yàn)結(jié)果

（3）酸度對(duì)牛奶質(zhì)量的影響。脂肪酶的種類和來(lái)源不同，對(duì)牛奶質(zhì)量的影響是否與標(biāo)樣脂肪酶一致，需要做比對(duì)分析。本研究中的脂肪酶標(biāo)品為褶皺假絲酵母經(jīng)生物發(fā)酵、富集、純化工業(yè)化制備而成，而脂肪酶無(wú)菌牛奶樣液為原奶受到細(xì)菌污染而產(chǎn)生的脂肪酶經(jīng)提取工藝富集、制備而成。兩者雖然同為脂肪酶，但是來(lái)源完成不同，對(duì)牛奶質(zhì)量的影響是否相同就需要通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行比對(duì)分析。

檢測(cè)脂肪酶樣液和脂肪酶標(biāo)品的脂肪酶活力時(shí)，采用脂肪酶活性試劑盒微量法。檢測(cè)試劑中的4-硝基苯棕櫚酸酯在脂肪酶作用下產(chǎn)生4-硝基苯酚，在400nm處檢測(cè)吸收值，計(jì)算出酶活力（U/mL）。以UHT牛奶中可允許的牛奶脂肪酶無(wú)菌樣液添加量為上限值，設(shè)定梯度，將無(wú)菌樣液回填至UHT牛奶中，考察無(wú)菌樣液對(duì)牛奶質(zhì)量的影響。結(jié)果如表6所示。

由此可以看出，牛奶中提取到的脂肪酶按照不同添加量回填至牛奶中，隨著貨架期的延后，都表現(xiàn)出了酸度不斷提升、口感差異的現(xiàn)象。添加量越大的樣品，其酸度上升的時(shí)間越早，持續(xù)上升程度越大。但是添加量最低的樣品風(fēng)味變化呈正相關(guān)，牛奶的香味逐漸增強(qiáng)。

3.脂肪酶差異分析。對(duì)比發(fā)現(xiàn)，微生物發(fā)酵來(lái)源的脂肪酶和牛奶中來(lái)源的脂肪酶對(duì)牛奶質(zhì)量表現(xiàn)出了相同的影響規(guī)律，即將脂肪三甘油酯水解成游離脂肪酸，導(dǎo)致牛奶酸度和風(fēng)味發(fā)生變化。但是二者在分子微觀結(jié)構(gòu)上是否存在差異需要進(jìn)一步分析，這對(duì)牛奶中脂肪酶的提取工藝、去除工藝都具有理論指導(dǎo)意義。

采用凝膠色譜分析（GPC）的方法，對(duì)兩種酶進(jìn)行上柱檢測(cè)，流出曲線結(jié)果如圖2、圖3所示。分析峰面積分布情況可以看出，微生物發(fā)酵的脂肪酶相對(duì)分子量較大（1-1187KMn），而牛奶中提取的脂肪酶相對(duì)分子量較小（1-841KMn），因此，制備、分離這兩種酶的超濾膜孔徑在選擇上就大不相同。由此可見(jiàn)，在微觀分子角度，這兩種酶差異明顯。

綜上所述，脂肪酶會(huì)對(duì)牛奶質(zhì)量產(chǎn)生較大影響，持續(xù)產(chǎn)酸的特性會(huì)直接導(dǎo)致牛奶品質(zhì)變劣，對(duì)企業(yè)造成不可逆轉(zhuǎn)的經(jīng)濟(jì)損失，所以是牛奶生產(chǎn)加工過(guò)程中要重點(diǎn)管控的一項(xiàng)內(nèi)容。不同來(lái)源的脂肪酶相對(duì)分子量不同，依據(jù)分子量分布，企業(yè)應(yīng)該選取合適的分離膜孔徑，以分離、去除脂肪酶。