脂肪酶催化制備長(zhǎng)短鏈甘油三酯的工藝研究

葉雙 王宏雁

本研究借鑒前人研究，在無溶劑介質(zhì)中通過脂肪酶催化大豆油和丁酸乙酯酯交換反應(yīng)，以丁酸插入率為指標(biāo)，探究合成長(zhǎng)短鏈甘油三酯的最佳反應(yīng)條件，豐富了國(guó)內(nèi)對(duì)大豆油改性制備低熱量結(jié)構(gòu)脂質(zhì)的全面研究。

一、材料與儀器

1.材料。大豆油，浙江益海嘉里食品工業(yè)有限公司；丁酸乙酯（純度＞98%），天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；固體脂肪酶Novozyme 435，諾維信生物技術(shù)有限公司；丁酸甲酯，上海Merck公司；正己烷及其他有機(jī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純或色譜純。

2.儀器。SHA-C數(shù)顯水浴恒溫振蕩器，常州丹瑞實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司；氣相色譜儀，美國(guó)安捷倫公司；BS224S電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；離心機(jī)，常州國(guó)華電器有限公司。

二、實(shí)驗(yàn)與方法

1.長(zhǎng)短鏈脂肪酸甘油三酯的制備與分離。（1）制備。大豆油與丁酸乙酯的酯交換反應(yīng)在無溶劑體系中進(jìn)行。稱取15g大豆油與一定量的丁酸乙酯置于150mL錐形瓶?jī)?nèi)，混合均勻后加入一定量的固定化脂肪酶Novozyme 435，蓋緊塞子，將其放在恒溫水浴振蕩器中，保持100r/min的振蕩速率，在特定溫度下反應(yīng)4h后終止，過濾除去固體脂肪酶。（2）薄層層析法分離。選用100mm×200mm規(guī)格的硅膠板，對(duì)丁酸乙酯、大豆油和酶催化大豆油與丁酸乙酯合成的長(zhǎng)短鏈甘油三酯產(chǎn)物進(jìn)行TLC分析，參照標(biāo)準(zhǔn)譜圖將對(duì)應(yīng)的長(zhǎng)短鏈甘油三酯條帶刮下，用正己烷萃取2次，加入適量的無水硫酸鈉，然后旋蒸除去正己烷。

2.產(chǎn)物組成分析。采用氣相色譜檢測(cè)方法對(duì)產(chǎn)物組成進(jìn)行分析。稱取0.1g樣品，溶于10mL正己烷中，混合均勻后取1mL置于色譜瓶中進(jìn)行氣相分析。

氣相色譜條件如下：色譜柱DB-1HT毛細(xì)血管（29m×250μm×0.2μm）；載氣N2（純度99.999%）；進(jìn)樣量1，進(jìn)樣口溫度260℃，分流比20：1；氫火焰離子化檢測(cè)器，檢測(cè)口溫度380℃；氫氣流量60mL/min，空氣流量400L/min，尾吹氣流量50mL/min。程序升溫條件如下：溫度80℃，保持2min；以10℃/min的升溫速率持續(xù)加熱至200℃，保持1min；以30℃/min的升溫速率加熱至350℃，保持6min。

3.脂肪酸組成分析。采用甲酯化方法對(duì)脂肪酸組成進(jìn)行分析。稱取100mg分離后的產(chǎn)物，加入0.2mol/L的氫氧化鈉-甲醇溶液2mL，快速混勻，再移取3mL的正己烷震蕩30s，使之充分混合后，放入離心機(jī)離心2min，獲得分層溶液，將上層透明澄清溶液用無水硫酸鈉干燥，然后吸取上清液用于氣相分析。

氣相色譜分析條件如下：BPX70，30m×0.25mm×0.25μm；載氣N2；進(jìn)樣量1；檢測(cè)器溫度250℃，進(jìn)樣口溫度250℃；氮?dú)饬魉?2mL/min，氫氣流速50mL/min，空氣流速400mL/min。程序升溫條件如下：溫度60℃，保持3min；以10℃/min的升溫速率持續(xù)加熱至180℃；以5℃/min的升溫速率加熱至230℃，保持3min。

4.丁酸插入率的測(cè)定。丁酸插入率的計(jì)算公式如下：

三、結(jié)果與討論

1.產(chǎn)物組成分析。圖1為產(chǎn)物甲酯化后的氣相色譜圖。對(duì)照各標(biāo)準(zhǔn)樣品對(duì)產(chǎn)物譜圖進(jìn)行定性分析，丁酸甲酯的保留時(shí)間為2.119min，棕櫚酸甲酯的保留時(shí)間為15.176min，硬脂酸甲酯的保留時(shí)間為16.642min，油酸甲酯的保留時(shí)間為16.905min，亞油酸甲酯的保留時(shí)間為17.383min，亞麻酸甲酯的保留時(shí)間為17.887min。由圖1可以看出，在本實(shí)驗(yàn)選定的反應(yīng)條件下，圖中未出現(xiàn)太多雜峰，且各脂肪酸甲酯的分離情況較好。

圖1：產(chǎn)物甲酯化氣相色譜圖

2.單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析。（1）反應(yīng)時(shí)間對(duì)長(zhǎng)短鏈甘油三酯含量的影響。在丁酸乙酯與大豆油的摩爾比為3：1、反應(yīng)溫度為50℃、加酶量為總底物的9%時(shí)，每次間隔2h進(jìn)行一次產(chǎn)物取樣，以探究制備長(zhǎng)短鏈甘油三酯的最佳反應(yīng)時(shí)間，探究結(jié)果如圖2所示。

圖2：反應(yīng)時(shí)間對(duì)丁酸插入率的影響

由圖2可知，在不同反應(yīng)時(shí)間下進(jìn)行長(zhǎng)短鏈甘油三酯的制備，丁酸插入率發(fā)生了改變。在開始反應(yīng)的10h內(nèi)，隨著時(shí)間的推移，反應(yīng)速度加快，丁酸插入率持續(xù)提升，在反應(yīng)了10h時(shí)，丁酸的插入率達(dá)到12.16%；而在反應(yīng)了10h之后，丁酸插入率反而下降。這是因?yàn)轷ソ粨Q反應(yīng)是一個(gè)對(duì)峙反應(yīng)，也可以用化學(xué)動(dòng)力學(xué)平衡理論對(duì)這種現(xiàn)象進(jìn)行解釋。在反應(yīng)早期，正向反應(yīng)的速率快于反向反應(yīng)的速率，因此丁酸插入率會(huì)不斷增加。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，反向反應(yīng)的速率逐漸增加，正向反應(yīng)的速率逐漸降低，最終達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，這時(shí)反應(yīng)的產(chǎn)物和反應(yīng)物濃度不再發(fā)生變化，所以插入率也不再增加。隨著時(shí)間的推移，由于反向反應(yīng)速率增加，丁酸插入率反而會(huì)下降。綜合考慮，反應(yīng)進(jìn)行10h為最佳，所以本實(shí)驗(yàn)在后續(xù)階段會(huì)把反應(yīng)10h時(shí)的數(shù)據(jù)作為主要數(shù)據(jù)。

（2）加酶量對(duì)長(zhǎng)短鏈甘油三酯含量的影響。在反應(yīng)時(shí)間為10h、丁酸乙酯與大豆油的摩爾比為3：1、反應(yīng)溫度為50℃的反應(yīng)條件下，探究不同反應(yīng)溫度對(duì)制備長(zhǎng)短鏈甘油三酯的影響，探究結(jié)果如圖3所示。

圖3：加酶量對(duì)丁酸插入率的影響

由圖3可知，在加酶量為3%-9%時(shí)，丁酸插入率隨著加酶量的增加而增加，但在加酶量超過9%后，丁酸插入率反而隨著加酶量的提升而降低。在反應(yīng)初期，較高的加酶量會(huì)促進(jìn)酶活性位點(diǎn)提高反應(yīng)速率，導(dǎo)致?；w的摻入量增加。同時(shí)在這一時(shí)期，底物分子與酶分子的結(jié)合比較容易，酶底物復(fù)合物的形成速率較快，使得丁酸插入率隨著加酶量的增加而提升。但當(dāng)加酶量超過一定閾值時(shí)，丁酸插入率反而會(huì)隨著加酶量的增加而降低，這是因?yàn)殡S著反應(yīng)的進(jìn)行，脂肪酶產(chǎn)生聚集，致使底物難以擴(kuò)散，從而導(dǎo)致反應(yīng)速率下降。為了降低生產(chǎn)成本并提高反應(yīng)效率，加酶量控制在9%為最佳。

（3）反應(yīng)溫度對(duì)長(zhǎng)短鏈甘油三酯含量的影響。在反應(yīng)時(shí)間為10h、丁酸乙酯與大豆油的摩爾比為3：1、加酶量為總底物的9%時(shí)，探究不同反應(yīng)溫度對(duì)制備長(zhǎng)短鏈甘油三酯的影響，探究結(jié)果如圖4所示。

圖4：反應(yīng)溫度對(duì)丁酸插入率的影響

由圖4可知，在反應(yīng)溫度為40℃-60℃時(shí)，丁酸插入率顯著提升。根據(jù)Arrhenius定律，反應(yīng)溫度的升高通常導(dǎo)致由酶催化的加速效應(yīng)，由于熱力學(xué)平衡的移動(dòng)，高溫有利于反應(yīng)正向移動(dòng)，較高的溫度也降低了溶液的粘度，減少了傳質(zhì)限制，此時(shí)底物分子與酶分子之間的相互作用增強(qiáng)，酶與底物的結(jié)合力增加，使得酶底物復(fù)合物的形成速率提高。但當(dāng)反應(yīng)溫度超過一定閾值時(shí)，酶會(huì)發(fā)生構(gòu)象變化，酶分子的空間構(gòu)型發(fā)生改變，酶的催化活性會(huì)受到影響；同時(shí)，溫度升高也會(huì)加速酶的失活，降低酶的穩(wěn)定性，使酶分子失去原有的催化能力，從而導(dǎo)致丁酸插入率開始降低。

（4）丁酸乙酯與大豆油的摩爾比對(duì)長(zhǎng)短鏈甘油三酯含量的影響。在反應(yīng)時(shí)間為10h、反應(yīng)溫度為60℃、加酶量為總底物的9%的反應(yīng)條件下，探究丁酸乙酯與大豆油的不同摩爾比對(duì)制備長(zhǎng)短鏈甘油三酯的影響，探究結(jié)果如圖5所示。

圖5：丁酸乙酯與大豆油的摩爾比對(duì)丁酸插入率的影響

酯交換反應(yīng)是一個(gè)可逆反應(yīng)，反應(yīng)平衡是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程，這種平衡僅與起始反應(yīng)物的濃度相關(guān)，即丁酸乙酯與大豆油的摩爾比。由圖5可知，在丁酸乙酯與大豆油的摩爾比在1：1-3：1時(shí)，隨著底物中丁酸的量不斷上升，丁酸插入率顯著提升；但是在丁酸乙酯與大豆油的摩爾比達(dá)到3：1之后，丁酸插入率轉(zhuǎn)為下降。這是因?yàn)樵诙∷嵋阴ヅc大豆油的摩爾比在1：1-3：1時(shí)，丁酸量的增加可以提高丁酸在化學(xué)反應(yīng)中的濃度，從而促進(jìn)丁酸的插入率；但當(dāng)丁酸乙酯與大豆油的摩爾比超過3：1時(shí)，丁酸乙酯的濃度占據(jù)了主導(dǎo)地位，丁酸的濃度相對(duì)降低，從而導(dǎo)致丁酸插入率下降。綜合考慮，選擇丁酸乙酯與大豆油的摩爾比為3：1最合適。

綜上所述，本研究以丁酸乙酯和大豆油為原料，固體脂肪酶Novozyme 435為催化劑，探究了反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、加酶量和底物比率對(duì)大豆油中丁酸插入率的影響。結(jié)果表明，在反應(yīng)時(shí)間為10h、反應(yīng)溫度為50℃、加酶量為9%、丁酸乙酯與大豆油的摩爾比為3：1時(shí)，大豆油中的丁酸插入率最高。

作者簡(jiǎn)介：葉雙（1999-），女，漢族，河南南陽(yáng)人，碩士研究生在讀，研究方向?yàn)橛椭ぁ?/p>

*通信作者：王宏雁（1963-），男，漢族，河南鄭州人，副教授，碩士研究生，研究方向?yàn)閼?yīng)用化學(xué)。