基于非靶向液-質(zhì)聯(lián)用探究杜仲啤酒的有效成分

王雷 唐秋梅 黃寶純 劉宇凡 楊光勇 何光志

自啤酒進(jìn)入我國后，其市場(chǎng)份額呈現(xiàn)爆發(fā)式增長，在促進(jìn)經(jīng)濟(jì)增長的同時(shí)，也被大多數(shù)人接受和喜愛。然而，隨著生活節(jié)奏日益加快和工作壓力持續(xù)增長，人們的飲酒率持續(xù)上漲，由于過度飲酒導(dǎo)致的消化道疾病、心血管疾病等也日益增加，因此可利用一些具有保健功能的藥材，研發(fā)出保健型啤酒以替代普通啤酒。中藥杜仲（Eucommia ulmoides Oliver）具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、安胎的功效，臨床多用于肝腎不足、腰膝酸痛、筋骨無力、頭暈?zāi)垦５劝Y狀。本研究結(jié)合中藥杜仲的優(yōu)勢(shì)和啤酒的特點(diǎn)，利用杜仲研制出保健型啤酒，再利非靶向液-質(zhì)（LC-MC）聯(lián)用對(duì)杜仲啤酒進(jìn)行成分鑒定與分析，以期為杜仲啤酒的開發(fā)提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

一、原料與設(shè)備

1.原料。淺色小麥（德國）、S-33型酵母（德國）、啤酒花（美國）、杜仲（毫州市任大蘭藥業(yè)有限公司）、雪花啤酒（華潤雪花啤酒有限公司，批號(hào)為QS510015030230）。

2.主要試劑。甲醇（67-56-1，≥99.9%，Thermo）；乙腈（75-05-8，≥99.9%，Thermo）；2-氯苯丙氨酸（103616-89-3，98.5%，Aladdin）；甲酸（64-18-6，≥98%，TCI）；甲酸銨（540-69-2，≥99%，Sigma）；H2O（7732-18-5，100%，Milli-Q）。

3.儀器及設(shè)備。電子分析天平（EL104，梅特勒-托列多有限公司）；恒溫水浴鍋（HH-42（0），蘇州威爾實(shí)驗(yàn)用品有限公司）；離心機(jī)（Sorvall Legend 21R，美國Thermo Fisher公司）；糖化鍋（WS-38，廣州偉納斯不銹鋼實(shí)業(yè)有限公司）；發(fā)酵罐（800mL，煙臺(tái)帝伯仕自釀?dòng)邢薰荆?；高壓滅菌鍋（YA28X6T，寧州甬安醫(yī)療器械制造公司）；生化培養(yǎng)箱（LRH-150-Ⅱ，廣東醫(yī)療器械）；麥芽汁糖度計(jì)（1.0-1.1，煙臺(tái)帝伯仕自釀?dòng)邢薰荆?；pH計(jì)（HI2215，哈納儀器（北京）有限公司）；電磁爐（WLK-T1，廣州半球?qū)崢I(yè)有限公司）；冷凍離心機(jī)（H2050-R，湘儀）；混勻儀（QL-866，其林貝爾）；真空濃縮儀（5305，Eppendorf）；濾膜（0.22?m PTFE，津騰）；冷凍干燥機(jī)（SCINTZ-10N，新芝）；液相色譜儀（Ultimate300，Thermo）；質(zhì)譜儀（Q Exactive Focus，Thermo）。

二、實(shí)驗(yàn)與方法

1.杜仲啤酒的制備。（1）制備麥芽汁。粉碎小麥時(shí)加入少量水使小麥潤濕，且粉碎不宜過細(xì)。按料液比1：4，于37℃下自然浸泡30min，直接升溫至55℃進(jìn)行蛋白休止30min，然后轉(zhuǎn)移到糖化鍋中，緩慢升溫至65℃-78℃進(jìn)行糖化（60min）。結(jié)束糖化后進(jìn)行過濾，將濾液煮沸后加入啤酒花（啤酒花總量按40-60mg/L計(jì)算）。煮沸后先加入10%的啤酒花；煮沸60min后加入50%的啤酒花總量；煮沸90min后加入余下的啤酒花，繼續(xù)煮沸10min，除去表面的浮沫。用冷卻盤快速冷卻，使溫度快速降到25℃以下。將煮沸冷卻后的麥芽汁沿一個(gè)方向攪拌旋轉(zhuǎn)，使蛋白沉積在底部，靜置10min備用。

（2）前發(fā)酵。將杜仲粉加適量水浸泡30min，加入8倍量的水煮沸30min，過濾，濾液備用。將藥渣再加入4倍量的水煎煮20min，再進(jìn)行過濾，藥渣重復(fù)上一步操作，合并三次濾液并濃縮。將濃縮液加入煮沸后的麥芽汁中，加入5%的啤酒酵母，充氧，密封，在12℃條件下進(jìn)行前發(fā)酵。

（3）后發(fā)酵。前發(fā)酵結(jié)束后，將前發(fā)酵液得到的新鮮嫩啤酒進(jìn)行低溫離心，將上清液轉(zhuǎn)移至滅菌后的啤酒瓶中，再進(jìn)行封瓶與滅菌。將發(fā)酵溫度由12℃以每天1℃的速度進(jìn)行升溫，直至溫度達(dá)到20℃時(shí)停止升溫。常溫保存，可得熟化后的啤酒。

2.感官檢測(cè)。參照啤酒感觀評(píng)價(jià)的研究、啤酒分析方法，設(shè)置感官評(píng)價(jià)項(xiàng)目（表1），包括4大項(xiàng)內(nèi)容，總分100分，隨機(jī)抽取20名校內(nèi)人員進(jìn)行品評(píng)（得分用±SD表示）。

3.理化指標(biāo)檢測(cè)。根據(jù)GB/T 4928-2008《啤酒分析方法》的要求，對(duì)本研究制備的啤酒進(jìn)行感官要求（外觀、口感、泡沫）及原麥芽汁的濃度、酒精度數(shù)、酸度等理化指標(biāo)的檢測(cè)，根據(jù)結(jié)果對(duì)啤酒質(zhì)量進(jìn)行優(yōu)級(jí)評(píng)定。

4.非靶向液-質(zhì)聯(lián)用物質(zhì)分析。（1）檢測(cè)樣本預(yù)處理。精確移取適量樣本于2mL離心管中，濃縮干燥；加入500?L甲醇溶液（-20℃保存）到干燥后的樣本管中，渦旋1min；12000rpm、4℃離心10min，取全部上清液，轉(zhuǎn)移至新的2mL離心管中，濃縮干燥；準(zhǔn)確加入150?L 80%甲醇水配制的2-氯-L-苯丙氨酸（4ppm）溶液（-20℃保存）復(fù)溶樣品，取上清液過0.22?m膜過濾，過濾液加入到檢測(cè)瓶中，用于LC-MS檢測(cè)。

（2）上機(jī)檢測(cè)。①色譜條件。使用Thermo Vanquish（Thermo Fisher Scientific，USA）超高效液相系統(tǒng)，色譜柱為ACQUITY UPLC? HSS T3（2.1×150mm，1.8?m）（Waters，Milford，MA，USA），流速為0.25mL/min，柱溫為40℃，進(jìn)樣量為2?L。正離子模式，流動(dòng)相為0.1%甲酸乙腈（C）和0.1%甲酸水（D），梯度洗脫程序?yàn)椋?-1min，2%C；1-9min，2%-50%C；9-12min，50%-98%C；12-13.5min，98%C；13.5-14min，98%-2%C；14-20min，2%C。負(fù)離子模式，流動(dòng)相為乙腈（A）和5mM甲酸銨水（B），梯度洗脫程序?yàn)椋?-1min，2%A；1-9min，2%-50%A；9-12min，50%-98%A；12-13.5min，98%A；13.5-14min，98%-2%A；14-17min，2%A。②質(zhì)譜條件。Thermo Q Exactive Focus質(zhì)譜檢測(cè)器（Thermo Fisher Scientific，USA），電噴霧離子源（ESI），正離子噴霧電壓為3.50kV，負(fù)離子噴霧電壓為-2.50kV，鞘氣為30arb，輔助氣為10arb，毛細(xì)管溫度為325℃，分辨率70000進(jìn)行一級(jí)全掃描，一級(jí)離子掃描范圍為m/z81-1000。采用HCD進(jìn)行二級(jí)裂解，碰撞電壓為30%，二級(jí)分辨率為17500，采集信號(hào)前3離子進(jìn)行碎裂，同時(shí)采用動(dòng)態(tài)排除去除無必要的MS/MS信息。

（3）數(shù)據(jù)處理。通過Proteowizard軟件包中的MSConvert工具，將原始質(zhì)譜raw文件轉(zhuǎn)換為mzXML文件格式。采用RXCMS軟件包進(jìn)行峰檢測(cè)、峰過濾、峰對(duì)齊處理，得到物質(zhì)定量列表，參數(shù)設(shè)置為bw=2，ppm=15，peakwidth=c（2，15），mzwid=0.015，mzdiff=0.01，method=“centWave”。采用公共數(shù)據(jù)庫HMDB6、METLIN、massbank、LipidMaps、mzclound、KEGG及自建物質(zhì)庫進(jìn)行物質(zhì)的鑒定，參數(shù)設(shè)置為ppm＜20ppm?；赒C樣本的LOESS信號(hào)校正方法實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)矯正，消除系統(tǒng)誤差。在數(shù)據(jù)質(zhì)控中，過濾掉QC樣本中RSD＞30%的物質(zhì)。

三、結(jié)果與分析

1.麥芽發(fā)酵液。糖化過濾后得到橙黃色麥芽汁，測(cè)得其麥芽汁濃度為11°P。在前發(fā)酵期間，第3d后開始進(jìn)入高泡期，7d后泡沫消失，10d后得到新鮮嫩啤酒，如圖1所示。

圖1：麥芽發(fā)酵液

2.后發(fā)酵。經(jīng)過后發(fā)酵后，啤酒的整體顏色呈現(xiàn)淡黃色或淡棕色，接近于杜仲藥材提取液的顏色，如圖2所示。

圖2：后發(fā)酵液

3.感官檢測(cè)結(jié)果。根據(jù)GB/T 4928-2008中對(duì)啤酒感觀的要求，隨機(jī)抽取20名校內(nèi)人員進(jìn)行品評(píng)（得分用±SD表示），總得分為83.95±4.90，表明本研究制備的杜仲啤酒符合濃色啤酒的規(guī)定，詳見表2。

4.理化指標(biāo)檢結(jié)果。對(duì)照GB/T 4928-2008中的啤酒理化指標(biāo)要求，本實(shí)驗(yàn)制備的杜仲啤酒符合濃色啤酒的規(guī)定要求，其質(zhì)量優(yōu)級(jí)為3.7，詳見表3。

5.鑒定結(jié)果。通過液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）方式進(jìn)行物質(zhì)鑒定檢測(cè)，最終鑒定出543個(gè)代謝物，其中包含黃酮類、綠原酸、新綠原酸、桃葉珊瑚苷等成分，詳見表4。

四、討論與結(jié)論

經(jīng)LC-MS方法檢測(cè)得出，杜仲啤酒中含有槲皮素、綠原酸、桃葉珊瑚苷等成分。研究證明，槲皮素在高血壓、糖尿病、心血管疾病等治療方面發(fā)揮作用，通過調(diào)控炎癥信號(hào)通路減輕肝組織損傷來發(fā)揮免疫作用，改善三氯化鐵誘導(dǎo)頸動(dòng)脈損傷引起的血流減慢來抗血小板，防止血栓形成，減少血管彈性來降低血壓，從而改善心功能，防止心肌缺血。作為植物體內(nèi)的一種有機(jī)化合物，綠原酸是植物細(xì)胞經(jīng)過有氧呼吸合成的次生代謝產(chǎn)物，具有降壓、抗菌等多種藥理性功能。作為一種天然的環(huán)烯萜苷化合物，桃葉珊瑚苷是杜仲的有效成分之一，具有抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)等功能。

綜上所述，高血壓、糖尿病、心臟病的發(fā)病機(jī)制廣泛，且與日常生活飲食息息相關(guān)，常規(guī)啤酒的成分、酒精含量等可能會(huì)刺激神經(jīng)系統(tǒng)和血管擴(kuò)張，增加疾病的惡化進(jìn)程。而杜仲啤酒中的活性成分可以在緩解壓力的同時(shí)從源頭對(duì)疾病進(jìn)行調(diào)控，整體調(diào)節(jié)身體機(jī)能。與傳統(tǒng)的杜仲浸泡酒相比，本研究制備的杜仲啤酒口感更佳，刺激性更小，適用人群更為廣泛。

基金項(xiàng)目：2020年貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥食兩用類中藥啤酒研究中心。

作者簡介：王雷（1998-），男，大學(xué)本科，研究方向?yàn)橹扑幑こ獭?/p>

*通信作者：何光志（1977-），男，博士，教授、碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹形麽t(yī)結(jié)合。