陳 曉,李坤平 綜述,方永平△ 審校

(1.廣東醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院,廣東 湛江 524023;2.廣東醫(yī)科大學惠州第一臨床醫(yī)學院,廣東 惠州 516000)

缺氧誘導因子(HIFs)家族是參與調(diào)節(jié)細胞代謝的細胞因子,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。HIFs的主要功能包括促進腫瘤發(fā)生、血管生成、生長、轉(zhuǎn)移、調(diào)節(jié)腫瘤細胞增殖、抑制細胞凋亡、調(diào)控能量代謝密切相關(guān)[1]。HIFs高表達于腫瘤組織,分布于腫瘤微環(huán)境,與多種腫瘤細胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過程相關(guān)[2]。Notch信號通路通過與EMT相關(guān)的轉(zhuǎn)錄和生長因子發(fā)生串擾,參與多種腫瘤細胞的 EMT過程[3]。HIFs可能直接或間接通過Notch信號通路在包括肝細胞癌(HCC)在內(nèi)的腫瘤細胞 EMT 過程中發(fā)揮效應?，F(xiàn)對HIFs促進腫瘤細胞 EMT,特別是對HCC EMT的調(diào)控作用及Notch信號通路在該過程的可能作用進行簡要綜述,為探索腫瘤新的治療靶點提供依據(jù)。

1 HIF生物學特性及其與腫瘤進展的關(guān)系

1.1HIF 的生物學特性 1991年,SEMENZA和WANG在實驗研究過程中發(fā)現(xiàn)一種缺氧誘導性核因子,其能與促紅細胞生成素基因的啟動子結(jié)合并增加其表達[4],在1995年確定這種核因子為HIFs,此后學者們開始廣泛對HIFs進行更為深入的研究。HIFs是一種異源二聚體轉(zhuǎn)錄因子,其包含3個主要的氧不穩(wěn)定HIF-α亞單位(HIF-1α、HIF-2α和HIF - 3α)和1個組成型HIF-β亞單位(也稱為“ARNT”,包括ARNT1/2/3)[5]。α亞基的分子量是120×103～130×103;β亞基的分子量為91×103～94×103,α和β亞單位都屬于轉(zhuǎn)錄因子的基本家族,包括螺旋-環(huán)-螺旋和PAS結(jié)構(gòu)域,介導異二聚化和DNA結(jié)合。HIF-1α和HIF-2α的羧基末端結(jié)構(gòu)域由調(diào)節(jié)其穩(wěn)定性(氧依賴性降解結(jié)構(gòu)域)和轉(zhuǎn)錄活性(2個反式激活結(jié)構(gòu)域,N-TAD和C-TAD)的結(jié)構(gòu)域組成。此外,α亞單位的C-和N-末端都有核定位信號,將它們導向細胞核[6-7]。HIF-1α和HIF-2α具有48%的氨基酸序列同一性和相似的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),它們主要在N-TAD結(jié)構(gòu)域內(nèi)不同,而HIF-3α在螺旋-環(huán)-螺旋和PAS結(jié)構(gòu)域與HIF-1α和HIF-2α相似,但缺少C端反式激活結(jié)構(gòu)域[8]。HIFs與其受體結(jié)合后產(chǎn)生生物學效應,3個HIF-α亞單位都表現(xiàn)出氧調(diào)節(jié)蛋白的穩(wěn)定性,在正常氧濃度下,羥化酶、脯氨酸羥化酶和抑制HIF-1對α亞單位進行多泛素化和降解并保持低HIF蛋白水平和轉(zhuǎn)錄活性[9]。而在缺氧情況下,HIF-α亞單位被穩(wěn)定并轉(zhuǎn)運到細胞核,與HIF-β形成異二聚體,并結(jié)合靶基因調(diào)節(jié)元件內(nèi)的缺氧反應元件,激活數(shù)百個對低氧耐受的基因并驅(qū)動低氧反應元件基因轉(zhuǎn)錄,以促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展[10]。

1.2HIFs在腫瘤組織中的表達及其作用 近年來越來越多的實驗表明,HIFs與促進腫瘤發(fā)生、血管生成、生長、轉(zhuǎn)移、調(diào)節(jié)腫瘤細胞增殖、抑制細胞凋亡、調(diào)控能量代謝密切相關(guān)[11-12]。腫瘤為了在缺氧條件下存活,主要通過與缺氧轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)同作用重新編程其新陳代謝、蛋白質(zhì)合成和細胞周期進程,從HIFs的機制上講,其主要通過調(diào)節(jié)編碼水解糖酶的基因,血管生成信號基因和細胞凋亡/應激反應基因來調(diào)節(jié)癌細胞生長。在肺癌中,學者BECKER等[13]在研究中發(fā)現(xiàn)HIF-1α介導缺氧誘導的內(nèi)皮細胞miR-186表達下調(diào),進而通過上調(diào)蛋白激酶Cα促進非小細胞肺癌血管生成。而在XIONG等[14]研究中證實,HIF-1α和HIF-2α在缺氧條件下通過Sox2和Oct4調(diào)節(jié)非小細胞肺癌去分化,增加腫瘤的惡性增殖。缺氧信號與細胞信號通路相互作用以改變癌細胞惡性行為,腎透明細胞癌變體是最常見的腎上皮惡性腫瘤,攜帶Von Hippel-Lindau基因失活突變的患者使Von Hippel-Lindau基因功能喪失,進而導致HIF-2α通過激活缺氧敏感信號通路和HIF-2α靶基因的過表達來驅(qū)動腫瘤進展和轉(zhuǎn)移,從而促進致癌潛力[15]。HIF-2α信號在2種人類結(jié)腸癌衍生細胞系中在氧氣充足時被明顯抑制,降低了集落形成、遷移和侵襲的活性。當以HIF-2依賴性方式補充外源乙酸鹽時,人類結(jié)腸癌衍生細胞系的側(cè)腹腫瘤在小鼠體內(nèi)表現(xiàn)出增強生長[16]。而在乳腺癌的研究中,HIFs高表達,HIF-1α通過上調(diào)靶基因PLXNB3,進而誘導MET/SRC/FAK和 MET/SRC/STAT3/NANOG 信號傳導,增強乳腺癌細胞遷移、侵襲和癌癥干細胞增殖[17]。在Natalie的研究中,缺氧條件下使用甲苯咪唑在蛋白質(zhì)水平上阻止HIF-1α、HIF-2α和HIF-1β的誘導作用,起到了抑制乳腺癌細胞系和乳腺癌臨床前模型中HIFs轉(zhuǎn)錄活性的效果,進而降低了腫瘤的侵襲性,進一步體現(xiàn)了HIFs的促癌作用[18]。而在胃癌中,與其他幾種腫瘤相似,HIF-1α的高表達與胃癌的惡性表型和生存率下降高度相關(guān)[19]。

1.3HIFs在HCC中的表達及作用 HIFs和HCC之間的關(guān)系極其復雜,兩者涉及腫瘤代謝、免疫逃逸、血管生成、轉(zhuǎn)移、細胞外基質(zhì)重塑和癌癥干細胞的活性。其中,HIFs調(diào)節(jié)HCC的代謝及腫瘤免疫逃逸的機制,HIFs主要通過以下3種機制調(diào)節(jié)腫瘤細胞的代謝以促進腫瘤發(fā)展:(1)通常與Warburg效應有關(guān),HIF-1α增加葡萄糖代謝和糖酵解中關(guān)鍵酶的活化,進而促進代謝[20];(2) HIF-1α誘導幾種糖酵解蛋白亞型的過度表達和活性增加,包括GLUT1和GLUT3[21];(3)HIF-1的轉(zhuǎn)錄活性增加了線粒體相關(guān)酶的表達,因此降低線粒體的氧化磷酸化水平和氧消耗[22]。而在腫瘤免疫逃逸中,HIFs誘導腫瘤細胞對CD8細胞毒性T淋巴細胞和自然殺傷細胞產(chǎn)生的抗性,其中涉及的機制包括抑制凋亡和激活自噬[23-25]。此外,缺氧可以上調(diào)產(chǎn)生腺苷的胞外酶CD39和CD73的表達,結(jié)合其A2A受體強烈抑制活化的CD8細胞毒性T淋巴細胞和自然殺傷細胞的抗腫瘤功能[26]。HIFs還可以通過作用于巨噬細胞滲透腫瘤微環(huán)境來抑制針對腫瘤的免疫反應[27]?？傊?HIFs在不同惡性程度的HCC組織中過度表達,通過包括上述的多種途徑綜合影響腫瘤細胞進展,腫瘤分級越高,其表達水平越高,疾病預后越差。

2 HIFs與EMT的關(guān)系

2.1EMT在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中的作用 EMT是指上皮細胞中發(fā)生的形態(tài)學變化,固定的細胞脫離基膜變得可遷移,如細胞頂端-基底極性的喪失及緊密連接、黏附連接和橋粒的解體、細胞黏附分子,特別是對上皮細胞連接和根尖基底極化有重要作用的E-鈣黏蛋白被下調(diào)等[28]。相反,波形蛋白、纖連蛋白和N-鈣黏蛋白上調(diào),促進向運動狀態(tài)的轉(zhuǎn)變,進而打破了上皮細胞之間及細胞和細胞外基質(zhì)之間的內(nèi)聚性結(jié)構(gòu)完整性的特征,使這些細胞獲得運動能力,同時這也是惡性腫瘤發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移的重要細胞學基礎(chǔ)[29]。腫瘤細胞EMT對于獲得腫瘤干細胞樣特性至關(guān)重要,包括自我更新、抗凋亡、腫瘤進展和轉(zhuǎn)移[30]。腫瘤細胞受到多種EMT誘導因子(如鋅指轉(zhuǎn)錄因子、Twist轉(zhuǎn)錄因子、生長因子)及涉及多種信號通路(如Annexin1/Vimentin/S100A9、Wnt/β-catenin、CXCL8/FAK、TGF-β1/Smad2/MMP-9、Notch1、JAK2信號轉(zhuǎn)導與STAT3信號通路等)調(diào)節(jié)EMT,進而促進惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移及侵襲[31-36]。上述這些通路并非處于絕對獨立的狀態(tài),而是彼此產(chǎn)生相互促進或抑制的疊加作用,進而影響腫瘤特性作用。

2.2HCC細胞EMT的特性 EMT的作用特性給予了腫瘤細胞極強的遷移和侵襲能力,這也決定了EMT在惡性上皮性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用。HCC源于肝臟細胞上皮性腫瘤,具有典型的上皮細胞特征,HCC中的EMT過程在決定腫瘤惡性程度上有著舉足輕重的地位。HU等[37]研究發(fā)現(xiàn),MAP4和GSK3β相互作用誘導的β-連環(huán)蛋白活性的上調(diào)可能是加速HCC細胞EMT效應的原因,MAP4通過調(diào)節(jié)GSK3β/β-連環(huán)蛋白途徑促進HCC細胞EMT的過程,進而促進HCC的遷移及侵襲。有研究表明,癌癥相關(guān)成纖維細胞在誘導化學耐藥性中起重要作用,癌癥相關(guān)成纖維細胞衍生的SPP1通過整合素-蛋白激酶Cα信號通路,激活致癌信號和EMT,促進增強HCC的耐藥性[38]。我國學者發(fā)現(xiàn),FBXO43在HCC患者組織中上調(diào),并與不良臨床病理特征呈正相關(guān),同時,FBXO43高表達的HCC患者總生存期和無病生存期較短,研究者敲除FBXO43抑制了HCC細胞的EMT過程,證明FBXO43與細胞周期蛋白D1相互作用,通過多泛素化促進其穩(wěn)定性,加速其EMT,促使HCC細胞增殖遷移[39]。以上證據(jù)表明,HCC細胞的EMT中涉及多種信號通路傳導及轉(zhuǎn)錄因子,多種因素可以通過介導EMT過程來影響HCC的遷移、侵襲、耐藥等,這進一步證明了EMT是HCC調(diào)控的關(guān)鍵步驟,同時也間接提示了這些信號通路及轉(zhuǎn)錄因子可能作為肝癌轉(zhuǎn)移的預測性分子標志物及肝腫瘤治療的分子靶標,為腫瘤治療的精準性、靶向性提供新思路。

2.3HIFs與EMT的關(guān)系 EMT中關(guān)鍵信號通路的表達是代謝異常類型的主要調(diào)控因子,HIF-α就是其中之一,異常的腫瘤代謝促進EMT和轉(zhuǎn)移能力,EMT也能夠反向調(diào)節(jié)癌癥代謝,通常情況下,HIF-α作為調(diào)節(jié)2個生物學過程的連接分子,同時賦予癌細胞惡性表型[2]。缺氧條件誘導EMT的發(fā)生,HIF與多種基因啟動子上的缺氧反應元件結(jié)合,開始調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的表達并啟動EMT過程,其控制細胞骨架蛋白的表達并改變細胞的動態(tài)能力[40]。如在前列腺癌的研究中[41],HIFs下調(diào)上皮細胞標志物E-鈣黏蛋白的表達,并上調(diào)N-鈣黏蛋白,改變細胞骨架蛋白結(jié)構(gòu),增加癌細胞上雄激素受體的表達,促進腫瘤細胞EMT,維持前列腺癌的生長和存活,以及其去勢抵抗性的發(fā)展,這種轉(zhuǎn)化發(fā)生在癌細胞失去細胞間黏附并開始侵襲和轉(zhuǎn)移時刻,激活不同的信號通路取決于缺氧的不同程度,促進腫瘤進展的同時保持前列腺癌細胞的自我更新、潛能和抗凋亡功能。

另一方面,缺氧條件是腫瘤干細胞保持干細胞干性的重要機制,通過TGF-β、Notch和Wnt-β-連環(huán)蛋白信號通路等刺激癌細胞中EMT轉(zhuǎn)錄因子Snail、Twist、Zeb1、Slug和Sip1的表達,在缺氧條件下積累這些因子與增強子盒結(jié)合進而增強EMT,與此同時這些EMT轉(zhuǎn)錄因子反過來誘導干細胞標記物的轉(zhuǎn)錄[42-43],進而促進腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。

3 Notch信號通路與EMT、HIF的關(guān)系

3.1Notch 信號通路及其生物學作用 Notch 信號通路是一種生物進化中高度保守的信號轉(zhuǎn)導通路,參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展,在多種細胞的增殖、分化和凋亡,以及腫瘤發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[44]。在哺乳動物中,有4種Notch受體(Notch1/2/3/4)和5種配體(DLL1、DLL3、DLL4、Jagged1、Jagged2)。典型的Notch信號傳導是由g-分泌酶介導的Notch受體裂解啟動的,導致Notch細胞內(nèi)活性結(jié)構(gòu)域的釋放,其遷移到細胞核并與CSL相互作用,導致下游靶基因的激活,不同的配體可以在信號接收細胞中產(chǎn)生不同的Notch活性動力學,通過激活不同的靶基因程序誘導不同的細胞命運[45]。有研究顯示,在HCC患者中,Notch1的表達與預后不良呈正相關(guān),激活的Notch信號通路促進HCC細胞的干性,再次證明Notch信號通路的促癌作用[46]。此外,Notch信號通路已被證實參與多種人類惡性腫瘤生長遷移及侵襲過程,包括腎癌、乳腺癌、膀胱癌、肺癌及結(jié)直腸癌等。

3.2Notch 信號通路與EMT的關(guān)系 Notch可以通過與EMT相關(guān)的非編碼RNA發(fā)生串擾,協(xié)調(diào)腫瘤細胞的EMT過程,進而干預腫瘤進展過程。YAN等[47]在實驗研究中證明,長鏈非編碼RNA ILF3-AS1通過miR-628-5p/meis 2軸激活Notch通路促進HCC細胞遷移、侵襲和EMT過程。LI等[48]研究發(fā)現(xiàn),miRNA-139-5p可以在體內(nèi)外通過Notch1信號靶點對膠質(zhì)瘤的腫瘤活性起到抑制作用,作用機制包括:(1)miRNA-139-5p通過抑制Notch1,導致Snail的下降,從而抑制腫瘤EMT、侵襲和轉(zhuǎn)移;(2)miRNA-139-5p降低N-鈣黏蛋白、波形蛋白和纖連蛋白的活性及表達,而上調(diào)E-鈣黏蛋白。類似地,CHEN等[49]使用miRNA-424-3p對垂體腺瘤細胞的作用進行了另一項研究,其證明過表達的miRNA-424-3p對靶點Jagged1的負性作用,并隨后降低MMP-2和波形蛋白進而抑制腫瘤細胞EMT、增殖和轉(zhuǎn)移。

此外,Notch信號通路也可以通過與EMT相關(guān)的轉(zhuǎn)錄和生長因子(如Snail、Slug、Twist1、TGF-β1等)調(diào)控腫瘤細胞的EMT過程。TGF-β1是一種參與細胞分化、增殖和凋亡的多功能細胞生長因子,YAZAKI等[50]研究證明了ROS-Nrf2通路通過激活Notch信號通路介導TGF-β1誘導的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,揭示了Notch信號在TGF-β1誘導的EMT發(fā)展中的關(guān)鍵作用。在膽管癌研究[51]中,膽綠素還原酶B耗竭加速膽管癌的EMT,膽綠素還原酶B受抑制激活了Notch信號傳導,并通過上調(diào)Snail表達水平進一步增強Notch信號通路促進EMT,從而增加膽管癌中的細胞遷移和侵襲。Notch1信號靶點可以通過調(diào)控EMT轉(zhuǎn)錄因子Twist下調(diào)E-鈣黏蛋白的表達,上調(diào)波形蛋白和N-鈣黏蛋白的表達,進而促進EMT[52]。而Slug可以通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞中的Dll4-Notch-VEGFR2軸,進而控制內(nèi)皮細胞活化和血管生成,調(diào)節(jié)EMT[53]。

3.3Notch信號通路與HIF的關(guān)系 Notch信號通路在控制細胞命運起著關(guān)鍵作用,HIF信號通路是對缺氧的生理和病理反應中的主要調(diào)節(jié)器,Notch信號傳導和缺氧之間的聯(lián)系首次被提及是在J?GI等[54]的實驗研究中,該實驗發(fā)現(xiàn)Notch靶基因Hes1在缺氧的神經(jīng)母細胞瘤細胞系中被上調(diào)。此外,IRSHAD等[55]在對膠質(zhì)母細胞瘤中Notch和缺氧激活基因的研究中也證實了這2種途徑的聯(lián)合基因特征及其在影響腫瘤不良預后中的作用。

HIFs作為細胞缺氧反應的全局調(diào)節(jié)因子,可以與Notch相互作用,直接調(diào)節(jié)Notch信號通路,Notch信號與細胞缺氧反應之間的交叉協(xié)同作用會促進不同癌癥的進展,作用機制主要是HIF-α被招募到Notch反應性啟動子,并與Notch胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域相互作用,導致Notch胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的穩(wěn)定和Notch下游基因的激活[56]。另外有研究發(fā)現(xiàn),低氧誘導的Notch配體(如Jagged2和DLL4)的上調(diào)導致Notch信號的激活,也是兩者產(chǎn)生直接協(xié)同作用的關(guān)鍵機制[57-58]。值得注意的是,HIFs除了能夠直接調(diào)節(jié)Notch信號通路,也可以對Notch信號起到間接調(diào)控作用,如在關(guān)于肺癌的研究中,HIF介導的miR-1275上調(diào)發(fā)揮了致癌作用,通過共同激活Notch和Wnt/β-catenin信號傳導途徑,進而促進肺癌的發(fā)生發(fā)展。另一方面,Notch信號也可以調(diào)節(jié)缺氧反應,Notch可以通過HIF-1α到HIF-2α的轉(zhuǎn)換在某些腫瘤細胞中轉(zhuǎn)錄上調(diào)HIF-2α的表達[59]?？偠灾?Notch信號和細胞缺氧反應之間的串擾是廣泛的,兩者相互作用的機制復雜,Notch-hypoxia串聯(lián)已經(jīng)參與了各種生理和病理過程。

4 小結(jié)與展望

在HIFs家族里,雖然不同的α亞基在機體不同器官部位表達的作用有所差異,但在HCC等腫瘤細胞EMT過程中發(fā)揮重要作用。Notch信號通路參與機體代謝,不僅在細胞增殖、分化和凋亡過程發(fā)揮重要作用,以及在參與調(diào)控癌癥相關(guān)通路具有極強的復雜性,并與 EMT和HIFs有密切關(guān)聯(lián),在HIFs促進HCC等腫瘤細胞EMT過程中起重要作用。因此,研究HIFs對HCC等腫瘤EMT的調(diào)控作用及其相關(guān)可能的機制,探討Notch信號通路在此過程中的作用,對抑制HCC等腫瘤的進展,改善患者預后具有良好應用前景,有望為優(yōu)化HCC等腫瘤的治療和制訂新的治療策略提供依據(jù)。