談華棟,劉明遠(yuǎn),伍 旭,詹 峰 綜述,倪吉祥 審校

(三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院/宜昌市中心人民醫(yī)院西陵院區(qū)呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科,湖北 宜昌 443003)

特發(fā)性肺纖維化(IPF)是一種隨著年齡增長逐漸加重,主要表現(xiàn)為活動性呼吸困難,進(jìn)行性加重,且不可逆的疾病。隨著對IPF臨床表現(xiàn)的認(rèn)識不斷提高,高分辨率CT(HRCT)的廣泛使用及其他潛在因素導(dǎo)致IPF的患病率在過去20年中不斷上升,特別是在65歲以上的人群中[1],顯然IPF的發(fā)病率與衰老存在某種聯(lián)系。且IPF目前無法完全治愈,除了肺移植外,抗纖維化治療也只能部分阻止纖維化的進(jìn)程[2]。衰老是一個以多種復(fù)雜因素相互作用為特征的過程,例如生理異常、危險因素的負(fù)面影響積累、異常細(xì)胞群和組織,從而導(dǎo)致整個生物體的進(jìn)行性功能損害,也是IPF最重要的危險因素,其病理生理學(xué)特征包括端粒損耗、DNA損傷、蛋白質(zhì)發(fā)育異常、線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激、自噬失調(diào)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)應(yīng)激等[3]。在細(xì)胞水平上,衰老和IPF的病理學(xué)存在大量重疊,表現(xiàn)為細(xì)胞衰老標(biāo)志物的表達(dá)增加。衰老的特征是細(xì)胞生長停滯和復(fù)制潛力降低,通過損害肺泡祖細(xì)胞的再生和促進(jìn)促纖維化細(xì)胞環(huán)境,使肺易發(fā)生纖維化。在IPF中,肺泡2型上皮細(xì)胞表現(xiàn)出衰老標(biāo)志物優(yōu)先定位于成纖維細(xì)胞病灶的異常上皮細(xì)胞表達(dá),特別是高水平的衰老蛋白轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物[4]。本文主要對IPF細(xì)胞衰老相關(guān)發(fā)病機(jī)制及治療進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 端粒功能障礙

端粒是線性染色體末端的基因組部分。脊椎動物的端粒DNA是由TTAGGG重復(fù)序列和一組蛋白質(zhì)組成的,這些蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)其生物功能,保護(hù)它們不被識別為DNA損傷,并且防止觸發(fā)DNA損傷反應(yīng)(DDR)。在沒有端粒酶的情況下,標(biāo)準(zhǔn)的DNA聚合酶不能完全復(fù)制線性DNA模板,而且由于核酸裂解過程,DNA復(fù)制導(dǎo)致染色體端粒逐漸縮短。當(dāng)端粒達(dá)到臨界長度時,其無法結(jié)合足夠的端粒封頂?shù)鞍?并被感知為暴露的DNA末端,這就激活了DDR途徑[5]。然而,這種短端粒保留了足夠數(shù)量的端粒結(jié)合蛋白,以抑制DNA修復(fù)和避免融合,從而引發(fā)持續(xù)的DNA損傷信號,導(dǎo)致DNA損傷所誘導(dǎo)的永久性增殖停滯。進(jìn)而啟動并維持細(xì)胞衰老,這是有機(jī)體衰老和多種年齡相關(guān)疾病的關(guān)鍵因素[6]。有研究表明,端粒功能障礙是可以概括IPF特征的,且已有研究在IPF中確定了幾個端粒相關(guān)基因的基因突變[7]。此外,在小鼠肺泡2型上皮細(xì)胞中,端粒的損傷促進(jìn)了纖維化和衰老上皮細(xì)胞的積累[8]。一項(xiàng)meta分析認(rèn)為,更長的端粒和降低間質(zhì)性肺疾病(ILD)風(fēng)險的關(guān)系從可能的證據(jù)升級為強(qiáng)有力的證據(jù),即端粒長度的延長與IPF風(fēng)險呈負(fù)相關(guān)[9]。同樣一篇關(guān)于端粒長度與健康相關(guān)結(jié)局的孟德爾隨機(jī)化研究分析指出,白細(xì)胞端粒長度延長與IPF風(fēng)險降存在關(guān)聯(lián)。線粒體功能障礙和線粒體活性氧(mtROS)的產(chǎn)生會導(dǎo)致DNA損傷和無效修復(fù),其中至少部分原因是由于端粒維持功能障礙[10]。持續(xù)的DNA損傷被激活而導(dǎo)致衰老的一系列反應(yīng),其中包括共濟(jì)失調(diào)-毛細(xì)血管擴(kuò)張突變/核因子-κB(NF-κB)必需修飾劑(ATM/NEMO)、p53、纖溶酶原激活劑抑制劑-1(PAI-1)和磷酸肌醇3-激酶(PI3K)/AKT信號傳導(dǎo)。NF-κB也是通過p21等分子引起這種反應(yīng)的重要介質(zhì),這些分子可能促進(jìn)細(xì)胞衰老[11]。此外,NF-κB在IPF肺中的表達(dá)增加,其在肺泡上皮細(xì)胞中的特異性表達(dá)對于衰老是必需的[12]。最近的研究發(fā)現(xiàn),PI3K/AKT失調(diào)與下游NF-κB活化之間存在機(jī)制關(guān)聯(lián),導(dǎo)致促纖維化基因表達(dá),其可能存在于成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞中[13]。

2 細(xì)胞衰老表型

IPF的特點(diǎn)是存在抗凋亡和抗衰老的成纖維細(xì)胞,產(chǎn)生過度堅硬的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)。ECM影響了細(xì)胞功能和組織穩(wěn)態(tài),異常的ECM與肺纖維化的發(fā)生密切相關(guān)。而衰老會逐漸改變ECM成分,并與衰老細(xì)胞的積累有關(guān)。衰老細(xì)胞通過表達(dá)與衰老相關(guān)分泌表型(SASP)相關(guān)的因子來促進(jìn)與年齡相關(guān)的組織功能障礙,例如轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、IL-6、IL-8和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等[14]。SASP具有強(qiáng)大的自分泌和旁分泌作用,并通過一些生物過程來調(diào)節(jié)組織微環(huán)境,如細(xì)胞增殖、遷移、炎癥、纖維化、ECM降解、新生血管形成、組織修復(fù)和再生、衰老清除和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)。另外,無論是NF-κB還是上述端粒功能障礙中提到的其他途徑,SASP特征都是炎癥蛋白的分泌。最近有研究表明,許多煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)代謝酶,包括煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(NAMPT)、Sirtuins、ADP-核糖PARPs和 CD38,在ECM重塑和纖維化中起關(guān)鍵作用[15]。另外,NAD穩(wěn)態(tài)也影響著IPF中衰老細(xì)胞的發(fā)育和功能,一方面,低NAD誘導(dǎo)的DNA損傷和線粒體功能障礙的積累可以促進(jìn)衰老的發(fā)展;另一方面,細(xì)胞衰老的發(fā)展及其分泌表型似乎對代謝要求很高,衰老過程中發(fā)生的低NAD狀態(tài)可能會抑制細(xì)胞衰老的發(fā)展[16]。例如研究發(fā)現(xiàn)在IPF的衰老成纖維細(xì)胞中,線粒體的功能障礙降低了NAD+/NADH比值,而NAD+代謝控制著促炎SASP的產(chǎn)生[17]。另外有研究發(fā)現(xiàn),衰老細(xì)胞分泌的TGF-β會導(dǎo)致鄰近的細(xì)胞衰老,因?yàn)門GF-β上調(diào)了細(xì)胞周期抑制劑p21、p27和p15,進(jìn)而通過SMAD信號通路以旁分泌方式誘導(dǎo)鄰近細(xì)胞衰老,這可能對器官衰老很重要,尤其是在緩慢自我更新的組織(如肺)中,因?yàn)榉闻?型上皮細(xì)胞衰老可能會擴(kuò)散到同一器官內(nèi)的其他細(xì)胞[18]。老化的肺泡2型上皮細(xì)胞通過表達(dá)血小板源性生長因子(PDGF)、TNF、內(nèi)皮素-1、結(jié)締組織生長因子(CTGF)、趨化因子CXC配體12(CXCL12)和PAI-1等SASP,來誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞大量增殖和活化。其中一個顯著成分是PAI-1,其在肺泡2型上皮細(xì)胞中高度表達(dá)。PAI-1的過度表達(dá)促進(jìn)ECM的積累,并作為細(xì)胞衰老的強(qiáng)誘導(dǎo)劑,特別是在肺泡2型上皮細(xì)胞中。TGF-β1通過多種信號通路增加PAI-1的表達(dá)[19],如TGF-β1誘導(dǎo)肺泡2型上皮細(xì)胞衰老,其衰老作用是由PAI-1介導(dǎo)的,TGF-β1通過激活素受體樣激酶5和Smad3磷酸化誘導(dǎo)肺泡巨噬細(xì)胞產(chǎn)生PAI-1[20]。此外,CTGF通過介導(dǎo)活性氧(ROS)積累誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞衰老,導(dǎo)致p53的激活和p16INK4a的誘導(dǎo)。盡管SASP的分泌受與p53和Rb途徑相關(guān)的細(xì)胞周期停滯的調(diào)節(jié),但抑制p53或Rb途徑不足以阻止SASP誘導(dǎo)的作用。雖然SASP的分泌可能發(fā)生在衰老成纖維細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞中,但只有肺泡上皮細(xì)胞分泌的SASP似乎對纖維化的進(jìn)展很重要。靶向細(xì)胞衰老可能是一種有前途的治療途徑,因?yàn)閯游锬Ｐ椭械膸醉?xiàng)研究表明,在給予senolytics(一種特異性靶向衰老細(xì)胞的藥物)后纖維化會減弱[21]。有研究報道,重組胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白(IGFBPs)的鼻內(nèi)遞送可保護(hù)老年小鼠免于體重減輕,并在博來霉素肺損傷后顯示出抗纖維化作用。IGFBP2轉(zhuǎn)基因小鼠揭示了2型肺泡上皮細(xì)胞中的衰老和SASP因子減少,并且其改善了博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化[22]。與過敏性肺炎和(或)慢性阻塞性肺疾病患者相比,從IPF和(或)肺動脈高壓患者的纖維化肺區(qū)域分離的肺泡上皮2型細(xì)胞中IGFBP2表達(dá)受到顯著抑制。

3 線粒體穩(wěn)態(tài)

線粒體穩(wěn)態(tài)與細(xì)胞衰老的調(diào)節(jié)密切相關(guān),其作為重要的細(xì)胞器,在細(xì)胞能量產(chǎn)生和代謝穩(wěn)態(tài)中起著關(guān)鍵作用。在IPF的發(fā)病機(jī)制中,線粒體功能障礙主要涉及線粒體ROS水平失衡、線粒體DNA的改變、線粒體介導(dǎo)的自噬減少和電子傳遞鏈?zhǔn)Ш?。有研究表?線粒體功能障礙所參與的IPF組織細(xì)胞的凋亡與衰老,被認(rèn)為是衰老時易發(fā)生纖維化的重要標(biāo)志。線粒體生成的ROS增加可誘導(dǎo)肺纖維化,ROS可以激活TGF-β,TGF-β也可以反過來激活ROS,如此形成惡性循環(huán)[23]。氧化酶4(NOX4)被認(rèn)為是線粒體功能障礙的中介[24]。NOX4酶與線粒體相互作用,影響線粒體功能及線粒體ROS和SIRT的產(chǎn)生,共同促進(jìn)上皮損傷和肺纖維化[25]。由于線粒體膜上的磷脂對反應(yīng)性物質(zhì)的敏感性,長期暴露于ROS可導(dǎo)致線粒體氧化損傷,并可進(jìn)一步誘導(dǎo)更多的ROS產(chǎn)生。NOX4還通過控制Smad2/3和調(diào)節(jié)PDGF誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞遷移來調(diào)節(jié)α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)和膠原蛋白的含量[26]。此外,線粒體功能障礙的積累還導(dǎo)致了NADH氧化為NAD的減少,并降低NAD/NADH比值,進(jìn)而激活A(yù)MPK和p53,導(dǎo)致衰老表型[27]。在香煙煙霧誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠模型中,香煙煙霧通過增加線粒體ROS和減少自噬和線粒體自噬來誘導(dǎo)2型肺泡上皮細(xì)胞衰老[28]。最近還有研究表明,線粒體質(zhì)量維持機(jī)制(如線粒體生物發(fā)生和線粒體自噬)的破壞也可能使2型肺泡上皮細(xì)胞易衰老。由于表面活性劑產(chǎn)生的高代謝需求,2型肺泡上皮細(xì)胞特別容易受到線粒體功能障礙的影響。在IPF患者的2型肺泡上皮細(xì)胞中觀察到異常增大和腫脹的線粒體[29]。

參與衰老和線粒體功能的特定蛋白質(zhì)在IPF中失調(diào)。例如,磷酸酯酶與張力蛋白同系物(PTEN)誘導(dǎo)的激酶-1(PINK1)通常促進(jìn)線粒體自噬并穩(wěn)定線粒體膜完整性。一些研究強(qiáng)調(diào)了PINK1在纖維化中的重要性,因?yàn)镻INK1缺陷小鼠更容易發(fā)生纖維化[30]。PINK1還提供了ER應(yīng)激和線粒體功能障礙之間的機(jī)制聯(lián)系。ER應(yīng)激通過激活轉(zhuǎn)錄因子3(ATF3)下調(diào)PINK3,并通過ATF4導(dǎo)致線粒體未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)的類似程序發(fā)生[31]。與PINK1缺乏相關(guān)的線粒體功能障礙則通過釋放線粒體DNA(mtDNA)導(dǎo)致纖維化,mtDNA激活Toll樣受體(TLR)并刺激TGF-β[32]。

與衰老相關(guān)的端粒功能障礙還可通過p53介導(dǎo)的過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(PPARγ)共激活因子-1α(PGC-1α)和PGC-1β的下調(diào)抑制了線粒體生物發(fā)生途徑,導(dǎo)致線粒體質(zhì)量進(jìn)一步受損及mtROS產(chǎn)生增加[33]。端粒相關(guān)DNA損傷可誘導(dǎo)雷帕霉素(mTOR)的機(jī)制靶標(biāo),并通過增加mtROS產(chǎn)生促進(jìn)上皮衰老。因此,mTOR在幾種慢性肺部疾病中上調(diào),包括IPF[34]。因此,IPF中線粒體功能障礙具有重要地位,同時也有待進(jìn)一步研究。

4 自 噬

在纖維化模型中觀察到的自噬受損,可能代表IPF的致病性特征。自噬為一種細(xì)胞穩(wěn)態(tài)程序,其通過隔離在雙膜結(jié)合的自噬體中和隨后的溶酶體依賴性降解來控制長壽命蛋白質(zhì)和功能失調(diào)的細(xì)胞器(即線粒體)的周轉(zhuǎn)。誘導(dǎo)自噬是抗衰老途徑的標(biāo)志,在細(xì)胞應(yīng)激期間充當(dāng)促生存機(jī)制,包括ER應(yīng)激、缺氧和氧化應(yīng)激。越來越多的研究表明,mTOR介導(dǎo)的通路可能在促進(jìn)IPF方面發(fā)揮不可或缺的作用。mTOR是一種絲氨酸-蘇氨酸激酶,具有mTORC1和mTORC2 2種復(fù)合物形式。mTORC1主要在不利環(huán)境中調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和自噬,從而改變成纖維細(xì)胞的增殖和活力;mTORC2主要作用于細(xì)胞骨架蛋白構(gòu)建和細(xì)胞存活[35]。TGF-β可通過激活自噬抑制劑mTOR復(fù)合物1(mTORC1)抑制自噬,而mTORC1在衰老細(xì)胞和IPF細(xì)胞中的持續(xù)激活,導(dǎo)致了自噬減少[36]。有新的研究發(fā)現(xiàn),tetrandrine恢復(fù)了TGF-β1誘導(dǎo)的受損自噬通量,并伴SQSTM1和MAP1LC3-Ⅱ相互作用增強(qiáng),同時tetrandrine通過增加NRF2和SQSTM1啟動子的結(jié)合來誘導(dǎo)自噬。此外,tetrandrine通過減少Rheb的激活來抑制TGF-β1誘導(dǎo)的mTOR磷酸化[37]。因此,在未來,tetrandrine可能會給IPF提供一種新的治療方式。自噬受損在IPF發(fā)病機(jī)制中的功能意義尚不清楚,但可能與線粒體質(zhì)量控制受損、脂質(zhì)和膠原蛋白周轉(zhuǎn)受損及病原體清除受損等因素有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn),表面活性蛋白C突變導(dǎo)致自噬晚期阻滯和p62在2型肺泡上皮細(xì)胞中的積累[38]。p62的積累可能與纖維化相關(guān)的異常下游信號傳導(dǎo)有關(guān),包括NF-κB調(diào)節(jié)和NRF2調(diào)節(jié)。有研究評估了泛素特異性蛋白酶13(USP13)在年齡相關(guān)性肺纖維化中的作用,并證明了USP13缺陷的老年小鼠表現(xiàn)出自噬活性受損,并且對博來霉素誘導(dǎo)的纖維化增加了脆弱性。在機(jī)制上,USP13與Beclin1相互作用并去泛素化,Beclin1過表達(dá)消除了USP13破壞的影響。此外,Beclin1抑制導(dǎo)致了博來霉素?fù)p傷后自噬不足和更嚴(yán)重的肺纖維化,并且與老年USP13缺陷小鼠的表型一致。另外,在甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBP)基因內(nèi)含子中編碼的microRNA-33家族是甾醇和脂肪酸代謝的主要調(diào)節(jié)因子,microRNA-33控制巨噬細(xì)胞免疫代謝反應(yīng)并增強(qiáng)線粒體生物發(fā)生、脂肪酸氧化和膽固醇外排。巨噬細(xì)胞中microRNA-33的缺失可改善線粒體內(nèi)穩(wěn)態(tài)并增加自噬,同時減少博來霉素?fù)p傷后的炎癥反應(yīng)。并且通過施用抗microRNA-33肽核酸(PNA-33)對巨噬細(xì)胞中microRNA-33的藥理學(xué)抑制可減輕不同體內(nèi)和離體小鼠肺纖維化模型的纖維化[39],此發(fā)現(xiàn)也為IPF提供了潛在的新治療方法。

5 ER應(yīng)激

在IPF中,ER應(yīng)激和UPR已被確定為纖維化的上游介質(zhì),且ER應(yīng)激和UPR的標(biāo)志物在IPF肺的2型肺泡上皮細(xì)胞中升高[40]。2型肺泡上皮細(xì)胞對蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)特別敏感,因?yàn)槠鋾a(chǎn)生大量表面活性劑蛋白質(zhì)。ER應(yīng)激的標(biāo)志物出現(xiàn)在IPF患者的無癥狀親屬和IPF肺的組織學(xué)正常區(qū)域,表明ER應(yīng)激在疾病的發(fā)展中很重要[41]。在纖維化肺中觀察到ER應(yīng)激期間ER蛋白折疊伴侶(例如FK506結(jié)合蛋白13)的表達(dá)增加,并且與較差的肺功能相關(guān)[42]。ER相關(guān)降解(ERAD)可防止ER中錯誤折疊蛋白的積累,但該過程的生理調(diào)節(jié)仍不明確。但有研究發(fā)現(xiàn),一種抗病毒RNA干擾途徑,稱為ER相關(guān)RNA沉默(ERAS),其與ERAD一起作用以保持ER穩(wěn)態(tài)和功能。在ER應(yīng)激的誘導(dǎo)下,ERAS由精氨酸蛋白RDE-1/AGO2介導(dǎo),在哺乳動物中促進(jìn)ER相關(guān)RNA周轉(zhuǎn)[43]。

ER應(yīng)激中的UPR信號通路首先在酵母中發(fā)現(xiàn),其中ER應(yīng)激僅由絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶/內(nèi)切核糖核酸酶肌醇需要的酶1(IRE1)控制。這與脊椎動物形成鮮明對比,脊椎動物主要由3個信號調(diào)節(jié)UPR:IRE1、ATF-6β和蛋白激酶R樣ER激酶(PERK)。這些途徑將ER中蛋白質(zhì)折疊狀態(tài)的信息傳遞到細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核,以恢復(fù)蛋白質(zhì)折疊能力。ER伴侶結(jié)合免疫球蛋白(BiP)(也稱為GRP-78)與IRE1α結(jié)合導(dǎo)致其失活[44]。在ER作用下,BiP優(yōu)先與錯誤折疊的蛋白質(zhì)結(jié)合,隨后從PERK和IRE1中釋放出來,從而啟動這些蛋白質(zhì)的二聚化。近期一項(xiàng)研究在肺泡上皮2型細(xì)胞中特異性地誘導(dǎo)敲除ER伴侶GRP78,其丟失導(dǎo)致了ER應(yīng)激/未折疊的蛋白質(zhì)反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、衰老和肺泡上皮2型細(xì)胞的祖細(xì)胞能力受損,以及年齡相關(guān)的肺纖維化[45]。GRP78敲除小鼠發(fā)展成具有IPF幾個特征的肺纖維化,包括老年小鼠的敏感性增加。GRP78敲除和IPF肺的纖維化在ER應(yīng)激抑制劑TUDCA的離體培養(yǎng)中得到改善。此外,GRP78在老年小鼠和IPF患者的AT2細(xì)胞中減少,表明GRP78減少是將衰老與IPF聯(lián)系起來的潛在機(jī)制[45]。

6 小 結(jié)

隨著新技術(shù)的進(jìn)步,人們對細(xì)胞衰老與IPF之間有了更透徹地了解,病因的確定可以建議治療方案,包括試圖抵消端?？s短或抵消tDDR活化、使用特異性靶向細(xì)胞衰老藥物、抑制相關(guān)炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)線粒體及ER的功能穩(wěn)定等。但是或許有其他因素參與其中還未被發(fā)現(xiàn),所以對于IPF疾病的發(fā)生發(fā)展仍需更深入的研究。