鄧奕龍 苗曉輝 顧少龍 施守杰 張小全 王建安

摘要：以云煙87為試驗材料，采用烘烤比較試驗，設置3個處理，即CK，云南當?shù)爻Ｒ?guī)烘烤工藝；T1，變溫幅度±1.0 ℃、變溫頻率3 h；T2，變溫幅度±1.5 ℃、變溫頻率5 h，探索密集烤房變溫調控對烤煙上部葉氮代謝生理的影響。利用曲線估算、通徑分析對煙葉可溶性蛋白質、游離氨基酸含量及氮代謝相關酶活性進行系統(tǒng)分析，研究烘烤過程中變黃期變溫處理對煙葉蛋白質降解機理的影響。結果表明，2個變溫工藝處理下，煙葉中性蛋白酶、內肽酶活性呈“M”形曲線變化，轉氨酶活性呈先升后降再升的變化趨勢，與常規(guī)工藝處理有所差異；烘烤變黃結束時，T1變溫處理煙葉的中性蛋白酶、內肽酶、谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶活性分別為0.058 6、0.081 6、31.113 9、36.714 8 U/g，高于或顯著高于CK、T2處理。在變溫幅度1 ℃和變溫頻率3 h處理條件（T1）下，對煙葉可溶性蛋白質、游離氨基酸含量影響的主要因素是谷草轉氨酶、內肽酶活性；烘烤變黃結束時，T1變溫處理下的可溶性蛋白質含量最低，游離氨基酸含量為380.667 9 μmol/g，顯著高于CK、T2處理。對密集烤房烘烤變黃期變溫幅度和變溫頻率進行合理調控，有利于氮代謝相關酶活性維持較高水平，促進蛋白質的充分降解和游離氨基酸的有效積累，可明顯影響煙葉品質。

關鍵詞：烤煙；烘烤工藝；溫度變化；含氮化合物；酶活性；通徑分析

中圖分類號：TS44⁺1? 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）06-0191-07

收稿日期：2023-05-12

基金項目：河南中煙工業(yè)有限責任公司資助項目（編號：2021410000340261、2022410000340099）。

作者簡介：鄧奕龍（1998—），男，福建三明人，碩士研究生，主要從事煙草調制與加工研究。E-mail：dyl19980321@gmail.com。

通信作者：王建安，博士，高級實驗師，主要從事煙草調制與加工研究。E-mail：wjanwyh@163.com。

含氮化合物是烤煙煙葉中的重要組分之一，對煙葉內的能量代謝和物質轉化具有調節(jié)作用^[1-2]。煙葉中的主要含氮化合物為蛋白質和游離氨基酸，對煙葉品質和煙氣質量具有重要影響^[3-5]。若煙葉中蛋白質含量過高，卷煙燃吸時會產生燒焦的羽毛味、辛辣和苦澀感，對卷煙燃燒性會產生不良影響^[6-7]。在煙葉烘烤過程中，蛋白酶能夠將大部分可溶性蛋白質降解為游離氨基酸，而這些游離氨基酸能與還原糖類發(fā)生酶促和非酶促棕色化反應，進而產生有利于煙葉品質的香氣物質^[8-9]。在煙葉烘烤過程中，合理調控烘烤工藝參數(shù)，對協(xié)調煙葉蛋白質含量、蛋白酶活性和最終提高煙葉品質具有重要意義。李婷婷等對烤煙進行不同烘烤方式的研究，發(fā)現(xiàn)煙葉中蛋白酶活性在“兩燉一?！钡拿芗婵緱l件下有明顯提高；該方法還能促進淀粉和蛋白質的降解，從而提高煙葉的化學品質^[10]。陳頤等對煙葉烘烤過程中蛋白質含量的變化進行研究，發(fā)現(xiàn)適當增加變黃期（36～38 ℃）的烘烤時長，可有效保持煙葉的內肽酶活性，極大減少不同成熟度煙葉中的蛋白質含量^[11]。賀帆等研究認為，密集烘烤低溫中濕變黃處理可以顯著增加煙葉的中性蛋白酶、內肽酶、轉氨酶活性，并延長它們的作用時間，從而有助于有效降解煙葉中的蛋白質，并促進氨基酸的合理轉化^[12]。煙葉中蛋白質降解的程度主要受蛋白酶活性水平的影響，而蛋白酶活性受溫濕度條件的制約；蛋白質的降解實質上是在特定溫濕度條件下，通過相關酶的作用而產生的^[13-14]。傳統(tǒng)的普通烤房烤煙，依靠燃煤和木材自然燃燒，烤房內溫度受燃料燃燒特性的影響，在固定變黃溫度下經常出現(xiàn)周期性上下浮動的變化，與現(xiàn)代烤煙控制儀通過燃料鼓風燃燒控溫具有明顯區(qū)別?；诖?，本試驗以云南新煙區(qū)主栽品種云煙87的上部葉為研究對象，針對當前階段性溫度固定的煙葉變黃方式，在煙葉烘烤前期采用煙葉變溫變黃方式，對煙葉蛋白質降解規(guī)律及其相關酶活性的變化進行研究，旨在為密集烤房優(yōu)化上部煙葉烘烤工藝提供理論依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 試驗材料

試驗于2022年10月在河南農業(yè)大學煙草實驗室進行。試驗取樣地點位于云南滄源縣（99°34′E，23°17′N），海拔為1 780 m，試驗地土壤為磚紅壤，前茬作物為玉米，土壤肥力均勻且處于中上水平。其中，烘烤變黃期月均溫為22 ℃，月均降水量為 240 mm。選取煙葉采收成熟度和葉片大小一致、烘烤特性較好的云煙87，以頂部從上往下3～5葉位煙葉代表上部葉作為試驗材料。試驗使用3臺自動化煙葉烘烤箱，容量為裝煙葉鮮重165～195 kg，裝煙1 100～1 300片。根據(jù)當?shù)責熑~成熟度，以上部葉充分成熟為采收標準，各項烤前工作在1 d內完成。

1.2? 試驗設計

采用烘烤比較試驗，設置常規(guī)烘烤和變溫烘烤2類處理，共3個處理，在變黃期主變黃38 ℃的基礎上進行正弦式程序變溫，烘烤工藝試驗處理見圖1、表1。具體處理為：CK，當?shù)爻Ｒ?guī)烘烤工藝；T1，變溫幅度±1 ℃、變溫范圍37～39 ℃、變溫頻率 3 h、變溫總時長32 h；T2，變溫幅度±1.5 ℃、變溫范圍36.5～39.5 ℃、變溫頻率5 h、變溫總時長 31 h。當密集烤房內溫度從42 ℃開始升溫進入定色期后，按照當?shù)囟ㄉ诤透山钇诘暮婵竟に囘M行處理。烘烤過程中各處理烘烤時間分別為0、36、48、60、72、84、96 h，共進行煙葉取樣7次，取樣后煙葉立即置于液氮中保存，后序用于含氮化合物含量和氮代謝相關酶活性的測定。取樣結束后，空出的煙葉間隙用適量麻布補回，來避免由于裝煙密度變化導致的干、濕球溫度和煙葉間風速變化而影響煙葉的烘烤效果。

1.3? 測定項目與方法

1.3.1? 含氮化合物含量的測定

可溶性蛋白質含量采用考馬斯亮藍法進行測定^[15]。游離氨基酸含量采用茚三酮比色法進行測定^[16]。

1.3.2? 氮代謝相關酶活性的測定

中性蛋白酶活性采用中性蛋白酶活性檢測試劑盒（型號BC2295，北京索萊寶科技有限公司）進行測定。內肽酶活性采用植物內肽酶檢測試劑盒（型號YJ602258，上海酶聯(lián)生物科技有限公司）進行測定，采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。谷草轉氨酶活性采用谷草轉氨酶活性檢測試劑盒（型號BC1565，北京索萊寶科技有限公司）進行測定。谷丙轉氨酶活性采用谷丙轉氨酶活性檢測試劑盒（型號BC1555，北京索萊寶科技有限公司）進行測定。

1.4? 統(tǒng)計與數(shù)據(jù)分析

根據(jù)煙葉中可溶性蛋白質、游離氨基酸含量及中性蛋白酶、內肽酶、谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶活性在不同烘烤工藝處理中的變化規(guī)律，對其使用曲線估算擬合出最優(yōu)曲線，其中Y是不同工藝處理煙葉的可溶性蛋白質含量（mg/g）、游離氨基酸含量（μmol/g）、中性蛋白酶活性（U/g）、內肽酶活性（U/mL）、谷草轉氨酶活性（U/g）、谷丙轉氨酶活性（U/g），x是烘烤時間（h），通過F檢驗得到回歸方程的P值均小于0.01，達到極顯著水平，表明擬合方程具有統(tǒng)計學意義。不同烘烤工藝處理的各指標擬合特征參數(shù)見表2、表3、表4。

采用Excel 2016、DPS 7.05、SPSS 26.0進行數(shù)據(jù)處理、繪圖和統(tǒng)計分析。

2? 結果與分析

2.1? 變溫烘烤過程中煙葉含氮化合物含量變化

2.1.1? 可溶性蛋白質含量變化

3種工藝處理烘烤過程中，煙葉中可溶性蛋白質含量均呈逐漸降低的變化規(guī)律。由圖2-A可知，煙葉中可溶性蛋白質的降解速率在烘烤過程中表現(xiàn)為“快-慢”的變化規(guī)律。煙葉烘烤變黃結束時，T1工藝處理的煙葉可溶性蛋白質含量最低，顯著低于CK。由圖2-B可知，煙葉中可溶性蛋白質降解比例均呈持續(xù)升高的變化規(guī)律，T1工藝處理的可溶性蛋白質降解比例整體上均高于CK、T2。T1變黃處理條件下，可溶性蛋白質降解程度均高于CK、T2工藝處理。因此，T1工藝處理能夠有效地促進煙葉中可溶性蛋白質的降解。

2.1.2? 游離氨基酸含量變化

3種工藝處理烘烤過程中，煙葉的游離氨基酸含量均不斷增加，但上升程度有所差異。由圖2-C可知，變黃期變溫處理對煙葉游離氨基酸含量的影響顯著。煙葉烘烤變黃結束時，T1工藝處理的煙葉游離氨基酸含量最高，顯著高于其他處理。由圖2-D可知，煙葉中游離氨基酸積累比例均呈“快—慢—快”持續(xù)增加的變化規(guī)律，T1工藝處理的煙葉游離氨基酸積累比例整體上均高于CK、T2。由此可見，變黃期T1變溫處理更有利于煙葉中游離氨基酸的積累。

2.2? 變溫烘烤過程中煙葉氮代謝相關酶活性的變化

2.2.1? 中性蛋白酶活性的變化

由圖3-A可知，烘烤過程中，CK處理煙葉的中性蛋白酶活性呈先升后降再升而后又降的“三波峰曲線”，T1、T2處理

則基本一致呈現(xiàn)出先升后降的“M”形變化趨勢。在煙葉的烘烤過程中，2個變溫工藝處理使得煙葉的中性蛋白酶活性出現(xiàn)高峰的時間比CK處理更晚；且CK處理變黃前期中性蛋白酶活性大于2個變溫處理。烘烤變黃結束時，各工藝處理下煙葉的中性蛋白酶活性表現(xiàn)為T1>T2>CK，其中T1處理煙葉的中性蛋白酶活性顯著大于CK。由此可見，T1變溫工藝處理對煙葉的中性蛋白酶活性具有顯著影響，有利于大分子蛋白質物質的降解。

2.2.2? 內肽酶活性變化

烘烤過程中煙葉內肽酶活性的分析結果（圖3-B）表明，內肽酶活性表現(xiàn)出的變化規(guī)律與中性蛋白酶活性具有一定相似性。變黃前期烘烤過程中，各工藝處理下煙葉內肽酶活性均在0～36 h迅速升高，2個變溫處理下內肽酶活性的第1個高峰晚于CK，且內肽酶活性均在36 h顯著低于CK。T1變溫處理的第2個內肽酶活性高峰出現(xiàn)在變黃72 h時，此時內肽酶活性與其他2個處理存在顯著性差異。烘烤變黃結束時，各工藝處理的煙葉內肽酶活性表現(xiàn)為T1>T2>CK，且T1處理的煙葉內肽酶活性顯著大于CK、T2。由此可見，T1變溫工藝處理對煙葉內肽酶活性具有顯著影響，有利于大分子蛋白質物質的降解和游離氨基酸的積累。

2.2.3? 谷草轉氨酶活性的變化

由圖4-A可知，T1、T2變溫處理的煙葉谷草轉氨酶活性呈先升后降而后又升的變化趨勢，CK處理的煙葉谷草轉氨酶

活性則呈先升后降再升而后又降的“M”形變化趨勢。2個變溫處理的煙葉谷草轉氨酶活性在變黃前期整體上低于CK處理，在72 h時酶活性迅速上升。烘烤變黃期結束時，T1變溫處理的煙葉谷草轉氨酶活性顯著高于其他處理。

2.2.4? 谷丙轉氨酶活性變化

烘烤過程中煙葉谷丙轉氨酶活性的分析結果（圖4-B）表明，谷丙轉氨酶活性表現(xiàn)出的變化規(guī)律與谷草轉氨酶活性具有極大相似性，CK處理下都為“M”形變化趨勢，T1、T2變溫工藝處理下，均為先升再降而后又升的變化趨勢。烘烤變黃期結束時，各處理的谷丙轉氨酶活性表現(xiàn)為T1>T2>CK，各處理間存在顯著性差異。表明，隨著烘烤變黃期進程的推進，T1變溫處理的煙葉整體上維持較高的酶活性。

2.3? 變溫烘烤過程中煙葉氮代謝物質含量與相關酶活性的通徑分析

2.3.1? 可溶性蛋白質含量與相關酶活性的通徑分析

為研究烘烤變黃過程中煙葉的中性蛋白酶、內肽酶、谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶活性對可溶性蛋白質含量變化的具體影響，對其進行通徑分析，結果表明不同工藝處理下，煙葉各酶活性因素與可溶性蛋白質含量變化均為負相關關系。由表5可知，CK處理的各類酶活性因素與可溶性蛋白質含量的相關系數(shù)絕對值表現(xiàn)為谷丙轉氨酶>谷草轉氨酶>內肽酶>中性蛋白酶，谷丙轉氨酶活性對可溶性蛋白質含量變化的直接影響最大，其余酶活性因素的直接影響相對較小。T1變溫處理的各類酶活性因素與可溶性蛋白質含量的相關系數(shù)絕對值表現(xiàn)為谷草轉氨酶>谷丙轉氨酶>內肽酶>中性蛋白酶，谷草轉氨酶活性對可溶性蛋白質含量變化的直接影響大于內肽酶；說明隨著烘烤變黃期的推進，谷草轉氨酶活性對可溶性蛋白質含量變化處于主導地位。T2變溫處理的各類酶活性因素與可溶性蛋白質含量變化的相關系數(shù)絕對值表現(xiàn)為谷丙轉氨酶>谷草轉氨酶>內肽酶>中性蛋白酶，其中谷丙轉氨酶活性對煙葉可溶性蛋白質含量的直接影響最大，對可溶性蛋白質的降解起到重要作用。

2.3.2? 游離氨基酸含量與相關酶活性的通徑分析

為研究烘烤變黃過程中煙葉的中性蛋白酶、內肽酶、谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶活性對游離氨基酸含量變化的具體影響，對其進行通徑分析，結果表明不同工藝處理下，煙葉的各類酶活性因素與游離氨基酸變化均為正相關關系。由表6可知，CK處理的各類酶活性因素與游離氨基酸含量的相關系數(shù)表現(xiàn)為谷草轉氨酶>谷丙轉氨酶>內肽酶>中性蛋白酶，其中谷丙轉氨酶活性對游離氨基酸含量變化的直接作用最大，谷草轉氨酶通過谷丙轉氨酶對游離氨基酸的間接影響作用最大。T1處理的各類酶活性因素與游離氨基酸含量的相關系數(shù)表現(xiàn)為谷草轉氨酶>內肽酶>谷丙轉氨酶>中性蛋白酶，其中內肽酶活性對游離氨基酸含量變化具有較大的直接影響，中性蛋白酶活性對游離氨基酸含量變化的總間接影響作用最大。T2變溫處理的各類酶活性與游離氨基酸含量變化的相關系數(shù)表現(xiàn)與對可溶性蛋白質含量的表現(xiàn)一致，谷丙轉氨酶活性對游離氨基酸含量變化影響的直接作用大于內肽酶，處于主導地位，而谷草轉氨酶活性在游離氨基酸的積累過程中起到很大程度上的間接影響。

3? 討論與結論

煙葉烘烤是一種處理煙葉的方法，可以通過在人為調控，在特定環(huán)境中對煙葉進行干燥和生理生化變化處理，以彰顯煙葉的質量特色。變黃期是淀粉、蛋白質和色素等大分子物質降解最為關鍵的時期，煙葉內的物質反應在該過程中最為強烈^[17-19]。烘烤后煙葉中殘留的蛋白質會對煙葉的色、香、味產生不利影響，蛋白質的降解情況是評估煙葉質量的一個重要方面。在煙葉烘烤過程中，氮代謝相關酶的活性變化直接決定蛋白質的降解程度^[20-21]。因此，在密集烘烤過程中須精準控制溫濕度等環(huán)境參數(shù)，以確保煙葉質量達到最佳狀態(tài)。本試驗結果表明，不同烘烤工藝處理條件下，煙葉的可溶性蛋白質、游離氨基酸含量及氮代謝相關酶活性的變化規(guī)律在整體上具有相似性?？扇苄缘鞍踪|在變黃期不斷降解，游離氨基酸活性與可溶性蛋白質含量表現(xiàn)出相互制約的關系，并且呈逐漸增加的變化規(guī)律，這與陳頤等的研究結果^{[11，22]}一致。

本試驗結果表明，烘烤過程中CK處理煙葉的中性蛋白酶活性呈先升后降再升而后又降的“三波峰曲線”，這與艾復清等的研究結果^[23]不一致，可能與當?shù)睾婵竟に?、烤煙品種、裝煙容量等不一致有關。T1、T2變溫處理條件下，煙葉的中性蛋白酶活性變化與艾復清等的研究結果^[23]基本一致。內肽酶、中性蛋白酶活性的變化趨勢相互吻合，這與賀帆等的研究結果^[12]一致。谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶活性在變黃烘烤過程中的變化趨勢整體上基本一致，其中CK處理下呈先升后降再升而后又降的“M”形變化趨勢；而T1、T2變溫處理條件下轉氨酶活性在變黃期并未表現(xiàn)出“M”形的變化趨勢，且轉氨酶活性高峰出現(xiàn)時間晚于CK處理，這可能是由于2個變溫工藝處理處于變溫初始階段，控制器干球溫度升高，煙葉水分散失較多，膜脂過氧化作用較強，煙葉轉氨酶失活較快引起。變黃階段的溫濕度條件對烘烤過程中煙葉氮代謝相關酶類的活性產生顯著影響，適宜的溫濕度條件可使煙葉處于氧化還原的平衡狀態(tài)，從而有利于提高氮代謝相關酶類的活性，促使煙葉中大分子含氮化合物充分降解^[24-25]。T1、T2這2個變溫工藝處理下，煙葉氮代謝相關酶活性在變黃初期低于CK處理，這是由于在變溫初始階段，干球溫度升高，不利于煙葉內酶活性維持較高水平，此時可溶性蛋白質降解程度小，游離氨基酸積累量較少。當變溫工藝處理在 38 ℃ 的基礎上開始降溫，引起烤房干球溫度降低，使煙葉酶活性表達量達到較高水平，此時煙葉中蛋白質等含氮大分子化合物降解程度大，游離氨基酸積累量較多。李常軍等的研究結果也表明，在較高溫度條件下烘烤變黃，煙葉蛋白酶活性散失迅速，導致蛋白質降解速度減慢，降解量也相應減少；同時，氨基酸的積累速度和積累量也會受到極大影響^[26-27]。T1變溫處理的游離氨基酸含量在大部分時期高于T2，這可能是由于T2變溫處理在降溫過程中溫度降至過低，升溫過程中溫度升至過高，使煙葉內各類酶活性處于不適宜溫度環(huán)境中，致使可溶性蛋白質降解速率和程度變小，游離氨基酸積累量少。王愛華等的研究結果也表明，煙葉內部的各種物質變化反應受適宜范圍內溫度的影響，主要酶類的活性和作用時間也是如此，從而對大分子物質的降解產生影響^[28]。

在云南當?shù)爻Ｒ?guī)烘烤工藝主變黃溫度38 ℃的基礎上，通過設置不同變溫幅度和變溫頻率，對變黃期煙葉進行2個變溫處理。本試驗認為，對密集烤房烘烤變黃期變溫幅度和變溫頻率進行合理調控，可明顯影響煙葉品質。在變溫幅度為±1 ℃和變溫頻率為3 h的處理條件（T1）下，煙葉的中性蛋白酶、內肽酶、轉氨酶活性保持較高水平，并且存在相對較長的作用時間，這有利于煙葉可溶性蛋白質的降解和游離氨基酸的積累，對煙葉品質的形成具有重要作用。有關密集烤房烘烤過程中煙葉氮代謝酶相關基因表達，還有待進一步研究。

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