王靜,李亞群,汪海燕,宋曜如,李靜,3,王文鑫,3,萬(wàn)林鈺,周春保,范興*,王福生*
1中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院,安徽合肥 230001;2解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心感染病醫(yī)學(xué)部/國(guó)家感染性疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心,北京 100039;3北京大學(xué)302臨床醫(yī)學(xué)院,北京 100039
新 型 冠 狀(新 冠)病 毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)疫苗是預(yù)防新冠病毒感染(coronavirus disease,COVID-19)重癥化及死亡的重要手段。截至2022年12月,全球范圍內(nèi)已接種疫苗130 億劑次,其中1/4 為滅活病毒疫苗[1]。盡管接種滅活疫苗的人群基數(shù)大,但與mRNA 疫苗或腺病毒疫苗相比,關(guān)于滅活疫苗誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)的研究較少。
當(dāng)下流行的Omicron 毒株逃逸中和抗體的能力強(qiáng),難以避免突破感染[2],新冠病毒免疫應(yīng)答的研究重點(diǎn)開(kāi)始從保護(hù)機(jī)體免受感染(主要由抗體介導(dǎo))轉(zhuǎn)向降低機(jī)體感染后疾病重癥化的風(fēng)險(xiǎn)(主要由細(xì)胞免疫介導(dǎo))[3-5]。多項(xiàng)研究表明,T細(xì)胞在預(yù)防疾病嚴(yán)重程度方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用[6-7]。與體液免疫相比,細(xì)胞免疫具有抗原表位保守及衰退速度慢等多方面的優(yōu)勢(shì)[8-9]。mRNA 疫苗只能誘導(dǎo)S 蛋白特異性T 細(xì)胞反應(yīng),滅活疫苗具有N、M、E 等其他抗原蛋白,從而能誘導(dǎo)更加廣譜的特異性T 細(xì)胞應(yīng)答[10-11]。既往關(guān)于滅活疫苗T 細(xì)胞應(yīng)答的研究主要集中在接種疫苗后的短期效應(yīng)上,且缺乏對(duì)抗原特異性T 細(xì)胞表型的詳細(xì)分析[12]。為探究滅活疫苗誘導(dǎo)的SARSCoV-2特異性T細(xì)胞反應(yīng)的特征及持久性,本研究分析了15名成年個(gè)體接種2劑滅活疫苗12個(gè)月后外周血中特異性T 細(xì)胞的水平及表型特點(diǎn),并探討了其臨床意義。
1.1 一般資料 納入來(lái)自解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心2022 年4-6 月招募的15 名醫(yī)護(hù)人員。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)年齡≥18 歲;(2)接種過(guò)2 劑新冠滅活疫苗。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)對(duì)疫苗成分有過(guò)敏反應(yīng)史;(2)既往有SARS-CoV-2感染史;(3)既往有精神疾病或藥物依賴(lài)史;(4)不同意參與研究。本研究獲得解放軍總醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(審批號(hào):2020-013-D)。所有受試者在采血前簽署書(shū)面知情同意書(shū)。15 名研究對(duì)象的中位數(shù)年齡為26(23~45)歲;其中男4名,女11名;均無(wú)吸煙史、飲酒史及過(guò)敏史。所有個(gè)體均接種2 劑滅活疫苗,其中接種北京科興滅活疫苗12名,北京生物滅活疫苗3名,2劑疫苗接種間隔28 d[13],在接種第2劑疫苗351(342~408)d后,收集其外周靜脈血,分析抗原特異性T細(xì)胞反應(yīng)。
1.2 方法
1.2.1 外周血標(biāo)本及淋巴細(xì)胞分離 用EDTA-K2 采血管(美國(guó)BD 公司)收集受試者外周靜脈血8~10 ml,4 h 內(nèi) 分 離 外 周 血 單 個(gè) 核 細(xì) 胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),室溫環(huán)境下以2000 r/min離心10 min,吸取上清血漿保存于-80 ℃,下層部分與等體積PBS混勻后均勻鋪于Ficoll淋巴細(xì)胞分離液上,調(diào)整升速及降速至最低檔,以2500 r/min 離心20 min,吸取白膜層,補(bǔ)加PBS 至10 ml,充分混勻后,以2000 r/min離心15 min,洗滌細(xì)胞。計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106~1×107個(gè)/ml,加入1 ml 細(xì)胞凍存液,于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.2 活 化 誘 導(dǎo) 標(biāo) 記 法(activation-induced markers,AIM)檢測(cè)SARS-CoV-2 特異性T 細(xì)胞[14]將1×106個(gè)PBMCs細(xì)胞置于96孔圓底板中,S組、NS組分別加入5 μg/ml SARS-CoV-2 Spike、Non-spike 特異性肽池(附表,江蘇南京金斯瑞公司合成),加入100 μl無(wú)血清培養(yǎng)基(美國(guó)Thermo 公司),2 h 后加入等體積含10%成人血清(北京科霖恩公司)的完全培養(yǎng)基,在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。將等摩爾量的二甲基亞砜(DMSO,德國(guó)WAK 公司)加入DMSO 組,作為陰性對(duì)照。24 h 后收集細(xì)胞,加入流式抗體CD14-BV510、 CD16-BV510、 CD19-BV510、 CD56-BV510、CD4-AF700、CD8-PerCP-Cy5.5、CD69-BV421、OX40-PE、CD137-APC、CD45RA-BV605、CD27-PECy7、CXCR3-APC-Cy7、CCR6-BV650、CXCR5-BV711(美 國(guó)Biolegend 公 司)及Fixable Viability Stain 510、CD3-BUV395、CCR7-BUV496(美國(guó)BD 公司),混合均勻后于4 ℃孵育0.5 h進(jìn)行表面染色,PBS洗滌,加入200 μl 含1%多聚甲醛的固定液固定細(xì)胞,并于24 h內(nèi)置于FACS Symphony A5型流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 9.0.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以例(%)表示,組間比較采用卡方檢驗(yàn);連續(xù)變量以中位數(shù)表示,組間比較采用Wilcoxon 檢驗(yàn)(配對(duì)數(shù)據(jù))或Mann-Whitney U 檢驗(yàn)(非配對(duì)數(shù)據(jù))。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 成年人接種2 劑新冠滅活疫苗12 個(gè)月后T 細(xì)胞應(yīng)答水平 接種第2 劑疫苗后,與DMSO 組相比,大部分個(gè)體SARS-CoV-2特異性CD4+T細(xì)胞反應(yīng)水平升 高(S 組: 14/15, P=0.0001; NS 組: 15/15,P<0.0001)。S 組 特 異 性CD8+T 細(xì) 胞 反 應(yīng) 水 平 比DMSO 組 略 升 高(12/15,P=0.0463),NS 組 特 異 性CD8+T 細(xì)胞反應(yīng)水平與DMSO 組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(12/15,P=0.0806),故本研究主要研究CD4+T細(xì)胞免疫應(yīng)答情況。相較于Spike抗原,Non-spike抗原表位同樣也能誘導(dǎo)高水平的特異性CD4+T細(xì)胞反應(yīng)(P<0.0001,圖1)。
2.2 成年人接種2劑新冠滅活疫苗12個(gè)月后抗原特異性T 細(xì)胞記憶表型特征 接種2 劑新冠滅活疫苗12 個(gè)月后,總CD4+T 細(xì)胞主要由中央記憶細(xì)胞(central memory,CM:CD45RA-CD27+CCR7+)、1 型效應(yīng)記憶細(xì)胞(effector memory 1,EM1:CD45RA-CD 27+CCR7-)及3 型效應(yīng)記憶細(xì)胞(effector memory 3,EM3:CD45RA-CD27-CCR7-)組成。與總CD4+T 細(xì)胞相比,抗原特異性CD4+T 細(xì)胞中CM 表型占比增加(S組:64.5% vs.32.8%,P=0.0001;NS組:60.6% vs.32.8%,P<0.0001),EM3表型占比下降(S組:2.6% vs.24.4%,P<0.0001;NS 組:1.0% vs.24.4%,P<0.0001)。Spike抗原與Non-spike抗原誘導(dǎo)的抗原特異性T細(xì)胞記憶表型差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,圖2)。
2.3 成年人接種2劑新冠滅活疫苗12個(gè)月后抗原特異性T 細(xì)胞分化亞群表型特征 接種2 劑滅活疫苗12個(gè)月后,總CD4+T細(xì)胞主要由濾泡輔助性T細(xì)胞(follicular helper T cell,TFH:CXCR5+)、1 型輔助性T 細(xì)胞(T helper 1,Th1:CXCR5-CXCR3+CCR6-)及2 型輔助性T 細(xì)胞(T helper 2,Th2:CXCR5-CXCR 3-CCR6-)組成。與總CD4+T細(xì)胞相比,抗原特異性CD4+T 細(xì)胞表型主要表現(xiàn)為T(mén)h2 及1/17 型輔助性T細(xì) 胞(T helper 1/17,Th1/17:CXCR5-CXCR3+CCR 6+)表 型,TFH 及Th1 表 型CD4+T 細(xì) 胞 比 例 較 低(TFH:S 組 為8.6% vs.18.7%,P=0.0006,NS 組 為5.3% vs.18.7%,P<0.0001;Th1:S組為3.8% vs.24.3% ,P<0.0001,NS 組為2.1% vs.24.3%,P<0.0001)。Spike抗原與Non-spike抗原特異性CD4+T細(xì)胞亞群分化表型方面無(wú)明顯差別(P>0.05,圖3)。
SARS-CoV-2 突變株,尤其是Omicron 的出現(xiàn)從根本上改變了COVID-19的流行方式及防疫政策的制定。Omicron突變株能夠逃避基于武漢原始毒株疫苗誘導(dǎo)的抗體中和能力[3-4],而細(xì)胞免疫成為預(yù)防感染重癥化的關(guān)鍵[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn),成年人接種2劑滅活疫苗12個(gè)月后,體內(nèi)仍能檢測(cè)到SARS-CoV-2特異性CD4+T細(xì)胞,且Non-spike也可以作為優(yōu)勢(shì)抗原引起較強(qiáng)的抗原特異性CD4+T細(xì)胞反應(yīng)。SARS-CoV-2特異性CD4+T 細(xì)胞以CM 及EM1記憶表型為主,暗示了其具有較強(qiáng)的維持能力;同時(shí)病毒特異性CD4+T 細(xì)胞大量富集Th2 及Th1/17 表型??傊?,這些數(shù)據(jù)證實(shí)新冠滅活疫苗能誘導(dǎo)廣泛且持久的抗病毒CD4+T 細(xì)胞反應(yīng),可能是在Omicron 毒株大流行的情況下減輕感染者疾病嚴(yán)重程度的關(guān)鍵。
本研究發(fā)現(xiàn),滅活疫苗能夠誘導(dǎo)強(qiáng)烈的Spike及Non-spike 抗原特異性CD4+T 細(xì)胞反應(yīng)。除SARSCoV-2 病毒Spike 之外的抗原蛋白,如N、M、NSP3等,同樣能誘導(dǎo)強(qiáng)烈的T 細(xì)胞反應(yīng),是誘導(dǎo)細(xì)胞免疫的重要抗原[17]。mRNA疫苗引起的抗原負(fù)荷較高,能誘導(dǎo)強(qiáng)烈的體液免疫,但mRNA 疫苗是針對(duì)Spike蛋白設(shè)計(jì)的疫苗,只能誘導(dǎo)Spike特異性的T細(xì)胞反應(yīng)[18]。滅活疫苗具有較強(qiáng)的體液免疫效應(yīng),而誘導(dǎo)細(xì)胞免疫的能力較弱,但其具有SARS-CoV-2的所有抗原蛋白,誘導(dǎo)的T 細(xì)胞反應(yīng)更廣泛,具有與mRNA 疫苗相當(dāng)?shù)募?xì)胞免疫誘導(dǎo)能力[11]。本研究進(jìn)一步證實(shí)了滅活疫苗接種者T 細(xì)胞反應(yīng)的廣泛性,提示其能在Omicron 疫情期間發(fā)揮重要的免疫保護(hù)作用。
有研究表明,SARS-CoV-2 感染康復(fù)者及健康個(gè)體在mRNA 疫苗接種后至少6 個(gè)月內(nèi)能維持穩(wěn)定的細(xì)胞免疫水平[9]。接種2劑滅活疫苗4個(gè)月后,健康個(gè)體體內(nèi)T 細(xì)胞免疫反應(yīng)水平隨時(shí)間延長(zhǎng)而下降,但在感染康復(fù)者體內(nèi)誘導(dǎo)了持久的T 細(xì)胞反應(yīng)[19]。本研究探討了成年人接種2劑滅活疫苗后T細(xì)胞免疫反應(yīng)的持續(xù)性,發(fā)現(xiàn)滅活疫苗誘導(dǎo)的CD4+T細(xì)胞免疫反應(yīng)至少能持續(xù)12 個(gè)月,且以CM 及EM1 記憶表型為主,暗示了其具有很強(qiáng)的持續(xù)能力。目前國(guó)內(nèi)正經(jīng)歷Omicron 毒株快速傳播的時(shí)期,但感染者重癥化比例及病死率都很低,這可能與滅活疫苗誘導(dǎo)的T細(xì)胞免疫反應(yīng)有關(guān)[20-21]。
本研究發(fā)現(xiàn),滅活疫苗誘導(dǎo)的T 細(xì)胞免疫反應(yīng)主要是CD4+T細(xì)胞免疫反應(yīng)。由于抗原遞呈方式等方面的差異,滅活疫苗主要誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞免疫反應(yīng),而誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力較弱[11]。另外,與抗原特異性CD4+T 細(xì)胞相比,抗原特異性CD8+T細(xì)胞的衰減速度更快,在接種疫苗6個(gè)月后,大部分個(gè)體已不能檢測(cè)到抗原特異性CD8+T 細(xì)胞反應(yīng)[9]。
CD4+T細(xì)胞亞群分化受到TCR信號(hào)強(qiáng)弱及微環(huán)境中細(xì)胞因子的影響[22]。本研究發(fā)現(xiàn),接種疫苗12個(gè)月后,抗原特異性CD4+T細(xì)胞以Th2及Th1/17為主。其中,高比例Th2 表型抗原特異性CD4+T 細(xì)胞的出現(xiàn),可能是由于隨著時(shí)間的推移,CD4+T細(xì)胞活化狀態(tài)的改變以及CXCR5、CCR6、CXCR3 等標(biāo)志物表達(dá)下調(diào)造成的,CXCR5-CXCR3-CCR6-表型的CD4+T 細(xì)胞中只有一部分表達(dá)Th2 相關(guān)效應(yīng)分子[7,23]。Th1/17 表型CD4+T 細(xì)胞是一種中間分化態(tài)的細(xì)胞亞群,能夠分泌Th1及Th17亞群相關(guān)的細(xì)胞因子,可能會(huì)通過(guò)分泌Th1 相關(guān)細(xì)胞因子,發(fā)揮抗病毒免疫反應(yīng)的作用[24]??乖禺愋訡D4+T細(xì)胞中這兩個(gè)亞群的細(xì)胞是否具有相應(yīng)的功能,仍需要進(jìn)一步研究。
本研究尚存在一些局限性:一是僅檢測(cè)了抗原特異性CD4+T細(xì)胞的水平及表型特點(diǎn),疫苗接種后抗體水平、記憶B 細(xì)胞水平未研究;二是未排除其他冠狀病毒感染,無(wú)法除外有交叉反應(yīng)的個(gè)體;三是受試者樣本量少,且只隨訪(fǎng)1 次,未能檢測(cè)到基線(xiàn)及接種疫苗后T 細(xì)胞水平的動(dòng)態(tài)變化,后續(xù)研究中可適當(dāng)增加隨訪(fǎng)次數(shù)及樣本量,以探索T 細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化。
綜上所述,本研究描述了成年人接種2 劑滅活疫苗后長(zhǎng)期記憶性CD4+T 細(xì)胞的水平及表型特點(diǎn)。在Omicron 大流行的時(shí)期,大量接種滅活疫苗誘導(dǎo)的廣泛且持續(xù)的CD4+T 細(xì)胞反應(yīng)是免疫保護(hù)的關(guān)鍵。本研究為后續(xù)基于T 細(xì)胞免疫應(yīng)答的新冠病毒疫苗開(kāi)發(fā)提供了新的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。