吳逸卓, 黃俊鑫, 丁曉維, 于 昱

(上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院心血管發(fā)育與再生醫(yī)學研究所, 上海 200092)

SOX轉錄因子家族在1990年由于哺乳動物Y染色體性別決定區(qū)(Sex determining region of Y,SRY)中HMG盒的高度保守性而首次被發(fā)現[1]。按照基因構成和功能可分為9個家族(A、B1、B2、C、D、E、F、G、H)[2]。其中SOX7通常在轉錄水平上參與胚胎脈管系統(tǒng)的發(fā)育[3]。在E7.5的小鼠胚胎中,SOX7+的細胞占內皮前體細胞中ETV2+/FLK1+/CD41-細胞的97%,說明SOX7可能是早期血管發(fā)生的重要調節(jié)因子[4]。在動脈粥樣硬化病變早期,血管內膜增厚,出現缺氧環(huán)境,血管內皮細胞功能發(fā)生改變[5],而SOX7是內皮相關轉錄因子,調控血管功能。研究顯示,SOX7突變體斑馬魚的脈管系統(tǒng)出現顯著的血管異位連接[6]。在高級別膠質瘤患者中,SOX7促進血管形成異常[7]。因此,SOX7與血管內皮細胞之間的聯系有待深入探索。本研究通過構建SOX7穩(wěn)定表達細胞株,分析缺氧條件下SOX7對人臍靜脈內皮細胞株(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)功能的影響,以期進一步探究SOX7對動脈粥樣硬化早期病變的具體作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞人胚腎細胞系(293T細胞)、人臍靜脈內皮細胞系(HUVECs)、pcDNA3.1(+)-SOX7質粒、pHAGE-CMV-MCS-IRES-ZsGreen慢病毒過表達載體(以下簡稱pHAGE空載體)及相關輔助質粒(psPAX2和pMD2.G)由新華醫(yī)院心血管發(fā)育與再生醫(yī)學研究所保存。

1.2 試劑與儀器NheI-HF(貨號:R3131V)、NotI-HF(貨號:R3189V)均購自美國NEB公司;無內毒素質粒小提中量試劑盒(離心柱型)(貨號:DP118-02)、無內毒素質粒大提試劑盒(離心柱型)(貨號:DP117)、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(增強型)(貨號:DP219-02)均購自天根生化科技(北京)有限公司;ClonExpress II One Step Cloning Kit(貨號:C112-01)、Ultra Gelred(貨號:GR501-AA)、ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix(貨號:Q411-02)均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;Agarose(Low EEO)(貨號:ST004Q)、BeyoPureTMLB Broth with Agar(premixed powder)(貨號:ST158)、BeyoPureTMLB Broth(premixed powder)(貨號:ST156)、Ampicillin(100 mg/mL,1 000×)(貨號:ST008)、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(H+L)(貨號:A0208)、CCK-8試劑盒(貨號:C0039)、polybrene(貨號:C0351)均購自上海碧云天生物技術有限公司;高糖DMEM培養(yǎng)基(貨號:L110KJ)、0.25%胰酶EDTA溶液(貨號:S310KJ)購自上海源培生物科技股份有限公司;SOX7 Polyclonal antibody(貨號:23925-1-AP)、GAPDH Monoclonal antibody(貨號:60004-1-Ig)均購自武漢三鷹生物技術有限公司;Stbl3感受態(tài)細胞(新賽美生物,貨號:MC012);PEI 250000(美國,Polysciences公司,貨號:24314-2);胎牛血清(以色列,BI公司,貨號:04-001-1ACS);PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)(貨號:RR036A)、RNAiso Plus(貨號:9109)購自日本TaKaRa公司。超凈工作臺(型號:51900900)、三氣培養(yǎng)箱(型號:51033781)均購自美國Thermo Fisher Scientific公司;熒光顯微鏡(德國,ZEISS公司,型號:Axio Vert.A1);梯度PCR儀(型號:C1000)、熒光定量PCR儀(型號:CFX96)、垂直電泳儀(型號:1658000)、膜轉移裝置(型號:1703930)、化學發(fā)光成像儀(型號:12003154)均購自伯樂生命醫(yī)學產品(上海)有限公司;高速離心機(德國,Eppendorf公司,型號:5424R);多功能酶標儀(瑞士,TECAN公司,型號:spark)。

1.3 方法

1.3.1 構建SOX7過表達載體 使用限制性內切酶NheI-HF和NotI-HF雙酶切pHAGE空載體,通過瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒得到線性的載體骨架。以pcDNA3.1(+)-SOX7和pHAGE載體為模版設計引物,PCR擴增SOX7。SOX7引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,引物序列見表1。使用Clon Express II One Step Cloning Kit進行同源重組后轉化涂板。挑克隆搖菌,測序得到正確的重組載體。

表1 PCR引物序列設計

1.3.2 慢病毒包裝及濃縮使用 PEI250000進行質粒轉染。以10 cm培養(yǎng)皿為例,500 μL Opti-MEM無血清培養(yǎng)基中加入9 μg質粒(穿梭質?！胮sPAX2∶pMD2.G =3∶2∶1比例),另取500 μL Opti-MEM無血清培養(yǎng)基加入27 μL PEI250000(濃度為1 μg/μL),靜置5 min。將兩者混勻,繼續(xù)靜置15 min,加入培養(yǎng)皿。轉染后6 h換液,在48 h、72 h時取上清,使用0.45 μm濾網過濾。加入10% PEG6000混勻,4℃靜置1.5 h,每20 min上下顛倒。預冷離心機,8 000 r/min,離心10 min。去除上清,使用無血清DMEM重懸沉淀,分裝,-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 慢病毒感染HUVEC 取對數生長期的HUVECs接種至10 cm培養(yǎng)皿中,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細胞密度達50%時,分別加入濃縮后的pHAGE慢病毒懸液和SOX7-pHAGE慢病毒懸液,各100 μL,同時各加入8 μL polybrene,感染24 h后換液。感染后48～72 h在激發(fā)波長為488 nm的熒光顯微鏡下均可觀察到綠色熒光。以上步驟重復數次,直至可觀測到綠色熒光。

1.3.4 qPCR檢測mRNA表達水平 將細胞接種至6孔板中,用RNAiso PLUS提取RNA并測定濃度。取1 μg的RNA和5 μL 5×PrimeScriptTMRT Master Mix (Perfect Real Time),DEPC水補足至10 μL,按照設定程序在PCR儀進行逆轉錄。qPCR體系:ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix(5 μL)、10 μmol/L的Primer-F和Primer-R各0.2 μL、DEPC水(5.4 μL)、未稀釋的cDNA(1 μL),按照設定程序在PCR儀進行熒光定量。實驗重復3次。

1.3.5 免疫印跡(Western blot)檢測 蛋白表達水平將細胞接種至6孔板中,使用放射免疫沉淀蛋白裂解液提取蛋白,BCA法測定蛋白濃度。使用10%聚丙烯酰胺凝膠于80 V恒壓電泳,直至溴酚藍電泳至凝膠底部,后250 mA恒流轉膜60 min。室溫,5%BSA溶液封閉75 min,TBST洗膜5 min×3次,加入一抗,4℃孵育14～16 h,第二天使用TBST洗膜5 min×3次,加入二抗,室溫孵育1 h。繼續(xù)使用TBST洗膜5 min×3次后,進行化學發(fā)光。

1.3.6 細胞劃痕實驗 取對數生長期的HUVECs,用胰酶(0.25%)37℃消化,對細胞懸液進行計數,并稀釋至2.5×105個/mL。在6孔板每孔中接種2 mL細胞懸液,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜,使細胞密度達100%。次日,使用同一槍頭在培養(yǎng)皿底部劃痕,PBS洗4次,清除漂浮細胞,加入無血清DMEM,分別置于37℃、5%CO2和37℃、5%CO2、1%O2培養(yǎng)箱培養(yǎng),0、24 h拍照記錄。劃痕結果用Image J軟件進行分析。實驗重復3次。

1.3.7 CCK-8細胞增殖實驗 根據梁慧敏等[8]的研究結果,本研究以48 h為節(jié)點研究缺氧條件下SOX7對HUVECs增殖功能的影響。取對數生長期的HUVECs,用胰酶(0.25%)37℃消化,對細胞懸液進行計數后稀釋至2×104個/mL,96孔板每孔接種100 μL,分別置于37℃、5%CO2和37℃、5%CO2、1%O2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。去除原培養(yǎng)液,PBS清洗,加入100 μL含10%CCK-8溶液的完全培養(yǎng)基,在原培養(yǎng)條件下繼續(xù)孵育1 h。使用酶標儀于450 nm處測定吸光度值。實驗重復3次。

2 結果

2.1SOX7重組慢病毒載體的構建通過對PCR擴增獲得產物進行電泳,可看到長度分別為7 724 bp的載體片段條帶和1 167 bp的SOX7基因條帶,見圖1。SOX7-pHAGE重組質粒的DNA測序結果證實,SOX7基因成功插入至限制性內切酶NotI位點(GCGGCCGC)和NheI位點(GCTAGC)之間,見圖2、3。

注： A, pHAGE空載體雙酶切產物膠圖; B, PCR擴增產物膠圖。

圖2 SOX7-pHAGE重組質粒圖譜

圖3 SOX7-pHAGE重組質粒的DNA測序峰圖

2.2SOX7重組慢病毒載體mRNA和蛋白表達的驗證與pHAGE空載體的SOX7比較,SOX7- pHAGE重組質粒在mRNA水平上顯著升高約111.4倍(P=0.002 8),在蛋白質水平上出現過表達條帶?？蛰d體未檢測出條帶,而SOX7- pHAGE重組質粒檢測到清晰條帶,見圖4。

注:A,qPCR檢測SOX7 mRNA表達量統(tǒng)計圖; B, Western blot檢測SOX7蛋白表達電泳圖

2.3 構建SOX7穩(wěn)定感染細胞株在激發(fā)波長為488 nm處的熒光顯微鏡下可觀察到SOX7穩(wěn)定感染細胞株發(fā)出綠色熒光,見圖5。qPCR和Western blot結果顯示,SOX7穩(wěn)定感染細胞株中SOX7在mRNA水平上顯著升高68.2倍(P=0.003 0),在蛋白水平上顯著升高1.7倍(P=0.004 3),SOX7穩(wěn)定感染細胞系構建成功,見圖6。

圖5 慢病毒感染HUVECs后的熒光表達結果(40×)

注：A,qPCR檢測SOX7 mRNA表達量統(tǒng)計圖; B,Western blot檢測SOX7蛋白表達電泳圖;與空載體穩(wěn)定感染細胞株比較,P=0.003 0,P=0.004 3。

2.4 缺氧條件下SOX7對HUVECs遷移的影響細胞劃痕實驗結果顯示,在缺氧條件下,空載體穩(wěn)定感染細胞株的遷移能力降低至常氧條件的0.88倍(P=0.007 6),而SOX7穩(wěn)定感染細胞株則可改善細胞的遷移能力,使其增強約1.2倍(P=0.004 4)。在常氧條件下,空載體穩(wěn)定感染細胞株與SOX7穩(wěn)定感染細胞株對遷移能力無影響(P>0.999 9),見圖7。

注:A-B,細胞劃痕實驗結果圖;與pHAGE空載體比較,P=0.007 6, P=0.004 4。

2.5 缺氧條件下SOX7對HUVECs增殖的影響在缺氧條件下,空載體穩(wěn)定感染細胞株的增殖能力減弱至常氧水平的0.7倍(P=0.007 6),而SOX7穩(wěn)定感染細胞株可以回補細胞增殖能力,使增殖能力增強1.4倍(P=0.022 8)。在常氧條件下,SOX7穩(wěn)定感染細胞株可促進細胞增殖,與空載體穩(wěn)定感染細胞株比較增加1.3倍(P=0.008 7),見圖8。

圖8 SOX7對HUVECs增殖的影響

3 討論

SOX7定位于8p23.1,在各類生物的基因組中具有高度保守性[9]。除調控血管發(fā)育和維持血管功能外,SOX7在其他領域中也有許多重要的發(fā)現。在乳腺癌[10]、前列腺癌[11]中SOX7表達水平下調,可作為腫瘤抑制因子及重要的腫瘤標志物。在人肺癌相關細胞系和乳腺癌細胞系中,SOX7通過上調P38和凋亡途徑相關的基因來誘導細胞凋亡,同時SOX7也可抑制泛素-蛋白酶體系統(tǒng)中促凋亡蛋白的降解[12]。除此之外,SOX7在胚胎發(fā)育(特別是心血管系統(tǒng)的發(fā)育)中也具有重要作用。有研究顯示,SOX7單倍體功能不全導致先天性膈疝發(fā)生,而缺失SOX7的第二外顯子后胚胎在膈肌發(fā)育前死亡,并伴有心包囊擴張和卵黃囊異常重塑[13]。小鼠胚胎從E7.5發(fā)育至E10.5,胚胎出現了廣泛的血管發(fā)育異常[14]。在心內膜內皮細胞中特異性敲除SOX7使心內膜墊發(fā)育不良,引起房室間隔缺損[15]。SOX7也促進心肌致密化,參與冠狀動脈發(fā)育[16]。

本研究通過構建SOX7-pHAGE重組質粒和SOX7穩(wěn)定感染細胞株,為研究動脈粥樣硬化中SOX7調控內皮細胞功能提供了理論基礎。在肺癌細胞中,過表達SOX7后細胞的遷移和增殖能力減低[17],而在乳腺癌細胞中,缺失SOX7后細胞的遷移和增殖能力增加[10]。SOX7在不同腫瘤細胞中可抑制細胞增殖和遷移能力,但涉及內皮細胞尤其是缺氧造模的疾病模型下的相關研究鮮見報道。因此,本研究重點關注SOX7對缺氧情況下血管內皮細胞的增殖與遷移能力的影響。結果顯示,在常氧條件下,SOX7穩(wěn)定感染細胞株對其遷移能力沒有影響,但促進了細胞增殖能力。這與Xu等[10]的研究結果一致。而在缺氧條件下,SOX7穩(wěn)定感染細胞株可有效回補HUVECs的遷移和增殖能力,改善血管功能。

綜上所述,本研究構建了SOX7- pHAGE重組質粒和SOX7穩(wěn)定感染細胞株。發(fā)現在常氧條件下,SOX7穩(wěn)定感染細胞株可促進HUVECs的增殖能力;在缺氧條件下,SOX7穩(wěn)定感染細胞株可回補HUVECs被抑制的遷移和增殖能力,這為研究SOX7在內皮細胞中的功能提供了細胞層面的依據。但本研究僅限于體外細胞實驗,對SOX7在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中的作用及分子機制仍需進行深入的細胞和動物實驗。