崔擁國, 楊成亮, 李曉強(qiáng), 李奕廷, 黃 昊, 劉 佳

(1廣西壯族自治區(qū)右江民族醫(yī)學(xué)院/2右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院, 廣西 百色 533000)

脊髓損傷對患者的生命健康和生活質(zhì)量造成了嚴(yán)重危害,加重了患者家庭及社會(huì)的負(fù)擔(dān)[1]。既往數(shù)據(jù)表明,每10億人中每年有約2萬例新發(fā)脊髓損傷患者,并有逐漸老齡化的趨勢[2]。脊髓受損可分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩種情況。前者是指直接或間接作用于脊髓的外部力量所造成的損傷,而后者則是指外部力量導(dǎo)致脊髓水腫、椎管內(nèi)微血管破裂形成血腫、骨折造成脊髓受壓以及椎間盤組織破裂等進(jìn)一步損害脊髓的情形。脊髓損傷患者可能面臨損傷介導(dǎo)的各種多系統(tǒng)并發(fā)癥,包括細(xì)胞凋亡和炎癥[3]。Wnt/β-catenin信號(hào)通路參與細(xì)胞增殖、神經(jīng)形成及凋亡等多種生物學(xué)過程[2]。β-catenin蛋白是一種進(jìn)化保守的多功能蛋白,是Wnt/β-catenin信號(hào)通路的關(guān)鍵核心成員,可通過與核轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合發(fā)揮對下游靶基因表達(dá)的調(diào)控作用[4]。有文獻(xiàn)[5]報(bào)道Wnt/β-catenin通路的激活在脊髓損傷中具有抗凋亡和抗炎作用。利拉魯肽是目前國際上廣泛應(yīng)用于2型糖尿病的降糖藥。近年來的研究表明,利拉魯肽可以引發(fā)自噬,防止氧化,減少神經(jīng)炎癥的發(fā)生[6]。有研究表明利拉魯肽可通過激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路在多種疾病的治療中發(fā)揮作用[7-8]。然而,利拉魯肽治療脊髓損傷的分子機(jī)制尚未明確。因此,本研究探討利拉魯肽通過Wnt/β-catenin通路對急性脊髓損傷大鼠運(yùn)動(dòng)功能、神經(jīng)細(xì)胞凋亡及炎癥因子水平的影響,為利拉魯肽治療脊髓損傷的臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 由廣東維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供60只SPF清潔級健康雄性SD大鼠[許可證號(hào):SCXK(粵)2022-0063)],鼠齡7～8周,體重280～320 g。本研究所有流程通過了右江民族醫(yī)學(xué)院動(dòng)物倫理學(xué)委員會(huì)的審核(審查號(hào):YYFY-LL-2024-217),實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格按照動(dòng)物倫理學(xué)有關(guān)規(guī)定進(jìn)行。

1.1.2 主要儀器、藥物及試劑 多功能酶標(biāo)儀(美國珀金埃爾默股份有限公司);高速冷凍離心機(jī)(HC-2518R)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司);聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction,PCR)儀(美國伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司);XAV939(純度99.49%,AbMole中國分公司);酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme linked immunosor-bent assay,ELISA)試劑盒(美國Tsz Biosciences公司);二氫乙錠(hyfrothidine,HEt)(美國Medchemex-press公司);β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、白介素6(IL-6)、胱天蛋白酶3(caspase-3)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)和β-肌動(dòng)蛋白抗體(β-actin抗體)均由abcam公司提供;山羊抗兔WB二抗(武漢博士德公司)。

1.2 急性脊髓損傷大鼠模型建立及分組60只SD大鼠隨機(jī)選取15只作為假手術(shù)組(僅接受T9～T10椎板切除術(shù)),其余45只大鼠采用改進(jìn)Allens技術(shù)建立急性脊髓損傷模型。腹腔注射戊巴比妥(50 mg/kg)進(jìn)行麻醉,消毒和切開大鼠背部,暴露棘突,去除T9～T10椎板后清晰暴露脊髓。然后,從3 cm的高度落下一個(gè)打擊器(重量10 g,直徑2 mm)打擊T10節(jié)段脊髓。造模成功判定標(biāo)準(zhǔn)為:擊打處脊髓出現(xiàn)淤血,大鼠全身抖動(dòng),雙下肢迅速退縮和顫抖,并有大小便失禁等。脊髓損傷模型建立成功后,隨機(jī)分為模型組、利拉魯肽組和利拉魯肽+XAV939組,各15只。術(shù)后各組切口每天碘伏消毒2次,青霉素4 wu/次、2次/d,共3 d,避免感染。膀胱每天按摩3次,共3天以促進(jìn)自然排尿功能的恢復(fù)。在脊髓損傷后的14 d內(nèi)每組干預(yù)措施如下:假手術(shù)組和模型組大鼠每天皮下注射50 mg/kg生理鹽水,利拉魯肽組大鼠每天皮下注射50 μg/kg利拉魯肽, 利拉魯肽+XAV939組大鼠每天皮下注射50 μg/kg利拉魯肽和0.4 mg/kg XAV939(一種Wnt/β-catenin信號(hào)通路的小分子抑制劑)。

1.3 檢測指標(biāo)

1.3.1 運(yùn)動(dòng)功能評分 采用BBB評分(Basso, Beattie &Bresnahan locomotor rating scale,BBB scale)對脊髓損傷大鼠干預(yù)后下肢功能恢復(fù)情況進(jìn)行評估。方法如下:將大鼠置于一個(gè)寬敞的開口容器內(nèi),用近距離的方式觀察大鼠在爬行時(shí)后肢各關(guān)節(jié)的活動(dòng)能力與協(xié)調(diào)性。評分范圍為0～21分,分別于術(shù)前、干預(yù)后第7天、第14天對大鼠下肢運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)行評估,分值較高的大鼠下肢功能恢復(fù)較好。實(shí)驗(yàn)采用雙盲、兩人獨(dú)立打分法。每只大鼠重復(fù)測定3次,取平均值并記錄。

1.3.2 Western blot分析 術(shù)后干預(yù)的第14天,腹腔注射戊巴比妥(50 mg/kg)麻醉大鼠,并切開T8-11脊髓。用放射免疫沉淀法裂解緩沖液中的均質(zhì)組織。然后,使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度,調(diào)整至2 μg/μL,并用12%分離膠分離蛋白質(zhì)。隨后,蛋白質(zhì)被轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。將膜置于5%脫脂奶粉中,室溫密封1 h,與一抗β-catenin、IL-6、caspase-3、TNF-α和β-actin(均為1∶1 000),在4℃慢搖床環(huán)境下孵育過夜,第2天1×TBST清洗PVDF膜3次,每次5 min,后放入二抗稀釋液稀釋的二抗(1∶5 000,武漢博士德公司)室溫慢搖床60 min,再用1×TBST清洗3次,每次5 min,用UVP凝膠電泳儀對其進(jìn)行圖像處理。利用ImageJ2X軟件對蛋白質(zhì)條的灰度值進(jìn)行計(jì)算,并與β-actin的灰度值進(jìn)行比較和分析。

1.3.3 蘇木精-伊紅染色及尼氏染色 (1)蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eosin,HE)染色步驟:冰凍切片取自脊髓損傷中央3 mm處接近尾部的組織,厚8 μm。-80℃冰箱中移出切片,4℃的冷藏室中放置30 min,室溫下復(fù)溫20 min;切片置于染盒中,0.01 mol/L PBS溶液洗片3次,每次5 min,可見包埋劑溶解;蘇木精染色5 min,水洗。切片在1%鹽酸乙醇中浸泡5 s,用水沖洗;氨水回藍(lán)溶液洗滌5 s,用水沖洗干凈;伊紅染色30 s后用水沖洗。80%乙醇-95%乙醇-無水乙醇-無水乙醇梯度褪色10 s。二甲苯(Ⅰ)和二甲苯(Ⅱ)各浸泡5 min。中性膠密封切片,安裝切片,在光學(xué)顯微鏡下觀察。(2)尼氏染色步驟:將切片從-80℃的冰箱中移置4℃冰箱中冷藏30 min,室溫下復(fù)溫20 min;將切片置于染盒中,0.01 mol/L PBS液洗3次,每次5 min,可見到包埋劑溶解。將清洗好的切片浸于尼氏染料中,將染盒置于37℃恒溫箱中,8 min后再用去離子水清洗2次,每次10 s,采用95%乙醇洗30 s;二甲苯5 min,重復(fù)1次;切片干燥,中性樹脂封片,用無色指甲油密封蓋住蓋玻片的上端和下端,采用光學(xué)顯微鏡對其進(jìn)行觀測。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠BBB評分的比較4組大鼠術(shù)前BBB評分比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);干預(yù)后第7天、第14天時(shí),模型組、利拉魯肽組及利拉魯肽+XAV939組的BBB評分相較于術(shù)前顯著降低,并顯著低于假手術(shù)組(P<0.05),利拉魯肽組的BBB評分顯著高于模型組和利拉魯肽+XAV939組(P<0.05),而模型組與利拉魯肽+XAV939組的BBB評分比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表1。

表1 各組大鼠肢體運(yùn)動(dòng)功能的比較 分)

2.2 各組大鼠脊髓組織病理形態(tài)的比較模型組、利拉魯肽組及利拉魯肽+XAV939組大鼠脊髓前角尼氏染色陽性細(xì)胞數(shù)量明顯少于假手術(shù)組(P<0.05);與模型組和利拉魯肽+ XAV939組相比,利拉魯肽組的脊髓組織損傷較輕,組織形態(tài)較好,尼氏染色陽性細(xì)胞的數(shù)量顯著增加(P<0.05);而模型組與利拉魯肽+ XAV939組尼氏染色陽性細(xì)胞數(shù)量相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見圖1。

注：A,HE染色、尼氏染色檢測各組大鼠脊髓組織病理形態(tài)及神經(jīng)元死亡情況;B,脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元定量分析; ***P<0.001。

2.3 各組大鼠脊髓組織β-catenin、caspase-3、TNF-α和IL-6表達(dá)水平的比較相較于假手術(shù)組,模型組β-catenin、caspase-3、IL-6和TNF-α表達(dá)水平顯著升高(P<0.05);與模型組相比,利拉魯肽組β-catenin表達(dá)顯著升高,caspase-3、IL-6和TNF-α的表達(dá)顯著降低(P<0.05);與利拉魯肽組相比,利拉魯肽+XAV939組β-catenin表達(dá)顯著降低,caspase-3、IL-6和TNF-α的表達(dá)明顯升高(P<0.05),而模型組與利拉魯肽+XAV939組β-catenin、caspase-3、IL-6和TNF-α表達(dá)水平相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見圖2、3。

注： A, Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果; B, β-catenin蛋白表達(dá)水平; C, caspase-3蛋白表達(dá)水平; D, TNF-α蛋白表達(dá)水平; E, IL-6蛋白表達(dá)水平。 **P<0.01, ***P<0.001。

圖3 各組大鼠脊髓組織β-catenin、caspase-3、TNF-α、IL-6蛋白免疫組化染色結(jié)果

3 討論

脊髓損傷是一種具有高致殘、致畸及高死亡率特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷性疾病,治療難度大,嚴(yán)重危害患者的身心健康。急性脊髓損傷發(fā)生后,機(jī)體會(huì)出現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡、炎癥水平上升等一系列過程,從而加重病情[9]。研究表明[10],利拉魯肽在包括脊髓損傷等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療中具有一定價(jià)值,但相關(guān)機(jī)制還未完全明確。本研究發(fā)現(xiàn)利拉魯肽可通過激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路,減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡,降低炎癥因子水平,從而發(fā)揮對急性脊髓損傷大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用。

Wnt/β-catenin信號(hào)途徑在胚胎發(fā)育、腫瘤發(fā)生、細(xì)胞凋亡等方面起著關(guān)鍵的調(diào)控作用,研究表明該通路在急性脊髓損傷發(fā)生后發(fā)揮著關(guān)鍵作用[11]。賈云峰等[12]的研究顯示,甲基強(qiáng)的松龍可通過激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路對大鼠急性脊髓損傷模型發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。Gao等[13]的研究發(fā)現(xiàn),Wnt-3a可通過激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路對大鼠脊髓損傷后發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。另一項(xiàng)研究也表明,HSP70可通過激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路緩解大鼠脊髓損傷[14]。XAV939是一種高效的、能夠穿透細(xì)胞的小分子抑制劑,它能夠特異性地抑制多聚ADP核糖基化酶TNKS1和TNKS2。通過穩(wěn)定axin蛋白的活性,XAV939促進(jìn)了β-catenin的降解,從而破壞了Wnt信號(hào)通路[15]。在本研究中,我們的實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了在脊髓損傷大鼠中,利拉魯肽可激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路,XAV939抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路。

在本實(shí)驗(yàn)中,SD大鼠在脊髓損傷后給予利拉魯肽干預(yù),結(jié)果表明,利拉魯肽治療能增加脊髓損傷大鼠的運(yùn)動(dòng)功能評分和脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的數(shù)量,從而促進(jìn)脊髓損傷后大鼠運(yùn)動(dòng)神經(jīng)功能的恢復(fù)。而相較于利拉魯肽組,利拉魯肽+XAV939組大鼠的運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)情況顯著降低,并且與模型組大鼠類似。此外,脊髓損傷大鼠應(yīng)用利拉魯肽干預(yù)可顯著降低凋亡相關(guān)蛋白caspase-3和炎性因子TNF-α、IL-6的表達(dá)水平。而相較于利拉魯肽組,利拉魯肽+XAV939組大鼠的caspase-3、TNF-α、IL-6顯著升高,并且與模型組大鼠類似。Zhao等[16]的研究發(fā)現(xiàn),在大鼠脊髓半切模型中應(yīng)用一種復(fù)合水凝膠支架后,通過激活Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng),可實(shí)現(xiàn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化并促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生長,使受損的脊髓組織得到修復(fù)。caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中的一個(gè)關(guān)鍵酶,有研究顯示[17],在海馬脊髓損傷后caspase-3表達(dá)水平顯著上升,表明脊髓損傷可能誘導(dǎo)海馬的神經(jīng)元凋亡。脊髓損傷會(huì)引起炎癥反應(yīng)的激活,TNF-α、IL-1β、IL-18和 IL-6的升高會(huì)加重神經(jīng)元炎癥和脊髓損傷[18]。本研究結(jié)果提示,急性脊髓損傷可引起細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)的激活,而利拉魯肽可激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路,使β-catenin上升,降低caspase-3、TNF-α和IL-6表達(dá)水平,發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡,減輕炎癥反應(yīng)的作用,從而有助于脊髓損傷后的功能恢復(fù)。

綜上所述,利拉魯肽可能通過激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路調(diào)控相關(guān)蛋白的表達(dá)水平,減輕神經(jīng)細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng),從而對急性脊髓損傷大鼠發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。