郭峻氚, 王靜靜, 郭仁楠, 肖 東, 劉 艷

(新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科, 烏魯木齊 830000)

急性腎損傷(Acute kidney injury,AKI)是引發(fā)慢性腎臟病的重要原因,盡管部分患者能夠平安度過急性期,但其長(zhǎng)期病死率仍居高不下[1]。近年來血液凈化技術(shù)和重癥監(jiān)護(hù)治療水平有了較大的進(jìn)步,但AKI患者的臨床治療及預(yù)后效果仍有待改善。有報(bào)道顯示,對(duì)于患有AKI的危重癥患者而言,其預(yù)后受到AKI影響的概率高達(dá)40%[2-4]。近1/3患有AKI的危重癥患者會(huì)在90 d內(nèi)死亡,且其余危重癥患者90 d后的歸因死亡率約為10%。在誘發(fā)危重癥患者形成AKI的全部因素中,膿毒癥占比高達(dá)50%[5]。然而,目前臨床上對(duì)于膿毒癥所致AKI的病理生理機(jī)制尚未明確?；诖?本研究主要通過開展體外細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)探討單核細(xì)胞趨化蛋白-1(Monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)基因表達(dá)與膿毒癥所致AKI的相關(guān)性,旨在為臨床明確膿毒癥所致AKI發(fā)病機(jī)制提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2022年9月-2023年9月新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科收治的50例膿毒癥AKI患者作為AKI組,納入同期50例健康受試者作為對(duì)照組。對(duì)照組男性27例,女性23例;年齡18～80歲,平均年齡(55.24±6.33)歲。AKI組男性28例,女性22例;年齡18～80歲,平均年齡(55.13±6.25)歲。高血壓病史23例,肺部感染32例;急性生理與慢性健康狀況評(píng)估Ⅱ(Acute physiology and chronic health evaluation,APACHE Ⅱ)評(píng)分12～20分,平均APACHE Ⅱ評(píng)分(15.98±0.52)分。本研究已獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(KY2021052616),受試者均知情同意。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)均符合《拯救膿毒癥運(yùn)動(dòng):膿毒癥與膿毒性休克治療國際指南(2021版)》[6]中相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn),同時(shí)符合AKI相關(guān)臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)[7];(2)首次入住ICU。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)自身免疫性疾病或感染性疾病;(2)既往慢性腎功能衰竭;(3)各種腎病、糖尿病;(4)孕婦。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料人MCP-1 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA,上?？瓢┥锛夹g(shù)有限公司);細(xì)胞角蛋白14(Cytokeratin 14,CK14)和細(xì)胞角蛋白18(Cytokeratin 18,CK18)抗體購自上?？泼羯锟萍加邢薰?細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(Cell counting kit-8,CCK8,北京博奧森生物技術(shù)有限公司);白細(xì)胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、白細(xì)胞介素6(Interleukin 6,IL-6)、白細(xì)胞介素10(Interleukin 10,IL-10)、γ-干擾素(Interferon-γ,IFN-γ)和腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor α,TNF-α)抗體均購自上海酶聯(lián)生物公司;細(xì)胞培養(yǎng)箱(上海市頤習(xí)儀器設(shè)備公司);酶標(biāo)儀(江蘇省常州市銳品密儀器有限公司);核糖核酸(Ribonucleic acid,RNA)提取試劑盒(批號(hào):AM1900,美國Thermo Fisher Scientific公司);實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction,PCR)儀(美國Applied Biosystems公司);離心機(jī)(美國Thermo Fisher Scientific公司);熒光顯微鏡(德國Leica公司);倒置顯微鏡(日本奧林巴斯光學(xué)工業(yè)股份有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 ELISA法檢測(cè)MCP-1在膿毒癥AKI患者外周血中的表達(dá) 分別采集全部受試者清晨空腹上肢靜脈血5 mL,以3 000 r/min離心15 min,取上清液,采用ELISA法測(cè)定AKI患者及健康人群血清中MCP-1表達(dá)。

1.3.2 尿液的收集和腎小管上皮細(xì)胞分離培養(yǎng)方法

1.3.2.1 尿液收集 先排空晨尿,飲用水后用無菌的15 mL離心管收集適量尿液,盡量取潔凈的中段尿,密封后置于冰上并及時(shí)進(jìn)行尿液細(xì)胞分離以防尿液細(xì)胞在尿液中留置過久而死亡。

1.3.2.2 尿液腎小管上皮細(xì)胞分離 將盛有尿液的離心管置于離心機(jī)中,以1 500 r/min離心5 min。棄去上清液,留置沉渣約1 mL,向沉渣中加入適量沖洗緩沖液,小心吹打混勻,室溫下以1 500 r/min離心10 min。棄去上清液,留置沉淀約0.2 mL,向沉淀中加入1 mL尿液細(xì)胞初級(jí)培養(yǎng)液,吹打混勻后將其轉(zhuǎn)移至由0.1%明膠溶液包被過的孔板中,再加入1 mL細(xì)胞初級(jí)培養(yǎng)液,將其置于培養(yǎng)箱內(nèi)恒溫培養(yǎng)。

1.3.2.3 腎小管上皮細(xì)胞傳代 每天觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況,3～7 d后出現(xiàn)小團(tuán)的細(xì)胞克隆,每孔有5～20個(gè)小克隆,之后腎小管上皮細(xì)胞會(huì)進(jìn)行穩(wěn)定增殖。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至80%～90%密度時(shí),吸凈培養(yǎng)液,用磷酸鹽緩沖鹽溶液(Phosphate buffered saline,PBS)洗滌2次,加入0.25%胰酶溶液在室溫條件下消化約3 min,加入胰酶抑制劑終止消化,用槍頭輕輕吹打使細(xì)胞從孔壁上脫落。將細(xì)胞懸液抽吸至15 mL離心管中,1 000 r/min離心5 min,棄去上清液,加入2 mL培養(yǎng)液,用吸管將細(xì)胞吹勻,在恒溫條件下進(jìn)行傳代培養(yǎng)。當(dāng)各代細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%密度時(shí),繼續(xù)按照上述方法進(jìn)行傳代。

1.3.3 免疫熒光法檢測(cè)腎小管上皮細(xì)胞MCP-1的表達(dá) 按照AKI的風(fēng)險(xiǎn)損傷失效損失終末期腎臟疾病(Risk injury failure loss end stage kidney disease,RIFLE)診斷標(biāo)準(zhǔn),收集AKI患者尿液,從尿液中分離出腎小管上皮細(xì)胞,用PBS進(jìn)行漂洗,血清封閉,每張切片滴加50 μL適當(dāng)濃度的特異性單克隆抗體MCP-1(鼠來源),4℃過夜后,用PBS漂洗數(shù)次,滴加用不同熒光素標(biāo)記的二抗(分別是不同熒光素標(biāo)記的抗鼠和抗兔的抗體),室溫孵育1 h后用PBS沖洗,滴加抗熒光淬滅封片液,蓋玻片封片后在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.4 MCP-1過表達(dá)載體構(gòu)建和RNA干擾 根據(jù)前期克隆MCP-1測(cè)序獲得的編碼序列(Coding sequence,CDS)設(shè)計(jì)3條特異性小干擾RNA(Small interfering RNA,siRNA),送生物公司合成。按照說明書要求用無RNA酶水稀釋至100 nmol/L后用于驗(yàn)證和功能研究。利用前期克隆的MCP-1序列設(shè)計(jì)引物,結(jié)合pcDNA3.1載體酶切位點(diǎn)和MCP-1序列分析,引入酶切位點(diǎn),PCR擴(kuò)增、連接、轉(zhuǎn)化及測(cè)序鑒定,構(gòu)建MCP-1過表達(dá)載體pcDNA3.1-MCP-1。將siRNA和pcDNA3.1-MCP-1轉(zhuǎn)染腎小管上皮細(xì)胞,檢測(cè)MCP-1最佳過表達(dá)條件和干擾序列。按此法分為:陰性對(duì)照組(Negative control,NC)、MCP-1組(過表達(dá)MCP-1基因)、siRNA組(干擾MCP-1基因)。

1.3.5 CCK8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖 將細(xì)胞按150 μL、1 500個(gè)/孔接種于96孔板中,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后,替換為不含血清的培養(yǎng)基。加入pcDNA3.1-MCP-1和MCP-1特異siRNA并設(shè)陰性對(duì)照孔。測(cè)定每孔pH值后放入培養(yǎng)箱,分別培養(yǎng)12、24、36、48、72 h。每孔加入10 μL CCK-8溶液孵育2 h,用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值。

1.3.6 RT-qPCR方法檢測(cè)細(xì)胞中MCP-1的表達(dá) 取分離好的腎小管上皮細(xì)胞,用Trizol試劑提取總RNA,經(jīng)紫外分光光度計(jì)(A260/A280為1.8～2.0)和凝膠電泳鑒定后進(jìn)行定量,用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA模板,隨后進(jìn)行PCR反應(yīng),在美國國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)數(shù)據(jù)庫上獲得MCP-1、炎性細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素6(IL-6)、白細(xì)胞介素10(IL-10)、γ-干擾素(IFN-γ)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)和內(nèi)參GAPDH的mRNA序列,設(shè)計(jì)引物進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng),建立25 μL PCR反應(yīng)體系,94℃ 4 min、94℃ 50 s、60℃ 50 s、72℃ 80 s、72℃ 10 min,循環(huán)數(shù)35次,最后取6 μL PCR產(chǎn)物凝膠電泳分析。采用Real-TimePCR儀進(jìn)行檢測(cè),采用2-ΔΔCt法分析MCP-1表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 MCP-1在AKI外周血和尿液中的表達(dá)ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,AKI組患者外周血和尿液中的MCP-1表達(dá)量顯著升高(P均<0.05),見表1。

表1 兩組外周血與尿液中MCP-1表達(dá)水平比較

2.2 腎小管上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)和鑒定基于收集的尿液樣本,首先采用percol梯度離心法聯(lián)合差速貼壁法獲得AKI患者的腎小管上皮細(xì)胞,然后利用CK14和CK18抗體進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光監(jiān)測(cè),對(duì)原代培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞進(jìn)行鑒定。腎小管細(xì)胞培養(yǎng)24 h,分離培養(yǎng)的上皮細(xì)胞呈現(xiàn)多邊形,具有較強(qiáng)立體感,形態(tài)正常。培養(yǎng)至72 h,細(xì)胞匯合度達(dá)到90%,生長(zhǎng)速度正常(圖1)。通過細(xì)胞免疫熒光鑒定(圖2),選擇上皮細(xì)胞標(biāo)志物CK14和CK18,對(duì)細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)24 h,90%以上的細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞標(biāo)志物CK18,約84%的細(xì)胞表達(dá)CK14,表明分離獲得腎小管上皮細(xì)胞的純度較高。

原代培養(yǎng)24 h(10×) 原代培養(yǎng)72 h(10×)

圖2 腎小管上皮細(xì)胞鑒定圖

2.3 MCP-1基因?qū)δI小管上皮原代細(xì)胞增殖的影響利用原代培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞,通過過表達(dá)和干擾MCP-1基因的表達(dá),利用CCK8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖的變化。結(jié)果顯示,MCP-1組在24、48、72 h的細(xì)胞數(shù)量分別為(184.12±4.32)×1012個(gè)/L、(281.35±7.35)×1012個(gè)/L、(709.8±5.41)×1012個(gè)/L;siRNA組在24、48、72 h的細(xì)胞數(shù)量分別為(221.65±5.61)×1012個(gè)/L、(424.23±8.25)×1012個(gè)/L、(786.52±6.28)×1012個(gè)/L;NC組在24、48、72 h的細(xì)胞數(shù)量分別為(209.34±6.37)×1012個(gè)/L、(382.24±6.32)×1012個(gè)/L、(800.29±7.56)×1012個(gè)/L。與NC組相比,siRNA組在24、48 h細(xì)胞數(shù)量增加(P均<0.05);與MCP-1組相比,siRNA組在24、48、72 h的細(xì)胞數(shù)量增加(P均<0.05)。

2.4 MCP-1基因?qū)δI小管上皮原代細(xì)胞炎性因子表達(dá)的影響利用RT-qPCR檢測(cè)過表達(dá)和干擾MCP-1基因后,腎小管上皮細(xì)胞炎性因子的表達(dá)變化。結(jié)果顯示,NC組的IL-1β、IL-6、INF-γ因子的表達(dá)水平隨著時(shí)間的推移逐漸升高。MCP-1組的IL-1β、IL-6、IL-10、INF-γ和TNF-α因子表達(dá)水平隨著時(shí)間的推移逐漸升高。siRNA組的IL-1β、IL-6、INF-γ因子無顯著升高趨勢(shì)。提示MCP-1顯著促進(jìn)了腎小管上皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng),見圖3。

注：與NC組比較, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.000 1。

3 討論

膿毒癥導(dǎo)致AKI的病理生理學(xué)機(jī)制是多方面的,且不同的患者之間可能不同[8-10]。研究表明,膿毒癥所致的AKI是腎小管上皮細(xì)胞對(duì)炎性損傷信號(hào)的適應(yīng)性應(yīng)答[11-12]。免疫細(xì)胞激活后所合成或由病原體直接產(chǎn)生的炎性介質(zhì)(也稱損害或病原體相關(guān)分子模式,DAMPs及PAMPs)被免疫系統(tǒng)識(shí)別后可對(duì)抗感染,然而該過程也會(huì)損傷宿主細(xì)胞。腎小管上皮細(xì)胞可通過與Toll樣受體4(TLR4)、骨髓分化因子88等受體結(jié)合,對(duì)DAMPs及PAMPs進(jìn)行識(shí)別,從而誘發(fā)核因子κB(NF-κB)及腫瘤壞死因子α(TNF-α)的過度表達(dá)[13-15],進(jìn)而可能對(duì)腎小管上皮細(xì)胞造成損傷。盡管目前臨床對(duì)于膿毒癥所致AKI的病理生理學(xué)已有了初步的認(rèn)識(shí),但其具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。

MCP-1為一種重要的炎癥因子,主要由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、腎臟固有細(xì)胞如腎小管上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞和足細(xì)胞等受各種理化因素的刺激后合成和分泌[16]。MCP-1可以通過調(diào)控炎癥細(xì)胞運(yùn)輸來控制炎癥反應(yīng),并能夠?qū)M織損傷中白細(xì)胞的募集進(jìn)行調(diào)節(jié)[17]。MCP-1可通過多種途徑導(dǎo)致不同程度的腎臟損傷。有文獻(xiàn)顯示,在腎小球腎炎模型和糖尿病模型中發(fā)現(xiàn)MCP-1通過促進(jìn)腎臟巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)及腎間質(zhì)損傷從而參與腎損傷過程[18]。然而,目前關(guān)于MCP-1是否在膿毒癥所致AKI中發(fā)揮作用尚缺乏研究。有關(guān)研究表明,在膿毒癥小鼠模型中抑制或拮抗MCP-1均可引起TNF-α、IL-1β等炎性細(xì)胞因子水平下降,從而改善小鼠預(yù)后[19]。本研究結(jié)果顯示,AKI患者外周血及尿液中的MCP-1表達(dá)量均顯著升高(P<0.05),與楊曉玲等[20]的研究結(jié)論一致,提示MCP-1作為促炎介質(zhì)可能在膿毒癥所致AKI的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果顯示,過表達(dá)MCP-1基因后,腎小管上皮細(xì)胞的增殖速度下降,表明MCP-1基因可能對(duì)腎小管上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖具有抑制作用。而干擾MCP-1基因后,腎小管上皮細(xì)胞的增殖速度顯著增加,說明MCP-1基因?qū)δI小管上皮細(xì)胞的增殖具有負(fù)向調(diào)控作用。而過表達(dá)MCP-1基因后,IL-1β的表達(dá)水平顯著增加,表明MCP-1可能通過調(diào)節(jié)IL-1β的表達(dá)來影響腎小管上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。IL-1β可以促進(jìn)炎癥反應(yīng)和組織損傷[21]。因此,MCP-1可能通過促進(jìn)IL-1β的表達(dá)來加重腎臟的炎癥反應(yīng)和組織損傷,進(jìn)而促進(jìn)AKI的發(fā)生。此外,通過過表達(dá)和干擾MCP-1基因,本研究所選取腎小管上皮細(xì)胞炎性因子IL-6和INF-γ 的表達(dá)趨勢(shì)均與IL-1β的表達(dá)趨勢(shì)一致,表明MCP-1還可能通過調(diào)節(jié)其他炎性因子的表達(dá)來影響腎小管上皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。由上述結(jié)果推斷,膿毒癥患者可能由于腎臟中MCP-1表達(dá)上調(diào),從而引起巨噬細(xì)胞的過度活化,促進(jìn)IL-1β、IL-6、IL-10、INF-γ等炎癥因子的合成及分泌,進(jìn)而引發(fā)AKI。

本研究結(jié)果表明,MCP-1基因在膿毒癥所致AKI中可能發(fā)揮重要作用,因此以MCP-1為靶點(diǎn)的治療策略有望成為膿毒癥所致AKI的臨床治療新方向。例如,臨床或許可以通過抑制膿毒癥患者M(jìn)CP-1的表達(dá),多靶點(diǎn)調(diào)控炎癥因子,阻斷炎癥細(xì)胞因子的級(jí)聯(lián)反應(yīng),從而減輕患者腎臟的炎癥反應(yīng),以期緩解患者腎臟損傷,以防AKI發(fā)生或改善膿毒癥所致AKI患者的預(yù)后。然而,上述治療策略具體實(shí)施方案及應(yīng)用于防治膿毒癥所致AKI的安全性及有效性仍需開展大量臨床研究進(jìn)行構(gòu)建及驗(yàn)證。