侯凡，沈峰平，孫一鳴，陳佑源，湛立偉

(浙江勿忘農(nóng)種業(yè)股份有限公司，浙江 杭州 311215)

浙江省位于我國(guó)東南沿海，地理特性復(fù)雜，山地和丘陵占74.63%，平坦地占20.32%，河流和湖泊占5.05%，耕地面積僅208.17 萬(wàn)hm2，故有“七山一水二分田”之說(shuō)。水稻是浙江省第一大糧食作物，也是最重要的口糧，2019—2021年，浙江省的水稻播種面積及總產(chǎn)基本穩(wěn)定，分別約為63 萬(wàn)hm2和465 萬(wàn)t，約占糧食作物總面積和總產(chǎn)量的63.7%和76.8%[1-4]。盡管如此，浙江省的口糧依然難以自足，自給率僅為1/4左右，是全國(guó)第二大糧食主銷(xiāo)區(qū)；而且種糧成本增加、糧價(jià)下跌，導(dǎo)致種糧效益低[5-6]。同時(shí)，隨著民眾生活水平的日益提高，人民對(duì)稻米品質(zhì)的要求也越來(lái)越苛刻，不僅僅滿足于口感好，而是要求綠色健康及色香味俱佳。浙禾香2號(hào)是嘉興市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院、浙江大禾種業(yè)有限公司及浙江勿忘農(nóng)種業(yè)股份有限公司以嘉58為母本、秀水134為父本獲得F1并通過(guò)花藥培養(yǎng)獲得的抗稻瘟病、抗倒伏、食味品質(zhì)優(yōu)良的香型軟米水稻品種，該品種2021年在上海審定(審定編號(hào)：滬審稻2021006)，米飯香軟可口、外觀油潤(rùn)、冷不回生、商品性好。當(dāng)下浙江省已審定了一些具有香味的品種，如新禾香1號(hào)，也審定了一些軟米品種，如嘉58，但尚未有香軟米水稻品種被審定。因此，浙江勿忘農(nóng)種業(yè)股份有限公司自2021年開(kāi)始將浙禾香2號(hào)引入浙江省種植，這將有利于進(jìn)一步豐富浙江省品種類型，也將滿足不同民眾的稻米需求。本文就浙禾香2號(hào)在浙江省的引種表現(xiàn)，主要包括生育期及產(chǎn)量相關(guān)的重要農(nóng)藝性狀，以及稻瘟病抗性及香軟米分子特征進(jìn)行分析，為該品種在浙江省的推廣應(yīng)用及進(jìn)一步遺傳改良奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

常規(guī)晚粳稻浙禾香2號(hào)及對(duì)照秀水134，種子均由浙江勿忘農(nóng)種業(yè)股份有限公司提供。

1.2 大田試驗(yàn)設(shè)計(jì)與處理

浙禾香2號(hào)及對(duì)照秀水134的豐產(chǎn)性、穩(wěn)產(chǎn)性和適應(yīng)性鑒定試驗(yàn)由杭州市金牛農(nóng)機(jī)服務(wù)專業(yè)合作社、浙江勿忘農(nóng)種業(yè)股份有限公司、浙江勿忘農(nóng)種業(yè)股份有限公司德清分公司、余姚市種子種苗管理站、嘉善農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所等5家單位承擔(dān)，種植面積不少于333 m2，隨機(jī)排列，不設(shè)重復(fù)，試驗(yàn)田四周設(shè)置保護(hù)行，保護(hù)行不少于4行。

1.3 主要農(nóng)藝性狀調(diào)查

田間考察依據(jù)浙江省水稻引種備案品種適應(yīng)性試驗(yàn)操作規(guī)程進(jìn)行。田間主要記載播種期、移栽期、秧齡、始穗期、齊穗期、成熟期、有效穗等性狀。收獲前2 d，隨機(jī)選取浙禾香2號(hào)及對(duì)照秀水134有代表性的植株3穴用于室內(nèi)考種，主要考察株高、總粒數(shù)、實(shí)粒數(shù)、結(jié)實(shí)率和千粒重等。收割時(shí)按品種成熟先后及時(shí)收獲，分品種單收、單曬，揚(yáng)凈后稱重，并按14.5%的含水量標(biāo)準(zhǔn)折算產(chǎn)量。

1.4 稻瘟病抗性鑒定

稻瘟病抗性采用田間自然誘發(fā)鑒定法，稻瘟病抗性級(jí)別按《國(guó)家水稻新品種試驗(yàn)稻瘟病抗性鑒定與評(píng)價(jià)》標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行調(diào)查。

1.5 稻瘟病抗性基因及軟香米等位基因分子檢測(cè)

水稻生長(zhǎng)至分蘗期后，剪取浙禾香2號(hào)的0.1 g功能葉片，用水稻基因組DNA提取試劑盒(易思得生物科技有限公司)提取基因組總DNA。

稻瘟病抗性基因檢測(cè)采用常規(guī)PCR法，反應(yīng)總體系20 μL，內(nèi)含1×BlueStarTMPCR Master Mix(北京擎科生物科技有限公司)、上下游引物各1 μmol·L-1及基因組DNA 30 ng。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，最后保持在8 ℃。PCR產(chǎn)物采用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，紫外凝膠成像儀拍照。而軟香米等位基因分子檢測(cè)則使用Phanta Max高保真DNA聚合酶(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)建立PCR反應(yīng)，總反應(yīng)體系50 μL，內(nèi)含1×Phanta Max緩沖液、dNTP 0.2 mmol L-1、Phanta Max高保真DNA聚合酶1 U、上下游引物各1.5 μmol L-1及基因組DNA 50 ng。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?8 ℃預(yù)變性3 min；98 ℃變性10 s，56 ℃退火15 s，72 ℃延伸60 s，共40個(gè)循環(huán)；72 ℃再次延伸5 min，最后保持在8 ℃。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后切膠純化DNA片段，而后送北京擎科生物科技有限公司測(cè)序。所有標(biāo)記引物和等位基因檢測(cè)引物序列見(jiàn)表1。

表1 稻瘟病抗性基因的分子標(biāo)記及軟香米等位基因檢測(cè)引物Table 1 Molecular markers of rice blast resistance genes and primers for allele detection of japonica soft rice

2 結(jié)果與分析

2.1 主要農(nóng)藝性狀

2021年，浙禾香2號(hào)在浙江省5個(gè)引種試驗(yàn)點(diǎn)全生育期146～168 d，其中在蕭山全生育期最長(zhǎng)，達(dá)168 d，而在嘉善全生育期最短，僅146 d，該品種平均生育期160 d，比對(duì)照秀水134遲3.0 d(表2)。而且，表2顯示該品種的全生育期隨播種期推遲而明顯縮短，表現(xiàn)出了較強(qiáng)的感光性。

表2 不同試驗(yàn)點(diǎn)水稻的生育期Table 2 Growth period of rice at different test sites

表3結(jié)果顯示，與對(duì)照秀水134相比，浙香2號(hào)在5個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的平均總粒數(shù)、實(shí)粒數(shù)、結(jié)實(shí)率略低，千粒重相當(dāng)，而有效穗數(shù)、株高及產(chǎn)量則更高。其中，浙禾香2號(hào)在5個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)產(chǎn)量均比對(duì)照秀水134更高，即增產(chǎn)點(diǎn)率100%，產(chǎn)量變幅為8 422.5～10 749.0 kg·hm-2，平均產(chǎn)量9 665.1 kg·hm-2，比對(duì)照秀水134增產(chǎn)5.8%。表明浙禾香2號(hào)的豐產(chǎn)性較好。

表3 不同試驗(yàn)點(diǎn)水稻的主要經(jīng)濟(jì)性狀Table 3 Main economic traits of rice at different test sites

2.2 抗病性及稻瘟病抗性基因鑒定

2021年，經(jīng)浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與微生物研究所鑒定，浙禾香2號(hào)的稻瘟病綜合指數(shù)3.2，穗瘟損失率最高級(jí)為3級(jí)，最終該品種的稻瘟病抗性定為中抗(表4)。

表4 不同品種的稻瘟病抗性鑒定Table 4 Identification of rice blast resistance of different varieties

大田抗性結(jié)果顯示，浙禾香2號(hào)和秀水134抗倒性均較強(qiáng)，未發(fā)生或無(wú)葉瘟、穗頸瘟、白葉枯和稻曲病，表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抗倒性和抗病性(表5)。

表5 不同品種水稻在浙江省多點(diǎn)適應(yīng)性田間抗性表現(xiàn)Table 5 Adaptability of different rice varieties in the field in Zhejiang Province

為了確認(rèn)該品種的稻瘟病抗性是否與抗性基因有關(guān)，利用已有的抗性基因的分子標(biāo)記或緊密連鎖分子標(biāo)記對(duì)相關(guān)基因進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明，該品種中含有Pi-b、Pi-t、Pi-ta、Pi-km2和Pi-d4等抗性基因(圖1)。

R—抗性基因；S—敏感基因。圖1 稻瘟病抗性基因分子標(biāo)記鑒定Fig.1 Molecular identification of rice blast resistance genes

2.3 軟香米等位基因分析

浙禾香2號(hào)米質(zhì)較好，米飯帶香味，2019—2020年上海區(qū)試，整精米率65.0%，堊白粒率13.5%，堊白度1.5%，膠稠度81.0 mm，直鏈淀粉含量11.2%。前人[7]研究顯示，稻米香味是由OsBADH2/fgr基因控制，屬于隱性基因，該基因的第7外顯子8 bp的缺失和3 bp的變異，或者第2外顯子7 bp的缺失。為了明確浙香2號(hào)軟米香味的分子機(jī)理，利用特異引物擴(kuò)增fgr和Wx基因并進(jìn)行測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)該品種中的fgr基因第2外顯子缺失7 bp(圖2)；而Wx基因則與現(xiàn)已報(bào)道的軟米等位基因(如Wxop/hp、Wxmp和Wxmq)及其他Wx基因(如Wxa、Wxb、Wxin和WxIV)[8-9]則存在差異，與軟米南粳46相比，主要差異在第1個(gè)內(nèi)含子G/T的變異；而與云南軟米毫屁相比，則第4外顯子的2個(gè)位點(diǎn)均存在差異。該Wx等位基因來(lái)源于嘉58，故將浙香2號(hào)中的該基因暫命名為Wxjw(Waxy from Jia58)(圖3)。

圖2 香味基因fgr的分子鑒定Fig.2 Molecular identification of fragrance gene fgr

A—Wx等位基因測(cè)序；B—現(xiàn)已克隆的Wx等位基因比較分析；Int—內(nèi)含子；Ex—外顯子。圖3 Wx等位基因分子分析Fig.3 Molecular analysis of Wx alleles

3 結(jié)論與討論

浙江省經(jīng)濟(jì)較為發(fā)達(dá)，但受資源約束，稻米自給率低、對(duì)外依存度高，是全國(guó)第2大稻米主銷(xiāo)區(qū)。為了充分利用有限的稻田資源，保障糧食安全，助推浙江省鄉(xiāng)村振興，陸艷婷等[10]提出了“優(yōu)質(zhì)興農(nóng)，加快水稻提質(zhì)增效創(chuàng)品牌；積極發(fā)展特種專用水稻，提高稻米產(chǎn)品的附加值；種養(yǎng)結(jié)合，實(shí)現(xiàn)綠色有機(jī)提質(zhì)增效；創(chuàng)意興農(nóng)，將水稻生產(chǎn)融合于美麗田園建設(shè)”等對(duì)策建議。而實(shí)現(xiàn)這些目標(biāo)的首要前提是良種培育。浙禾香2號(hào)是嘉興市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院、浙江大禾種業(yè)有限公司及浙江勿忘農(nóng)種業(yè)股份有限公司聯(lián)合在上海審定的軟香米水稻品種，該品種集合了原始親本嘉58及秀水134的優(yōu)點(diǎn)。迄今，尚未有香軟米水稻品種通過(guò)浙江省審定，因此，將浙香2號(hào)在浙江省引種具有重要意義。2021年浙香2號(hào)在浙江省的引種結(jié)果表明，該品種植株分蘗力好、適應(yīng)性廣、中抗稻瘟病、米飯香軟。本研究利用稻瘟病抗性基因的功能型或緊密連鎖分子標(biāo)記，以及Wx和fgr基因的特異引物進(jìn)行PCR克隆及測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)浙禾香2號(hào)含有Pit、Pita、Pib、Pid4和Pi-km2等稻瘟病抗性基因(圖1)，從而賦予該品種有稻瘟病抗性；而該品種的稻米香味是由于fgr基因的第2外顯子缺失7 bp引起的；該品種中控制稻米直鏈淀粉含量的Wx基因則與現(xiàn)已報(bào)道的軟米基因Wxmp、Wxmq和Wxop/hp均存在一定差異，這將為利用該種質(zhì)資源培育更多軟米品種奠定基礎(chǔ)。