梁宇晗 王洪雙 何慧彬 鄭敏 趙琰 李彤 趙沛東 王石紅

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative coltis,UC)是一種原因不明的慢性非特異性結(jié)腸炎癥性疾病,臨床上主要表現(xiàn)為持續(xù)或反復發(fā)作的腹瀉、腹痛、里急后重和粘液膿血便,多累及全結(jié)腸甚至回腸,以直腸和乙狀結(jié)腸最為常見[1]。其發(fā)病與上皮屏障功能障礙、免疫失衡、遺傳易感性及外界環(huán)境等密切相關(guān)[2]。目前的研究認為自噬參與UC的發(fā)生發(fā)展,通過自噬改善UC疾病活動是一種可行的治療方法[3]。

自噬是真核細胞在應激狀況下所產(chǎn)生的一種非損傷性應答,通過溶酶體降解微生物、受損蛋白及損傷衰老的細胞器,實現(xiàn)重新利用和更新,從而維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)平衡,是真核細胞獨有的自我保護機制[4]?；谧允傻闹嗅t(yī)藥療法已被廣泛應用于臨床治療,大量研究表明中藥單體及復方中的有效成分能夠通過調(diào)控自噬改善UC癥狀,具有潛在的臨床應用價值?，F(xiàn)就近年來中藥單體(或其活性成分)及復方通過調(diào)控自噬改善UC的藥理機制研究進行綜述,旨在為深入研究中藥治療UC提供新的思路。

1 改善腸道黏膜屏障功能

腸粘膜屏障受損是導致UC發(fā)生發(fā)展的一個重要因素。腸道黏膜遭到破壞,通透性增加,腸道內(nèi)各種毒素產(chǎn)物侵入腸道上皮,引起細菌移位、固有免疫損傷、線粒體功能障礙和鐵死亡等病理過程[5]。研究顯示,自噬在維持腸黏膜穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著重要作用[6]。

1.1 修復受損黏膜機械屏障

腸粘膜機械屏障是黏膜屏障的重要組成部分,主要由黏膜上皮細胞及其緊密連接(tight junction,TJ)成分組成,其中咬合蛋白(Occludin)是TJ蛋白主體組成成分,可與緊密連接蛋白-1(zonula occludens-1,ZO-1)結(jié)合以封閉細胞間隙,形成防滲透屏障,抵御病原微生物入侵[7]。研究顯示,低、中、高劑量人參敗毒散可上調(diào)腺苷酸活化蛋白α(activated protein kinase α,AMPKα)mRNA表達水平,增加磷酸化蛋白腺苷酸活化蛋白激酶(phosphorylated adenosine monophosphate activated protein kinase,p-AMPK)、磷酸化Unc-51樣激酶1(Unc-51 like kinase 1,ULK1)、Occludin蛋白表達及增高LC3Ⅱ/Ⅰ值,降低p62、封閉蛋白-2(Claudin-2)表達,其中以中劑量組干預效應最明顯,表明人參敗毒散可能通過激活AMPK/ULK1自噬通路,調(diào)節(jié)緊密連接蛋白Occludin、Claudin-2的水平,改善結(jié)腸黏膜通透性,并修復腸道黏膜機械屏障損傷[8]。

另有研究顯示上游調(diào)控因子AMPK可降低自噬調(diào)控核心因子哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)的活性以促進自噬發(fā)生,AMPK/mTOR通路介導的自噬能夠明顯緩解UC癥狀[9]。應藝[10]先后進行了動物實驗和細胞實驗,觀察黃芪多糖對結(jié)組織中黏膜屏障相關(guān)指標的影響,包括Claudin-1、Occludin蛋白,自噬效應蛋白(Beclin1)、微管相關(guān)蛋白輕鏈3(LC3B)、泛素結(jié)合蛋白(p62)和炎癥相關(guān)指標腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)、白細胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-18、IL-8等,以及自噬相關(guān)基因Atg5腸、Atg7、Atg16L,研究結(jié)果認為黃芪多糖可以提高組織自噬能力,有效緩解腸道炎癥及腸粘膜損傷。

1.2 減輕腸上皮細胞凋亡

細胞凋亡是細胞自身正常死亡過程,在機體防御體系中發(fā)揮重要作用,UC發(fā)病過程中存在結(jié)腸上皮細胞凋亡情況,而細胞自噬與細胞凋亡關(guān)系密切[5,11]。研究表明自噬的激活能直接控制UC中炎癥因子TNF誘導的腸上皮細胞凋亡。

木樨草素是一種天然黃酮類化合物,高劑量的木樨草素可明顯改善DSS介導發(fā)生的結(jié)腸上皮損傷、水腫和結(jié)構(gòu)扭曲,通過抑制磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylin-ositol-3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/Akt)、核因子-κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)信號通路,增加細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)1/2磷酸化,減弱caspase-9、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3和cleaved PARP等凋亡相關(guān)蛋白表達,抑制自噬水平,干預結(jié)腸組織細胞凋亡[12]。在李蘭珍等[13]觀察芍藥苷治療UC大鼠的實驗中,發(fā)現(xiàn)芍藥苷能夠下調(diào)抗凋亡基因B淋巴細胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)表達和TNF-α、IL-6含量,上調(diào)自噬相關(guān)蛋白Beclin1表達,推測芍藥苷可能通過抑制NF-κB信號通路,解除自噬抑制,促進了腸上皮細胞的功能修復。

經(jīng)吳玉泓團隊驗證,理中湯合四神丸可激活脾腎陽虛型UC大鼠JNK/Beclin1/Bcl-2自噬信號通路,經(jīng)中藥干預后結(jié)腸組織中的絲氨酸蘇氨酸激酶(c-Jun N-terminal kinase 1,JNK1)、Bcl-2、Beclin1、LC3B、損傷調(diào)節(jié)自噬蛋白1(damage regulated autophagy modulator 1,DRAM1)相關(guān)蛋白和Atg5、Atg12自噬相關(guān)基因表達被抑制,同時P62表達上調(diào),自噬水平被抑制,過度自噬被避免,緩解了結(jié)腸粘膜細胞凋亡,保護了結(jié)腸黏膜[14-15]。健脾清熱活血方是勞紹賢教授總結(jié)多年臨床治療UC的經(jīng)驗擬成的方子,張濤等[16]運用健脾清熱活血方治療潰結(jié)癌變小鼠,結(jié)果中藥組P85蛋白、周期蛋白依賴性蛋白激酶1(cyclin-dependent protein kinase 1,CDK1)、P85 mRNA、p-Akt mRNA表達下降,推測健脾清熱活血方可能通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt/mTOR信號通路,抑制細胞凋亡與自噬,促進腸道炎癥緩解與黏膜修復。

2 調(diào)節(jié)免疫炎癥反應

在UC模型中,免疫細胞的浸潤會影響腸道粘膜穩(wěn)態(tài)和功能,進一步導致炎癥反應。自噬參與機體免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié),自噬缺陷會導致細胞毒性T細胞向T輔助淋巴細胞募集,增加炎癥因子表達,誘發(fā)炎癥反應[17]。因此,通過調(diào)節(jié)腸道炎癥因子水平來抑制免疫細胞的浸潤也可能是治療UC的一種方法。

2.1 抑制NLRP3炎性小體活性

NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3(NOD-like receptor domain-containing protein 3,NLRP3)、銜接蛋白ASC(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD,凋亡相關(guān)斑點樣蛋白)和半胱氨酸蛋白酶前體(pro-Caspase-1)組成炎癥小體,活化的NLPR3炎癥小體可以對pro-Caspase-1蛋白進行剪切形成Caspase-1,Caspase-1處理pro-IL-1β和pro-IL-18,形成成熟的IL-1β和IL-18[18],然后觸發(fā)免疫反應[19]。丁文文[20]實驗中的治療組在給予吳茱萸堿后,結(jié)腸組織炎性細胞浸潤減少,髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)、IL-1、IL-18水平降低,并破壞ASC自身寡聚化及ASC與Caspase-1的共定位而阻礙NLRP3炎性小體的組裝抑制其激活,LC3-Ⅱ及p62蛋白的變化初步證明吳茱萸堿可通過增強自噬抑制NLRP3炎性小體的激活。劉琦[21]的研究證明NLRP3炎性小體參與UC發(fā)生發(fā)展過程。忍冬苷是金銀花中最豐富的成分之一,胡乃華團隊[22]認為忍冬苷可能通過激活EZH2-ATG5-NLRP3通路,增強自噬,加速NLRP3炎癥小體的降解,并顯著緩解UC。

2.2 減輕炎癥損傷

劉曉蘭等[23]運用蒼術(shù)揮發(fā)油干預UC大鼠,治療組IL-6、TNF-α明顯被抑制,Beclin1蛋白、p62 mRNA、LC3Ⅱ/Ⅰ比值明顯上升,說明蒼術(shù)揮發(fā)油保護大鼠結(jié)腸組織免受炎癥損傷,可能與促進自噬有關(guān)。雷公藤多苷片具有很強的抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用,王章流等[24]用其灌胃治療UC小鼠,認為雷公藤多苷片通過下調(diào)LC3Ⅱ/Ⅰ比值抑制自噬活性,從而緩解DSS誘導的小鼠結(jié)腸急性炎癥反應。

濕生扁蕾酮提取自龍膽草,具有抗腸纖維化、抑菌、消炎等藥理作用。張旭東等[25]運用各劑量濕生扁蕾酮治療腸纖維化UC大鼠模型,發(fā)現(xiàn)干預后結(jié)腸組織炎癥明顯減輕,Atg16L1、LC3蛋白表達下降,推測濕生扁蕾酮通過抑制自噬活性,發(fā)揮減少炎性因子和抵抗結(jié)腸纖維化的作用。復方蜥蜴散是朱西杰教授根據(jù)多年臨床經(jīng)驗總結(jié)用來治療UC的自擬方,能夠調(diào)節(jié)腸道菌群紊亂,維持腸道穩(wěn)態(tài)[26]。王藝臻等[27]還發(fā)現(xiàn)此方能夠使自噬恢復正常,實驗結(jié)果高劑量組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值下調(diào)、p62水平上升,闡述了復方蜥蜴散通過維持正常自噬,清除受損細胞器、蛋白質(zhì),隔離有害蛋白,明顯緩解UC大鼠粘液膿血便癥狀,修復腸道潰瘍,降低炎癥反應。

羅云堅教授團隊認為病變黏膜組織內(nèi)過多沉積的異常蛋白、炎性因子、受損細胞器等可通過干預Akt/mTOR信號通路,導致通路下游炎性因子失衡,而通過實驗驗證發(fā)現(xiàn)以清解伏毒法立方的調(diào)腸消炎片,可調(diào)控巨噬細胞的自噬狀態(tài),影響促炎因子IL-1β、抑炎因子IL-4的表達,有效緩解了UC大鼠結(jié)腸組織炎癥反應,促進潰瘍愈合[28]。牟永旭等[29]研究半夏瀉心湯對UC的作用機制,經(jīng)半夏瀉心湯干預后,各劑量組血清中TNF-α、IL-6含量減低,結(jié)腸組織中PI3K和Akt蛋白也有不同程度的降低,結(jié)果證明半夏瀉心湯緩解UC炎癥反應可能與抑制促炎因子的表達和PI3K/Akt信號通路的活化促進自噬有關(guān)。

青藤堿提取自中藥青風藤,具有良好的抗炎和免疫抑制活性作用。謝小榮等[30]運用鹽酸青藤堿治療UC小鼠,結(jié)果表明經(jīng)治療后TNF-α、IL-6含量降低,IL-10含量升高,改善炎癥因子之間分泌失衡狀態(tài),同時p62蛋白表達顯著降低,Beclin1、LC3B蛋白表達顯著升高,提示鹽酸青藤堿緩解結(jié)腸炎癥損傷可能與解除自噬抑制有關(guān)。

2.3 調(diào)節(jié)腸道黏膜免疫應答

翻白草是彝醫(yī)用來治療腸炎、腹瀉的常用藥物。劉宇等[31]運用翻白草治療UC大鼠,發(fā)現(xiàn)其可能是通過調(diào)節(jié)NF-κB的表達來防止過度的炎性小體激活,翻白草組結(jié)腸組織中p62、線粒體自噬標志蛋白parkin、NF-κB的mRNA轉(zhuǎn)錄水平上升,標志著線粒體自噬的激活,同時T細胞的生成增加,調(diào)控免疫反應,抑制了體內(nèi)促炎因子的表達,增加了抗炎因子的含量,最終恢復腸道黏膜免疫功能,調(diào)整腸黏膜免疫失衡帶來的大鼠腸黏膜損傷。王堅衡[32]實驗驗證白藜蘆醇可以激動小鼠結(jié)腸組織中沉默調(diào)節(jié)蛋白1(recombinant sirtuin 1,SIRT1)、mTOR蛋白,下調(diào)Atg12、Beclin1、LC3Ⅱ、LC3Ⅰ蛋白表達,激活SIRT1/mTOR信號通路,降低自噬水平,緩解結(jié)腸黏膜病理變化,減少TNF-α、IL-1β、IL-6炎癥因子的聚集,增加IL-10表達,調(diào)節(jié)CD4+T、CD8+T細胞的比例,避免Th1/Th2的免疫調(diào)節(jié)失衡,從而治療UC。

司曉麗等[33]實驗驗證了芍藥苷可通過上調(diào)自噬水平減輕葡聚糖硫酸鈉(dextran sodium sulfate,DSS)造成的大鼠腸道損傷,經(jīng)干預后組織中炎癥因子IL-17、TNF-α及細胞間黏附分子(intercellular adhesion molecules,ICAM)分泌減少,自噬相關(guān)因子LC3BⅡ、Beclin1水平上調(diào)。IL-17是IL家族研究最廣泛的促炎細胞因子,被認為是是連接固有免疫和獲得性免疫的橋梁,其與受體結(jié)合,可激活MAPKs、NF-κB等信號通路,誘導IL-6、IL-8、ICAM-1等促炎細胞因子和趨化因子釋放,進而導致單核細胞、中性粒細胞募集及炎癥的產(chǎn)生[34]。

3 調(diào)節(jié)腸道菌群

腸道菌群失衡是UC發(fā)病機制之一,在UC發(fā)病過程中起著重要作用。腸道菌群失衡是由于腸道菌群數(shù)量失調(diào)引起的,它可以通過多種機制引起UC的發(fā)生發(fā)展,益生菌群通?？梢哉{(diào)節(jié)腸道菌群平衡,起到緩解結(jié)腸炎作用[35]。有些中藥成分可能通過調(diào)節(jié)腸道菌群促進自噬進而改善UC癥狀。

SU等[36]研究黃柏堿對UC的治療作用,進行網(wǎng)絡藥理學驗證表明黃柏堿是復方黃柏液的主要成分,且靶點主要影響AMPK和mTOR信號通路,進一步構(gòu)建UC動物模型,經(jīng)干預后黃柏堿組p-AMPK/AMPK比值、自噬標記的LCII/LCI比值增加,p-mTOR/mTOR比值下降,表明黃柏堿干預可以促進自噬水平增加。腸道菌群測序分析還發(fā)現(xiàn)黃柏堿組小鼠的菌群更接近正常,增加了菌群豐度和有益菌含量,提示黃柏堿能夠減少腸道損傷調(diào)節(jié)腸道菌群可能與調(diào)節(jié)AMPK-mTOR信號通路增強自噬有關(guān)。

鹽酸小檗堿(黃連素)是許多常用中藥(黃連、黃柏)的主要成分。CAO等[37]運用鹽酸小檗堿治療炎癥性腸病動物模型,實驗結(jié)果顯示鹽酸小檗堿高劑量組丙二醛(malonaldehyde,MDA)含量降低,總抗氧能力、谷胱甘肽(glutathione,GSH)、過氧化氫酶和超氧化物歧化酶(superoxide dismutas,SOD)含量增加,結(jié)腸緊密連接蛋白ZO-1、ZO-2、E-鈣粘蛋白、ZEB1、Occludin mRNA表達水平上調(diào),slug蛋白表達增加,N-鈣粘蛋白表達下降。同時,鹽酸小檗堿高劑量組Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)、NF-κB抑制蛋白(inhibitor of NF-κB,IκB)、NF-κB mRNA表達顯著降低,IL-1β、TNF-α、IL-6 mRNA表達也降低,表明TLR4/NF-κB通路受到抑制,Atg5、Atg7、LC3蛋白的表達增加,p62表達下降和p-mTOR表達增加,表明mTOR復合物和自噬激活,厚壁菌門/擬桿菌門比率和乳酸桿菌豐度也增加,總體微生物群達到健康水平,說明鹽酸小檗堿能夠緩解結(jié)腸損傷和炎癥、維持腸道抗氧化系統(tǒng)和微生物穩(wěn)態(tài),可能與抑制TLR4/NF-κB炎癥通路并激活mTOR復合物和自噬有關(guān)。

4 減輕氧化應激損傷

4.1 增強抗氧能力

在UC炎癥區(qū)域,由于血管受損和代謝增加導致耗氧量增加,黏膜微環(huán)境處于缺氧狀態(tài),造成黏膜保護因子受損,腸粘膜屏障遭到破壞;氧化應激是氧化與抗氧化作用失衡的反應,其中活性氧(reactive oxygen species,ROS)積累過多,而可清除氧自由基的SOD、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)等酶活性減低,造成周圍組織損傷,結(jié)腸組織屏障受損[38-39]。

金絲桃苷屬黃酮醇苷化合物,主要存在于金絲桃屬和山楂屬植物中。于曉萍等[40]的實驗中,金絲桃苷對大鼠結(jié)腸炎癥有明顯的治療作用,通過下調(diào)結(jié)腸組織中IL-1β、TNF-α、MDA、MPO水平,提升SOD活性,LC3、Beclin1水平上升,p62水平下降,證明金絲桃苷可增強自噬水平,發(fā)揮抗炎抗氧化作用。氧化苦參堿是從豆科植物苦參中提取出的主要活性成分,具有較強的抗炎、抗癌、抗氧化、抗纖維化等作用[41]。經(jīng)氧化苦參堿干預的UC小鼠結(jié)腸黏膜細胞的ROS、MDA和MPO含量顯著減少,SOD、GSH-Px含量均增加,Atg5和Beclin1蛋白表達顯著增加,證明氧化苦參堿減輕由ROS引起的一系列級聯(lián)反應可能與提高自噬水平有關(guān)[38]。

薯蕷皂苷是一種植物甾體皂苷,具有抗炎、抑菌、降血脂等作用。李瀚等[9]研究薯蕷皂苷的機制發(fā)現(xiàn)其能夠減輕DSS對SOD、GSH的抑制,增加p-AMPK蛋白水平,降低p-mTOR表達。同時,經(jīng)其干預后Beclin1、Atg5蛋白水平和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值顯著增高,p62蛋白顯著下降,自噬被激活,因此研究分析薯蕷皂苷可能通過調(diào)節(jié)AMPK/mTOR信號通路促進自噬,抑制氧化應激。

白術(shù)內(nèi)酯具有抗炎、抗腫瘤等作用。任燕等[42]通過實驗白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ干預UC小鼠模型,探究其治療機制,結(jié)果SOD、GSH-Px含量明顯升高,MDA含量明顯降低,且Beclin1蛋白、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明顯升高,p62表達明顯降低,鏡下觀察也發(fā)現(xiàn)白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ組線粒體膨脹變形、受損線粒體被自噬小體所吞噬,并且溶酶體與受損線粒體進行了融合,表明白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ可能通過調(diào)節(jié)自噬,清除過氧化物,緩解UC炎癥。

中藥方劑香連丸出自《太平惠民和劑局方》,臨床主要用于治療濕熱痢疾。經(jīng)香連丸低、中、高劑量干預的UC小鼠結(jié)腸組織中MDA表達下降,SOD、GSH-Px活性增加,抗氧化能力得到增強。自噬方面,Beclin1、LC3Ⅱ表達及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值上調(diào),LC3Ⅰ蛋白表達下降,表明香連丸可能通過促進自噬和降低氧化應激反應,改善結(jié)腸損傷,促進組織修復[43]。

4.2 激活線粒體自噬

線粒體自噬可被氧化應激激活,且線粒體自噬可減少氧化應激。在苗金雪等[44]的實驗研究中,黃芩湯可通過激活人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因誘導的假定激酶1(PTEN induced putative kinase 1,PINK1)/E3泛素連接酶(Parkin)自噬通路,啟動線粒體自噬,清除組織內(nèi)受損的線粒體,緩解UC大鼠的氧化應激反應。地馬煎劑由芍藥湯化裁而成,是查安生教授治療UC的經(jīng)驗方,能夠有效控制輕、中度UC活動。在王睿等[45]的研究中,地馬煎劑組大鼠結(jié)腸組織中腺病毒E1B相互作用蛋白3(BCL2/adenovirus E1Binte racting protein3,BNIP3)、Beclin1、LC3蛋白相對表達均增高,研究提示地馬煎劑可通過缺氧誘導因子1α/BNIP3/Beclin1通路,激活線粒體自噬對抗UC炎癥反應。BNIP3是線粒體自噬的正向調(diào)控通路中的關(guān)鍵蛋白,后期實驗中地馬煎劑各劑量組黏膜組織BINP3蛋白及BNIP3 mRNA表達均升高,提示線粒體自噬水平得到增強,促進了腸道炎癥修復[46]。

5 結(jié)語

中醫(yī)藥治療UC有著確切的臨床療效。通過以上對近年來國內(nèi)外基于細胞自噬調(diào)控的中藥治療UC藥理機制研究進展的總結(jié),可以發(fā)現(xiàn)中藥單體(或其活性成分)和復方制劑能夠通過調(diào)控自噬相關(guān)蛋白表達進而調(diào)控自噬通路從而發(fā)揮治療UC的作用,其主要作用靶點集中在Beclin1、p62、LC3、炎性細胞因子和其他作用相關(guān)蛋白,主要作用信號通路有AMPK/mTOR、PI3K/Akt/mTOR、Akt/mTOR、SIRT1/mTOR、NF-κB及PINK1/Parkin等信號通路。隨著對細胞自噬調(diào)節(jié)機制研究的深入和認識,應注意到自噬具有雙重調(diào)節(jié)作用,自噬太過與不足皆會影響UC進展,在疾病治療上需要深入研究是應該誘導自噬還是抑制自噬。同時,目前尚缺少基于細胞自噬調(diào)控治療UC的臨床研究。因此,進一步分析中藥對細胞自噬影響機制以及研究中藥在UC中發(fā)揮藥理作用的具體機制十分必要。