喻 玲, 張 蕊, 朱 琳, 張 冰, 張 妤, 郭寶元, 王松雪

(上海理工大學健康科學與工程學院1,上海 200093)

(國家糧食和物資儲備局科學研究院2,北京 100037)

農產品種植或儲藏時使用農藥后難以避免產生農藥殘留。大米中農藥殘留限量指標檢測是監(jiān)測和評價大米質量安全的重要手段之一,其檢測技術一直備受人們的關注[1-6]。其中氣相色譜-串聯質譜(GC-MS/MS)技術具有快速、準確、靈敏度高、重現性好的特點,是農藥殘留分析中應用最普遍的技術[7-9]。而基質效應(MEs)一直是影響GC-MS/MS檢測的重要因素[10]。GC-MS/MS基質效應主要發(fā)生在進樣口到色譜柱以及色譜柱到檢測器之間,通常認為是待分析農藥與硅醇基及其與玻璃襯管表面金屬離子間的相互作用所致。當基質成分通過襯管和色譜柱時掩蔽活性位點,減少了分析物的吸附和分解,與無基質注射相比有更多的分析物到達檢測器,導致基質誘導增強效應[11]。

GC-MS/MS農藥殘留檢測中通常采用基質匹配法[12]、同位素標記內標法[13]、標準加入法[14]、分析保護劑法[15]等方法消除基質效應帶來的影響。其中分析保護劑(AP)可以與農藥競爭吸附襯管中的活性位點,減少了在這些活性位點上吸附或降解引起的敏感分析物的損失,尤其是熱不穩(wěn)定農藥,從而提高純溶劑中農藥的響應值,使之接近基質中農藥的響應[16]。目前在農殘分析中應用的分析保護劑主要有3-乙氧基-1,2-丙二醇[17-20]、L-古洛糖酸-γ-內酯[21]、山梨糖醇[22]、D-核糖酸-γ-內酯[23-24]、莽草酸[25]、聚乙二醇[26-27]、乙二醇[28]、橄欖油[29]、深共晶溶劑[30]等。莽草酸是堿不穩(wěn)定農藥的保護劑,3-乙氧基-1,2-丙二醇是揮發(fā)性農藥的合適分析保護劑,對出峰較早的農藥有明顯的保護作用,L-古洛糖酸-γ-內酯是半揮發(fā)性農藥的合適保護劑,山梨糖醇可以作為低揮發(fā)性農藥的合適保護劑,對晚洗脫農藥有較好的補償效果[31],但山梨糖醇對保留時間位于中部的農藥補償效果好[32],復合分析保護劑往往可實現對性質差異較大農藥的滿意定量[31,32]。大米中農藥殘留限量眾多,性質差異大,多殘留同時檢測性能保障難度大,利用分析保護劑是提高大米中多農殘檢測性能的途徑之一。目前有關保護劑在氣質聯用大米多農殘檢測中基質效應補償作用的系統(tǒng)研究鮮有報道。

研究以大米中47種農藥及其代謝物(GB 2763—2021)為研究對象,系統(tǒng)考察了D-山梨糖醇、L-古洛糖酸-γ-內酯、莽草酸和3-乙氧基-1,2-丙二醇4種分析保護劑對基質效應的補償作用,進一步優(yōu)化復合分析保護劑,探討復合分析保護劑對大米農藥殘留檢測定量分析結果可靠性的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

TRACE1310-TSQ8000Evo氣相色譜/三重四級桿質譜聯用儀,配有EI源;5810R離心機,TARGINVX-Ⅲ多管渦旋振蕩器。

乙腈(色譜純)、乙酸(色譜純)、無水硫酸鎂(分析純)、氯化鈉(分析純)、PSA和三官能十八烷基/硅膠基體(C18,粒徑40 μm)、實驗用水為Mili-Q超純水、L-古洛糖酸-γ-內酯(分析純)、D-山梨糖醇(分析純)、莽草酸(分析純)、3-乙氧基-1,2-丙二醇(分析純)。

農藥標準品:47種農藥及其代謝物單標,質量濃度為1 000 μg/mL。

原料:大米。

1.2 溶液配制

農藥標準工作溶液:用乙腈配制47種農藥及其代謝物混合標準儲備液,于-20 ℃保存。使用前用乙腈或空白基質溶液稀釋至所需質量濃度。

D-山梨糖醇儲備液(50 mg/mL):稱取山梨糖醇500 mg于10 mL容量瓶中,加5 mL水溶解后,乙腈定容。

L-古洛糖酸-γ-內酯儲備液(50 mg/mL):稱取L-古洛糖酸-γ-內酯500 mg于10 mL容量瓶中,加4 mL水溶解后,乙腈定容。

莽草酸儲備液(50 mg/mL):稱取莽草酸500 mg于10 mL容量瓶中,加4 mL水溶解后,乙腈定容。

3-乙氧基-1,2-丙二醇儲備液(150 mg/mL):稱取3-乙氧基-1,2-丙二醇150 mg于1 mL容量瓶中,用乙腈定容。將4種儲備液按不同配比進行混合,用于AP優(yōu)化。

1.3 樣品前處理

樣品提取:稱取5 g粉碎的均勻試樣(精確到0.001 g)于50 mL 離心管中,加入 20 mL 70∶29∶1(體積比)的乙腈∶水∶乙酸混合溶液,2 500 r/min 渦旋混勻20 min,7 000 r/min離心5 min,取上清液10 mL,加入 2.0 g 無水硫酸鎂和 0.8 g 氯化鈉,以2 700r/min渦旋混勻5 min,使乙腈和水相分層。

樣品凈化:移取2 mL上層乙腈溶液于15 mL刻度離心管中,離心管中事先加入20 mg PSA、50 mg C18、300 mg無水硫酸鎂,搖勻后2 500 r/min渦旋混勻5 min,7 000 r/min離心 5 min,取上清液過 0.2 μm濾膜。

樣品上機液配制:準確移取1 mL過濾后的溶液于進樣瓶,并加入分析保護劑溶液0.06 mL,搖勻,待測。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱:TraceGOLDTMTG-OCPI色譜柱;30 m×0.25 mm×0.25 μm;色譜柱溫度:50 ℃,保持1 min,以25 ℃/min升溫至100 ℃,以8 ℃/min升溫至300 ℃,保持10 min;載氣:氦氣,純度≥99.999%,流速1.0 mL/min;進樣口溫度:280 ℃;進樣量:1 μL;進樣方式:不分流進樣。

1.4.2 質譜條件

電子轟擊源:70 eV;離子源溫度:300 ℃;傳輸線溫度:280 ℃。

多反應監(jiān)測:每種農藥分別選擇1對定量離子、1對定性離子。每種農藥的保留時間、定量離子對、定性離子對和碰撞電壓,見表1。

表1 47種農藥及代謝物的質譜條件

2 結果與分析

2.1 大米中47種農藥及其代謝物基質效應的評價

配制質量濃度為100 μg/L的農藥純溶劑(乙腈)標液及大米基質標液,采用基質中目標物響應值(峰面積)與純溶劑中目標物響應值(峰面積)比值(用百分數表示),對大米中農藥基質效應進行評價。除特樂酚和戊硝酚外,大米中其他45種農藥及代謝物基質效應>120%,為基質誘導增強效應。

2.2 單一分析保護劑對MEs的影響

本研究選用D-山梨糖醇、L-古洛糖酸-內酯、莽草酸和3-乙氧基-1,2-丙二醇4種分析保護劑,考察每種保護劑不同濃度下對溶劑中農藥基質效應的補償作用及對峰形的改善效果。配制質量濃度為100 μg/L農藥混合標準乙腈溶液,分別添加單一不同濃度的保護劑,使上機液中D-山梨糖醇、L-古洛糖酸-γ-內酯、莽草酸的質量濃度均依次為0.1、0.2、0.4、0.8、1.0 mg/mL,3-乙氧基-1,2-丙二醇的質量濃度依次為0.25、0.50、1.00、2.00、6.00 mg/mL。采用加入AP溶劑中目標物響應值與純溶劑中目標物響應值比值(用百分數表示),評價分析保護劑對溶劑中農藥基質效應補償作用。

從圖1中看出,當上機液中D-山梨糖醇為0.1、0.2、0.4 mg/mL低質量濃度時,D-山梨糖醇對溶劑中絕大部分農藥無基質補償作用,出現不顯著的基質抑制效應,初步分析可能當D-山梨糖醇濃度較低,搶占活性位點優(yōu)勢不明顯,反而因D-山梨糖醇添加又產生了新的活性位點吸附農藥,從而表現出基質抑制效應。當添加質量濃度增加到0.8 mg/mL時,基質效應由抑制轉為增強,除α-六六六、氯丹、特樂酚、狄氏劑、p,p′-滴滴滴、o,p′-滴滴涕、p,p′-滴滴涕外,其他農藥均表現出明顯的基質補償作用,特別是對出峰時間17.8 min之前的農藥(除特樂酚、戊硝酚外)基質補償作用顯著,與基質溶液中農藥響應相當,但17.8 min后大部分農藥的響應仍與基質溶液中有較大差距。當添加質量濃度為1 mg/mL時,除特樂酚、戊硝酚外,其他農藥并未出現進一步的基質補償。說明添加質量濃度為0.8 mg/mL時,氣相色譜中的活性位點幾乎已經被全部占據,繼續(xù)增加D-山梨糖醇,不能表現更好的補償作用。確定D-山梨糖醇單一添加時,最佳質量濃度為0.8mg/mL。隨著D-山梨糖醇濃度的增加,溶劑中農藥的峰形有明顯的改善,但敵稗和甲萘威仍存在拖尾的現象,見圖2。

圖1 不同濃度的D-山梨糖醇對溶劑中農藥基質效應的影響

圖2 D-山梨糖醇對溶劑中敵稗和甲萘威的峰形改善效果

與D-山梨糖醇不同,當上機液中L-古洛糖酸-γ-內酯和莽草酸為0.1、0.2、0.4 mg/mL低質量濃度時,絕大部分農藥無基質抑制效應。在0.1～0.8 mg/mL范圍內,溶劑中農藥響應隨莽草酸添加質量濃度增加呈現明顯遞增趨勢,而添加L-古洛糖酸-γ-內酯的溶液中僅氯酞酸甲酯之前出峰的農藥響應隨添加質量濃度增加緩慢遞增。當L-古洛糖酸-γ-內酯和莽草酸添加質量濃度分別繼續(xù)增加到1 mg/mL時,與D-山梨糖醇類似,溶劑中農藥并未出現明顯進一步的基質補償。確定L-古洛糖酸-γ-內酯和莽草酸單一最佳添加質量濃度為0.8 mg/mL。

由圖3可見,添加不同質量濃度3-乙氧基-1,2-丙二醇時,14.5 min之前出峰的農藥,隨著添加濃度增大,基質效應由抑制逐漸變?yōu)樵鰪?達到基質溶液中農藥響應水平;14.5 min之后出峰的農藥,基質抑制效應明顯,且農藥響應不隨添加濃度增加而發(fā)生明顯變化。3-乙氧基-1,2-丙二醇對在溶劑中峰形較差的農藥沒有明顯改善,如敵稗、甲萘威、氟除草醚、格螨酯、三唑磷和氟酰胺,甚至氟除草醚和格螨酯拖尾更加嚴重;但添加2.0、6.0 mg/mL時,氯苯甲醚和禾草敵前延峰得到非常明顯的改善。而D-山梨糖醇、L-古洛糖酸-γ-內酯或莽草酸對氯苯甲醚和禾草敵前延峰沒有改善,這是因為3-乙氧基-1,2-丙二醇是揮發(fā)性農藥的合適分析保護劑,對出峰較早的農藥有明顯的保護作用[30]。確定3-乙氧基-1,2-丙二醇單一添加時,最佳質量濃度為2.0 mg/mL。

圖3 3-乙氧基-1,2-丙二醇對溶劑中氯苯甲醚和禾草敵的峰形改善效果

在理想狀態(tài)下通常認為在純溶劑標樣和待測樣品中加入相同量的分析保護劑,保護劑能同等程度地補償標樣溶液和樣品溶液的基質效應。為此,研究同時考察了每種分析保護劑不同濃度下對大米基質中農藥的基質效應,并與添加同樣分析保護劑的乙腈溶液中農藥的基質效應進行對比。實驗中配制質量濃度為100 μg/L農藥混合大米基質溶液,分別添加不同濃度單一分析保護劑。在D-山梨糖醇、L-古洛糖酸-γ-內酯、莽草酸最佳質量濃度下(0.8mg/mL)下,分別對應有14、13、21種農藥及其代謝物的基質補償為80%～130%,可見單一保護劑對全部47種農藥及其代謝物的補償效果不太理想。

2.3 復合分析保護劑的優(yōu)化

單一分析保護劑對大米中農藥MEs補償作用研究表明,單一分析保護劑作用存在局限性。D-山梨糖醇、L-古洛糖酸-γ-內酯、莽草酸和3-乙氧基-1,2-丙二醇對低揮發(fā)性農藥、半揮發(fā)性農藥和揮發(fā)性農藥的基質效應補償作用各不同。如進行復配,發(fā)揮各自優(yōu)勢,可能實現對性質差異較大農藥的基質效應補償作用。本研究在單因素實驗的基礎上,設計L9(34)正交實驗,進一步優(yōu)化復合分析保護劑,見表2。

表2 優(yōu)化復合分析保護劑正交實驗

當分別向基質混標和溶劑混標溶液中添加不同質量濃度組合的D-山梨糖醇、L-古洛糖酸-γ-內酯、莽草酸和3-乙氧基-1,2-丙二醇混合溶液時,不同濃度組合所對應的基質效應有顯著差異,見表3。從基質補償作用看,混合AP最優(yōu)組合為AP5,有29種農藥及其代謝物的ME比值為80%～130%,可見無論是單一保護劑還是復合保護劑很難確保對標樣溶液中所有農藥的響應增強作用都達到農藥在樣品溶液中的響應程度,即對基質效應無法達到同等程度補償的目的,難以實現無空白基質的基質中農藥的準確定量,這一結論與文獻一致[2]。組合AP5中,禾草敵和氯苯甲醚的前延峰明顯,而組合AP3,即樣品上機液中D-山梨糖醇、L-古洛糖酸-γ-內酯、莽草酸和3-乙氧基-1,2-丙二醇質量濃度為0.2、0.8、0.8、2.0 mg/mL時對這2種農藥前延峰改善效果良好且其他分析物峰形也處于較理想狀態(tài),補償綜合作用良好(見圖4),因此,在實際測定過程,采取AP3保護劑基質標曲作為樣品定量標曲。

圖4 AP3和AP5對氯苯甲醚和禾草敵峰形的影響

表3 復合分析保護劑對大米基質中農藥與對溶劑中農藥基質效應補償作用對比

2.4 方法的回收率、精密度和檢出限

選用本研究優(yōu)化的復合分析保護劑AP3基質標曲定量,各農藥標準曲線在2.5～200.0 μg/L范圍內,線性良好,相關系數(R2)均大于0.996。以空白大米樣品作為添加回收實驗的基質,加標水平分別為10、100、200 μg/kg,每個加標水平進行3次平行實驗,計算各添加水平下的回收率及相對標準偏差(見圖5)。在10 μg/kg添加水平下,各農藥回收率62.2%～117.7%,相對標準偏差0.3%～29.3%;在100 μg/kg添加水平下,各農藥回收率79.3%～97.1%,相對標準偏差0.4%～10.8%;在200 μg/kg添加水平,各農藥回收率 83.1%～96.4%,相對標準偏差0.4%～14.9%。除滅草環(huán)在10 μg/kg回收率(58.7%)略低于農業(yè)部公告2386號要求(0.01 mg/kg添加水平,60%～120%),三氟硝草醚在10 μg/kg回收率(122.2%)略高于農業(yè)部公告2386號要求(0.01 mg/kg添加水平,60%～120%)外,其他農藥在10～200 μg/kg添加水平下,均符合公告要求。該方法各農藥定量限為0.01 mg/kg,檢出限小于0.001 mg/kg,能滿足GB 2763—2021 中大米中農藥限量檢測的要求,可應用于大米中限量農殘的日常檢測工作中。該法與GB 23200.113—2018對比,在3個加標水平下,47種農藥及代謝物回收率結果更好,特別是低沸點易揮發(fā)農藥優(yōu)勢明顯。

圖5 2種方法47種農藥及代謝物不同水平加標回收率對比

3 結論

通過系統(tǒng)研究4種分析保護劑對大米中47種農藥及其代謝物基質補償作用的影響,確定了單一保護劑的最佳添加濃度,為科研工作者開展分析保護劑在大米農殘檢測中的應用研究提供了參考思路。經優(yōu)化,獲得的復合分析保護劑AP3(上機液中D-山梨糖醇、L-古洛糖酸-γ-內酯、莽草酸、3-乙氧基-1,2-丙二醇的質量濃度分別為0.2、0.8、0.8、2.0mg/mL),能有效改善禾草敵和氯苯甲醚的前延峰,且其他分析物峰形也處于較理想狀態(tài),補償綜合作用良好。

本研究建立的同時檢測大米中47種農藥及其代謝物殘留的方法,采用AP3基質標曲定量,操作簡單,定量準確,各農藥標準曲線在2.5～200.0 μg/L范圍內,線性良好,相關系數(R2)均大于0.996,定量限為0.01 mg/kg,樣品平均加標回收率滿足方法學要求,與GB 23200.113—2018對比,47種農藥及代謝物回收率結果更好,適用于大批量大米樣品中農藥篩查和定量檢測。