殷雪琰,王潔瓊,王雨晴,劉笑,來青繼,翟云忠

(1.常州市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心,江蘇 常州 213002;2. 常州大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,江蘇 常州 213002)

地西泮(Diazepam,DZP)俗稱安定,是苯二氮卓類藥物之一,是臨床中比較常用的鎮(zhèn)靜催眠和抗焦慮藥物[1-2],主要用于改善病人睡眠、對(duì)抗焦慮、緩解抑郁等[3-4],人體長期服用會(huì)產(chǎn)生藥物依賴性和耐藥性[5]。DZP在動(dòng)物體內(nèi)殘留后通過食物鏈富集轉(zhuǎn)移到人體,殘留周期長[6],最終危害人體健康[7-8]。GB 31650—2019《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》[9]中規(guī)定,DZP允許作治療用、不得在動(dòng)物性食品中檢出。中國規(guī)定DZP在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中不得使用[10]。

農(nóng)業(yè)農(nóng)村部《2022年國家產(chǎn)地水產(chǎn)品獸藥殘留監(jiān)控計(jì)劃》新增了DZP在水產(chǎn)品中殘留監(jiān)測(cè)指標(biāo),標(biāo)志著國家對(duì)水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)管的進(jìn)一步加強(qiáng)。2022年7月農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布《關(guān)于監(jiān)督抽查發(fā)現(xiàn)的27批次問題農(nóng)產(chǎn)品情況的通告》[11],有18批次問題樣品屬于水產(chǎn)品,16批次問題水產(chǎn)樣品中檢出DZP殘留,涉及青魚(Mylopharyngodonpiceus)、鳊(Parabramispekinensis)、草魚(Ctenopharyngodonidella)、鯽(Carassiusauratus)等淡水魚品種。

目前,DZP的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[4]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)[5]和氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS/MS)[12]等。其中 HPLC-MS/MS因其靈敏度高、選擇性強(qiáng)及定量準(zhǔn)確,成為分析方法的首選。DZP在水產(chǎn)品中檢出頻次較高[13-15],但對(duì)于水產(chǎn)品中DZP殘留是來源于水產(chǎn)養(yǎng)殖、水產(chǎn)運(yùn)輸、休閑垂釣或是養(yǎng)殖水體污染等沒有明確的相關(guān)研究報(bào)道。為摸清常州地區(qū)水產(chǎn)品中DZP的來源,本研究建立了在線凈化-液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法,對(duì)本地水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用的飼料,垂釣中餌料、窩料和誘魚劑,養(yǎng)殖水體和相應(yīng)水體中水產(chǎn)品進(jìn)行DZP的殘留檢測(cè)。在關(guān)注水產(chǎn)品中DZP殘留量的同時(shí),探討DZP的可能來源,從源頭排查隱患來保障水產(chǎn)品的質(zhì)量安全。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

TSQ Quantum Ultra三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀(美國ThermoFisher公司),Turboflow在線樣品前處理設(shè)備(美國ThermoFisher公司),5804R冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf公司),渦旋混合器(美國Talboys公司),純水儀(美國Millipore公司),氮吹儀(美國Organomation公司),KS501 振蕩器(德國IKA公司)。

甲醇和乙腈(色譜純,美國Supelco公司),實(shí)驗(yàn)用水為超純水,PTFE濾膜(0.22 μm,上海安譜試驗(yàn)科技股份有限公司),HLB固相萃取柱(500 mg,10 mL,上海安譜試驗(yàn)科技股份有限公司)。

DZP(100 μg/mL,純度99.5%,南京鈍肯科學(xué)器材有限公司)和DZP-D5(100 μg/mL,純度98.7%,南京鈍肯科學(xué)器材有限公司),以甲醇為溶劑,將DZP和DZP-D5標(biāo)準(zhǔn)品分別配制成濃度為10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,在-20 ℃條件下儲(chǔ)存。用50%甲醇水溶液將DZP標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液使用。用50%甲醇水溶液將DZP-D5標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋成適當(dāng)濃度的工作液,按一定體積加入不同濃度DZP工作液中作內(nèi)標(biāo),現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2 樣品采集

在常州不同養(yǎng)殖場(chǎng)采集養(yǎng)殖用飼料7份,形狀為顆粒狀,將其研磨成粉狀備用;從本市不同休閑垂釣場(chǎng)收集垂釣者垂釣中使用窩料和餌料,種類適用于各種淡水魚類的垂釣,形態(tài)主要有顆粒、干粉、濕粉等共18份(窩料5份,餌料13份),均研磨成粉狀備用。從漁具店購買垂釣中搭配窩料或餌料使用誘魚劑10份,均為液體狀溶液;養(yǎng)殖水樣的采集按照HJ 494—2009《水質(zhì)采樣技術(shù)指導(dǎo)》[15]進(jìn)行,在本市水產(chǎn)運(yùn)輸車和垂釣場(chǎng)共采集水樣27份;在本市水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)和垂釣場(chǎng)采集淡水魚類(鳊、鯽、草魚和青魚等)共71份。窩料、餌料及誘魚劑樣品信息見表1。

表1 窩料、餌料及誘魚劑樣品信息表Tab.1 Information of nest material, fish bait, and fish attractants

1.3 樣品前處理

1.3.1 飼料、窩料及餌料

稱取試樣2.00 g,置于50 mL具塞離心管中,加入濃度為0.5 μg/mL DZP-D5內(nèi)標(biāo)20 μL,渦旋混勻后加入乙腈10 mL,置于振蕩器以250 r/min 振蕩提取10 min,然后 8 500 r/min離心5 min,將上清液轉(zhuǎn)移至離心管中,在剩余的樣品中再加10 mL提取液提取一次,合并提取液至離心管中。將離心管中上清液置于60 ℃的水浴中氮吹至近干,用1 mL 50%甲醇水溶液復(fù)溶,渦旋混勻后過 0.22 μm濾膜,收集于進(jìn)樣小瓶中待Turboflow在線凈化后上機(jī)測(cè)定。

1.3.2 水樣

取水樣1.0 L用布氏漏斗和快速定性濾紙進(jìn)行真空抽濾,除去水樣中泥沙、懸浮物等雜質(zhì)。依次用5 mL甲醇、5 mL的超純水活化HLB 固相萃取柱,量取過濾后的水樣100 mL,加入濃度為0.5 μg/mL DZP-D5內(nèi)標(biāo)20 μL,混合均勻后過柱上樣,富集后用6 mL水進(jìn)行淋洗,5 mL乙腈洗脫后置于60 ℃的水浴中氮吹至近干,用1 mL 50%甲醇水溶液復(fù)溶,渦旋混勻后過 0.22 μm濾膜,收集于進(jìn)樣小瓶中待Turboflow在線凈化后上機(jī)測(cè)定(液體狀溶液參考水樣作前處理)。

1.3.3 魚樣

稱取試樣2.00 g,置于50 mL具塞離心管中,加入濃度為0.5 μg/mL DZP-D5內(nèi)標(biāo)20 μL渦旋混勻30 s,加入10 mL 1%的乙酸乙腈渦旋混勻至肉完全散開,然后在4 ℃ 8 500 r/min離心5 min,將上清液轉(zhuǎn)移至離心管中。將離心管中上清液置于60 ℃的水浴中氮吹至近干,用1 mL 50%甲醇水溶液復(fù)溶,渦旋混勻后過 0.22 μm濾膜,收集于進(jìn)樣小瓶中待Turboflow在線凈化后上機(jī)測(cè)定。

1.4 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法

1.4.1 在線凈化條件

在線凈化系統(tǒng)包含凈化和分離兩部分,其中凈化主要在Loading泵中進(jìn)行,實(shí)現(xiàn)樣品在凈化柱上的凈化和富集,分離在Eluting泵中進(jìn)行,使凈化后的化合物在分析柱上實(shí)現(xiàn)洗脫分離并經(jīng)質(zhì)譜進(jìn)行分析。在線凈化柱:Cyclone-P柱(0.5 mm×50 mm);流動(dòng)相A為0.4%甲酸水溶液,B為乙腈,C為乙腈-異丙醇-丙酮(v/v/v=45∶45∶10);進(jìn)樣體積:50 μL。

1.4.2 液相條件

色譜柱:Hypersil GOLD柱(100 mm×2.1 mm,3 μm);流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液,B為甲醇,柱溫:30 ℃;進(jìn)樣體積:10 μL。在線凈化和梯度洗脫程序見表2。

表2 在線凈化和梯度洗脫程序Tab.2 Online purification and gradient elution program

表3 DZP和DZP-D5的多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)參數(shù)Tab.3 Multiple reaction monitoring (MRM) parameters for detection of DZP and DZP-D5

1.4.3 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源(ESI),正離子掃描模式,多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM),電噴霧電壓:3 500 V,離子源溫度:350 ℃,鞘氣壓力:40 Arb,輔助氣壓力:10 Arb,毛細(xì)管溫度:400 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法的建立及優(yōu)化選擇

DZP屬于苯二氮卓類藥物,由于其化學(xué)性質(zhì)在乙腈、丙酮和乙酸乙酯中均有較好的溶解性。因此選擇其作為提取溶劑,比較提取效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn),丙酮和乙酸乙酯除目標(biāo)物外會(huì)提取出較多的雜質(zhì),干擾目標(biāo)物檢測(cè)。而乙腈作為提取溶劑,可以沉淀樣品中蛋白質(zhì)同時(shí)獲得較好的提取效率,因此選擇乙腈作為提取溶劑。乙腈提取目標(biāo)物的同時(shí),樣品中大量的脂肪酸和磷脂類物質(zhì)也被提取,通過HLB小柱和在線凈化,進(jìn)一步去除雜質(zhì)降低干擾凈化提取液。

通過比較水-甲醇、水-乙腈、0.1%甲酸水-甲醇和0.1%甲酸水-乙腈 4種流動(dòng)相體系對(duì)不同基質(zhì)中地西泮響應(yīng)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液-甲醇時(shí)地西泮的響應(yīng)較好,同時(shí)也與在線凈化處理后的樣品溶解更好。因此選擇0.1%甲酸水-甲醇作為檢測(cè)的流動(dòng)相。在ESI和MRM模式下,通過優(yōu)化噴霧電壓、離子源溫度、鞘氣壓力、毛細(xì)管溫度等質(zhì)譜參數(shù),選擇離子豐度比高和干擾較小的碎片離子作為DZP的定量離子和定性離子。圖3為DZP及DZP-D5優(yōu)化后參數(shù),圖1為陽性樣品中DZP及DZP-D5提取離子流色譜圖。

圖1 陽性樣品中DZP(A)及DZP-D5(B)提取離子流色譜圖Fig.1 Extraction ion flow chromatograms of DZP (A) and DZP-D5 (B) in samples

2.2 基質(zhì)效應(yīng)及方法有效性評(píng)價(jià)

基質(zhì)效應(yīng)(Matrix effect,ME)是指樣品分析液中和目標(biāo)物共流出的其他組分改變了目標(biāo)物的響應(yīng)值,對(duì)分析方法的重現(xiàn)性、準(zhǔn)確度、靈敏度等產(chǎn)生影響,通常表現(xiàn)為基質(zhì)抑制或增強(qiáng)效應(yīng)?；|(zhì)效應(yīng)的計(jì)算公式是:ME=以基質(zhì)匹配校準(zhǔn)曲線斜率/純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線斜率。ME在0.8～1.2之間則認(rèn)為基本無基質(zhì)效應(yīng),ME在0.7以下存在基質(zhì)抑制效應(yīng),在1.2以上存在基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)[17]。經(jīng)計(jì)算DZP在投入品、水樣和水產(chǎn)品中基質(zhì)效應(yīng)均在0.8～1.2范圍內(nèi)(表4),可以看出DZP的基質(zhì)效應(yīng)不明顯,在樣品測(cè)定中采用溶劑曲線加內(nèi)標(biāo)校正的方法進(jìn)行定量。

表4 餌料、水樣和水產(chǎn)品中DZP的方法學(xué)評(píng)價(jià)Tab.4 Methodological evaluation of diazepam in fish bait, water samples, and aquatic products n=6

經(jīng)方法優(yōu)化后,采用50%甲醇水溶液配制 0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μg/L質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液,再準(zhǔn)確加入DZP-D5內(nèi)標(biāo)定量,考察回收率、線性相關(guān)性、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)、定量限(LOQ)等方法學(xué)指標(biāo)。結(jié)果表明,DZP在0.5～20.0 μg/L內(nèi)線性良好,化合物的相關(guān)系數(shù)(r2)均大于 0.999;DZP在餌料、水樣和水產(chǎn)品中的 LOQ 分別為1.0 μg/kg、0.5 μg/L、1.0 μg/kg;對(duì)DZP在空白餌料、水樣和水產(chǎn)品中分別進(jìn)行1.0 μg/kg、5.0 μg/kg和10.0 μg/kg 3個(gè)水平的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn),平行測(cè)定6次,測(cè)得待測(cè)化合物在上述3種基質(zhì)中的回收率分別為 85.2%～106.5%、82.3%～108.0%、90.7%～116.0%,RSD分別為≤ 5.1%、≤4.3%、≤ 2.6%,表明該方法具有較好的準(zhǔn)確度和精密度,滿足檢測(cè)方法的相關(guān)要求,具體結(jié)果見表4。

2.3 不同樣品檢測(cè)結(jié)果分析

對(duì)7份不同廠家生產(chǎn)的飼料進(jìn)行DZP檢測(cè),飼料中均未檢出DZP;對(duì)18份垂釣用窩料和餌料進(jìn)行檢測(cè),其中12份有檢出,檢出率66.7%,其殘留為2.2～213 090.0 μg/kg。在所有檢出DZP的窩餌料中,DZP含量在1.0～100.0 μg/kg 內(nèi)樣品占比為41.7%;含量在100.0～1 000.0 μg/kg內(nèi)樣品占比為8.3%;其中50%的樣品中DZP的含量超過1 000.0 μg/kg。對(duì)10份誘魚劑(主要通過拌入窩料或餌料使用)進(jìn)行檢測(cè),其100%有檢出,檢出濃度為637 000.0～3 471 000.0 μg/kg。對(duì)本市水產(chǎn)運(yùn)輸和垂釣塘水體共采集樣品27份進(jìn)行DZP檢測(cè),其中水產(chǎn)運(yùn)輸中采集水樣4份,均未檢出DZP,垂釣場(chǎng)養(yǎng)殖水體采樣23份,100%檢出DZP,濃度為0.4～9.8 μg/L。在本市4家純水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)、8家純垂釣場(chǎng)及2家養(yǎng)殖和垂釣兼有的漁場(chǎng)共采集淡水魚(鳊、鯽、草魚和青魚等)樣品71份,其中4家純水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)采集樣品13個(gè),均未檢出DZP;2家養(yǎng)殖和垂釣兼具的漁場(chǎng)(部分塘口純養(yǎng)殖,部分塘口對(duì)外垂釣)共采樣15份,從養(yǎng)殖塘采集樣品11個(gè),均未檢出DZP;垂釣塘采4個(gè)樣品,均檢出DZP,濃度范圍0.5～2.6 μg/kg;從8家純垂釣塘采集樣品43個(gè),其中35個(gè)樣品檢出DZP,檢出率81.2%,檢出濃度為0.6～21.8 μg/kg,具體結(jié)果見表5。

表5 不同樣品中DZP的檢測(cè)情況Tab.5 Detection of DZP in different samples

2.4 樣品中DZP殘留來源分析

目前,經(jīng)常出現(xiàn)有關(guān)水產(chǎn)品中DZP殘留超標(biāo)的相關(guān)報(bào)道,但對(duì)于DZP殘留來源卻一直未明確。DZP是γ-氨基丁酸激動(dòng)劑受體,其主要的作用是產(chǎn)生神經(jīng)抑制信號(hào),從而產(chǎn)生鎮(zhèn)靜、催眠和抗驚厥等作用,根據(jù)DZP的作用機(jī)理,如在養(yǎng)殖中使用會(huì)使水產(chǎn)品產(chǎn)生行動(dòng)遲緩、攝食減少、生長緩慢等不良后果,同時(shí)也沒有提高抗病力或凈化水環(huán)境作用,因此水產(chǎn)養(yǎng)殖中基本沒有添加或使用的必要性[18],從飼料樣品的檢測(cè)情況也發(fā)現(xiàn)正規(guī)飼料廠生產(chǎn)的飼料中并未有DZP檢出。有研究認(rèn)為水產(chǎn)品運(yùn)輸過程中可能存在非法使用DZP來降低其對(duì)環(huán)境的應(yīng)激反應(yīng),提高水產(chǎn)品成活率的情況[19],抽取了部分在水產(chǎn)品運(yùn)輸過程中常用的鎮(zhèn)靜劑檢測(cè)發(fā)現(xiàn),該類鎮(zhèn)靜劑主要成分為間氨基苯甲酸乙酯甲烷磺酸鹽(MS-222)和丁香酚等。MS-222在水溶液中經(jīng)鰓和皮膚等部位傳導(dǎo)至魚腦感受中樞,抑制魚的反射和活動(dòng)能力,使魚行動(dòng)遲緩、代謝降低而進(jìn)入類休眠狀態(tài)[20],而丁香酚是通過抑制魚的腦皮質(zhì)作用于基底神經(jīng)節(jié)和小腦,最終作用于脊髓達(dá)到麻醉效果[21]。根據(jù)使用濃度的不同,在運(yùn)輸中使魚達(dá)到不同的麻醉時(shí)效,適合長短途運(yùn)輸[22]。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn),丁香酚使用后易于從魚體排出[23],幾乎無殘留且安全性較高,目前兩種鎮(zhèn)靜劑在國外均被批準(zhǔn)作為水產(chǎn)鎮(zhèn)靜劑使用[24]。通過添加該類鎮(zhèn)靜劑可有效降低魚體新陳代謝活動(dòng),提高運(yùn)輸成活率,但其主要成分并非DZP;同時(shí)對(duì)常州地區(qū)部分運(yùn)輸水采樣檢測(cè)也未發(fā)現(xiàn)DZP,說明在運(yùn)輸過程中添加的鎮(zhèn)靜劑主要成分并非DZP。

近年來淡水魚中關(guān)于DZP檢出陽性相關(guān)報(bào)道多與休閑漁業(yè)相關(guān)[25-27],休閑垂釣中窩料和餌料的使用可能會(huì)是DZP來源的主要途徑之一,檢測(cè)結(jié)果表明窩料和餌料中DZP的檢出率達(dá)到66.7%,從表1中可以看出,抽取的部分窩料、餌料的主要成分中含有誘食劑。而為提高垂釣效果增加垂釣者的捕魚成功率,會(huì)在窩料和餌料中拌入誘魚劑,對(duì)10瓶誘魚劑檢測(cè)發(fā)現(xiàn)100%含有DZP,且濃度均達(dá)到了mg/kg級(jí),10瓶誘魚劑中除了4瓶未標(biāo)明成分外,其余誘魚劑的成分中也均含有誘食劑?？梢娬T食劑很可能是窩料、餌料和誘魚劑中DZP的重要來源。目前有研究發(fā)現(xiàn)斑馬魚(Brachydanioreriovar)在高濃度DZP的水環(huán)境中會(huì)發(fā)生群聚效應(yīng),且更傾向于停留在該區(qū)域,將含DZP的窩料或餌料拋入水中會(huì)在短時(shí)間內(nèi)形成一個(gè)高濃度DZP的環(huán)境,促使周邊的魚聚集和進(jìn)食[28-29],從而達(dá)到快速捕魚的效果[7]。特別是黑坑、競(jìng)技垂釣的存在,使得摻入DZP的窩料、餌料或誘魚劑使用范圍中更廣,更受垂釣者的青睞。休閑垂釣中窩料和餌料的使用,使養(yǎng)殖水體和水產(chǎn)品處于DZP污染中,加之DZP本身代謝周期較長,給養(yǎng)殖環(huán)境及水產(chǎn)品安全造成影響。

3 結(jié)論

DZP作為一種禁用藥物,近年來在水產(chǎn)品中頻繁檢出,為弄清水產(chǎn)品中DZP殘留的來源,對(duì)常州地區(qū)水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用的飼料、垂釣中的餌料、窩料和誘魚劑、養(yǎng)殖水體和相應(yīng)水體的水產(chǎn)品中DZP殘留情況進(jìn)行分析,同時(shí)建立了在線凈化-液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定DZP的方法。經(jīng)驗(yàn)證該方法具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)及定量結(jié)果準(zhǔn)確等特點(diǎn),滿足實(shí)際樣品中DZP的檢測(cè)分析需求。經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)垂釣中使用的窩料、餌料及誘魚劑中DZP的檢出率高、殘留量大,這可能是目前養(yǎng)殖水體和水產(chǎn)品中DZP頻繁檢出的重要因素之一。窩料、餌料及誘魚劑作為垂釣中重要的投入品,亟需對(duì)其來源與主要成分進(jìn)行分析,并將其納入水產(chǎn)養(yǎng)殖投入品的監(jiān)管范圍。養(yǎng)殖過程中禁用或限用藥物的不規(guī)范生產(chǎn)和使用,導(dǎo)致其在水產(chǎn)品中殘留超標(biāo),影響?zhàn)B殖水產(chǎn)品質(zhì)量安全,有必要對(duì)養(yǎng)殖中投入品及其主要成分開展進(jìn)一步調(diào)查分析,對(duì)其安全隱患等進(jìn)行跟蹤評(píng)估。