基于網(wǎng)絡藥理學、分子對接技術及實驗驗證探討新橙皮苷治療創(chuàng)傷性腦損傷作用機制

王伸盛，張新中，張岱男，岳雙柱，楊衛(wèi)瀧，李文超

新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 河南省神經(jīng)修復重點實驗室，河南 新鄉(xiāng) 453100

創(chuàng)傷性腦損傷是指由外部物理力量引起的大腦神經(jīng)功能障礙[1]。據(jù)統(tǒng)計，全世界每年有5 000 多萬人遭受顱腦損傷[2]。顱腦損傷包括原發(fā)性和繼發(fā)性，原發(fā)性損傷與大腦的原發(fā)外部影響直接相關，繼發(fā)性損傷在原發(fā)性損傷后幾分鐘到幾天內(nèi)發(fā)生，通過氧化應激、炎癥反應、細胞凋亡等機制，進一步損害神經(jīng)細胞，破壞血腦屏障，引起嚴重腦水腫[3]。研究發(fā)現(xiàn)，繼發(fā)性腦損傷在很大程度上決定了顱腦損傷患者的預后情況[4]。

新橙皮苷是一種二氫黃酮苷類化合物，作為一種傳統(tǒng)中藥枳實的主要成分，具有抗氧化[5]、降低炎性反應[6]、抗凋亡[7]等作用。研究表明，新橙皮苷可以穿透血腦屏障[8]，即使在大鼠中每天750 mg/kg劑量持續(xù)91 d 未見明顯毒性反應[9]。新橙皮苷在腦缺血實驗中通過抑制神經(jīng)細胞的凋亡和氧化應激，減輕神經(jīng)元損傷，增強大腦的抗氧化能力，從而減輕腦缺血再灌注損傷，顯著改善神經(jīng)功能[10]，但對大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后的神經(jīng)保護機制尚未見報道。

網(wǎng)絡藥理學以廣泛的數(shù)據(jù)庫為基礎，已成為系統(tǒng)揭示復雜生物系統(tǒng)功能和行為的有力工具，可全面揭示多成分藥物植物中多成分-多靶點-多通路的作用機制[11]，本研究利用通過網(wǎng)絡藥理學方法及動物實驗探討新橙皮苷治療創(chuàng)傷性腦損傷的神經(jīng)保護作用機制，為后續(xù)藥物研發(fā)的開展提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級SD 雄性大鼠72 只，體質(zhì)量（200±20）g，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，動物生產(chǎn)合格證號SCXK（魯）20220006，此實驗經(jīng)過新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準，動物實驗倫理批文號EC-022-206。

1.2 主要試劑與儀器

新橙皮苷（質(zhì)量分數(shù)≥97%，批號N886330）購于上海麥克林生化科技股份有限公司；ELISA 試劑盒購自武漢菲恩生物科技有限公司；TUNEL 試劑盒購自武漢賽維爾生物科技有限公司；PCR 引物購自上海生工公司；RNA 提取及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自天根生化科技(北京)公司；倒置熒光顯微鏡成像系統(tǒng)購自德國Carl Zeiss 公司，Quantitation DX 實時熒光定量PCR 儀購自美國ABI 公司。

1.3 網(wǎng)絡藥理學

1.3.1 新橙皮苷靶點的預測 使用TCMSP 數(shù)據(jù)庫（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）、Pharmmapper數(shù)據(jù)庫（http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）、BATMAN-TCM 數(shù)據(jù)庫（http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/）和SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫（http://www.swisstargetprediction.ch/），并查閱相關文獻，對新橙皮苷的潛在靶點進行預測，在去重后，經(jīng)Uniprot 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）將靶點信息進行規(guī)范化處理。

1.3.2 創(chuàng)傷性腦損傷靶點的收集 基于OMIM 數(shù)據(jù)庫（https://www.omim.org/）和TCMIP 數(shù)據(jù)庫（http://www.tcmip.cn/TCMIP/index.php）[12]、Drug Bank 數(shù)據(jù)庫（https://go.drugbank.com/）、Pharmgkb數(shù)據(jù)庫（https://www.pharmgkb.org/）、TTD 數(shù)據(jù)庫（http://db.idrblab.net/ttd/ ）、GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/），以關鍵詞“traumatic brain injury”進行檢索，獲得創(chuàng)傷性腦損傷的疾病靶點，合并數(shù)據(jù)去重后，利用UniProt 數(shù)據(jù)庫將靶點信息進行規(guī)范化處理。

1.3.3 蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡的構建和核心靶點篩選 使用Venny 2.1.0 獲得新橙皮苷、創(chuàng)傷性腦損傷的交集靶點并繪制Venn 圖，并導入STRING數(shù)據(jù)庫（https://cn.string-db.org/）中，設置種屬為“Home sapiens”，得到PPI 網(wǎng)絡，利用Cytoscape 3.8.0的Network Analysis 插件對得到的PPI 網(wǎng)絡進行拓撲分析，應用CytoHubba 插件基于最大團中心性（MCC）算法來確定PPI 排名前10 位的節(jié)點作為核心靶點。

1.3.4 靶點基因本體（GO）功能與京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析 利用David 數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/home.jsp），對新橙皮苷-創(chuàng)傷性腦損傷交集靶點進行GO 功能與KEGG通路富集分析，設置物種為“Homo sapiens”，其中GO 功能分析包括生物功能（BP）、細胞成分（CC）、分子功能（MF）3 部分，將結果導入微生信軟件，畫圖并分析。

1.3.5 分子對接[13]驗證新橙皮苷與核心靶點的結合能力 在PubChem 數(shù)據(jù)庫獲取新橙皮苷的結構式，將1.3.3 項下篩選的核心靶點作為分子對接的靶點蛋白，靶點蛋白結構從PDB 數(shù)據(jù)庫獲得PDB ID，在PDB 數(shù)據(jù)庫中下載蛋白3D 結構。用Pymol和Autodock 軟件對靶點蛋白進行去水、去配體、加氫、分配電荷處理，采用AutoDockTools 1.5.7 軟件完成分子對接，最后利用PyMol 軟件處理結果。

1.4 動物實驗驗證

1.4.1 分組、造模與給藥 將大鼠適應性喂養(yǎng)1 周后，隨機分為假手術組、模型組和新橙皮苷組，每組24 只。模型組和新橙皮苷組采用改良Feeney's 法造模，即沿頭部中線切開皮膚，分離皮下組織暴露顱骨，定位右側(cè)中線旁2.5 mm，冠狀縫后1.5 mm處，使用顱骨磨鉆打開直徑約5 mm 骨窗，保持硬腦膜完整，調(diào)節(jié)自由落體打擊裝置，對準骨窗，于30 cm 處使用20 g 砝碼自由落體打擊骨窗，假手術組只頭皮切開、游離骨膜、打開骨窗，不進行自由落體打擊。腦損傷大鼠出現(xiàn)短暫的呼吸暫停、四肢抽搐且昏迷2 h 以上者為造模成功[14]。新橙皮苷組于腦損傷后ip 生理鹽水稀釋的新橙皮苷40 mg/kg，給藥劑量參考文獻報道[11]設置，假手術組和模型組給予ip 等量的生理鹽水，1 次/d，共給藥7 d。

1.4.2 大鼠神經(jīng)功能評估 于造模后第1、2、3、5、7 天對各組大鼠采用神經(jīng)功能缺損（mNSS）法進行評估，mNSS 評分包括運動、感覺、反射和平衡測試，評分越高表明大鼠神經(jīng)功能障礙越嚴重。

1.4.3 大鼠腦組織病理觀察 采用尼氏染色法進行觀察。每組選取造模后3 d 大鼠5 只，ip 戊巴比妥鈉麻醉，用生理鹽水和4%多聚甲醛心臟灌注后斷頭取腦，用4%多聚甲醛固定液固定，石蠟包埋切片，行尼氏染色，鏡下觀察腦組織神經(jīng)元細胞病理形態(tài)學，并拍照記錄。

1.4.4 大鼠腦組織凋亡細胞情況 采用TUNEL 染色法進行觀察。取1.4.3 項下腦組織石蠟切片，參照TUNEL 試劑盒說明書步驟進行檢測，依次采用TUNEL 反應混合液、DAPI 染色，封片后使用熒光顯微鏡觀察損傷灶及周圍腦組織并拍照，每張切片中隨機取6 個視野，使用Image J 圖像分析軟件計數(shù)凋亡細胞和總細胞（結果取平均值），計算凋亡率。

1.4.5 大鼠腦組織中炎癥因子含量測定 每組選取造模后3 d 大鼠5 只，ip 戊巴比妥鈉麻醉，斷頭取腦，取損傷灶及邊緣2 mm 區(qū)域，按照腦濕質(zhì)量與生理鹽水100 mg∶0.9 mL 的比例進行組織勻漿，經(jīng)研磨儀破碎處理，離心后取其上清液，采用ELISA法檢測腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素（IL）-6、IL-1β 含量，具體操作參照相應試劑盒說明書。

1.4.6 qRT-PCR法檢測大鼠腦組織血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、酪氨酸蛋白激酶（SRC）、蛋白激酶B1（Akt1）mRNA 表達水平 根據(jù)試劑盒說明書操作從受損腦組織中提取RNA。經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄擴增后，采用熒光定量PCR 儀（QuantStudio DX）進行常規(guī)溶解曲線分析，測定Ct 值，采用2-ΔΔCt法計算各組目的基因的表達水平，結果以β-actin 作為內(nèi)參基因，引物序列見表1。

表1 PCR 引物序列Table 1 PCR primer sequence

1.4.7 統(tǒng)計學方法 結果采用SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件分析，計量資料采用表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗。

2 結果與分析

2.1 新橙皮苷靶點的收集

通過數(shù)據(jù)庫檢索并經(jīng)過查閱文獻報道[15]補充相關作用靶點，比較分析去除重復值后獲得322 個作用靶點。

2.2 創(chuàng)傷性腦損傷靶點的獲取

基于使用OMIM、TCMIP、DrugBank、TTD、GeneCards 等數(shù)據(jù)庫，獲取創(chuàng)傷性腦損傷的作用靶點，合并數(shù)據(jù)庫去除重復值后，獲得創(chuàng)傷性腦損傷疾病相關作用靶點1 470 個。

2.3 新橙皮苷治療創(chuàng)傷性腦損傷共同靶點的網(wǎng)絡構建及分析

通過Venny 圖獲得新橙皮苷治療創(chuàng)傷性腦損傷的交集靶點85 個，見圖1。利用Cytoscape 3.8.0 軟件構建“新橙皮苷-靶點-創(chuàng)傷性腦損傷”關系網(wǎng)絡，見圖2。

圖1 Venn 圖Fig.1 Venn diagram

圖2 新橙皮苷-靶點-創(chuàng)傷性腦損傷復雜網(wǎng)絡Fig.2 Neohesperidin -target-traumatic brain injury complex network

2.4 新橙皮苷和創(chuàng)傷性腦損傷PPI 網(wǎng)絡的構建和分析

將85 個交集靶點導入STRING 數(shù)據(jù)庫構建PPI網(wǎng)絡見圖3，該網(wǎng)絡共有85 個節(jié)點和362 條邊，使用Cytoscape 3.8.0 的CytoHubba 插件基于MCC 算法來確定PPI 排名前10 位的節(jié)點作為核心靶點有基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）、環(huán)加氧酶2（PTGS2）、過氧化物酶體增殖激活受體γ（PPARG）、表皮生長因子受體（EGFR）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）8、IL-6、SRC、MAPK14、TNF、Akt1，見圖4。

圖3 交集靶點PPI 網(wǎng)絡圖Fig.3 PPI network diagram of intersection target

圖4 核心靶點PPI 網(wǎng)絡圖Fig.4 Core target PPI network diagram

2.5 GO 功能與KEGG 通路富集分析

GO 富集分析結果表明，CC 主要涉及質(zhì)膜、胞外區(qū)、膜筏；生物過程主要涉及對細胞凋亡過程的負調(diào)控、對異種刺激的反應、蛋白水解作用；MF 主要涉及相同蛋白結合、酶結合、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性、蛋白激酶活性，根據(jù)Count 值篩選出每個模塊的前10 個項目，并將其可視化，見圖5。

圖5 GO 功能富集分析Fig.5 GO functional enrichment analysis histogram

KEGG 通路富集分析結果顯示，新橙皮苷治療創(chuàng)傷性腦損傷的關鍵靶點可能主要集中在內(nèi)分泌抵抗、VEGF 信號通路、TNF 通路、Rap1 信號通路等，其可能主要通過抗炎、抗凋亡途徑起到保護神經(jīng)作用，根據(jù)P值選出前20 項結果，并繪制氣泡圖，見圖6。

圖6 KEGG 通路富集分析Fig.6 KEGG pathway enrichment analysis bubble diagram

2.6 分子對接結果

將新橙皮苷與10 個核心靶點分別進行分子對接。分子對接的穩(wěn)定性一般通過結合能的大小來體現(xiàn)，結合能越小，結合兩者的能量所需越少，結構越穩(wěn)定。當結合能小于-5.0 kcal/mol（1cal＝4.2 J）表示具有較好的結合能力，結果表明，新橙皮苷與10 個核心靶點之間結合活性良好，見表2，提示新橙皮苷可能通過作用于以上10 個核心靶點發(fā)揮治療創(chuàng)傷性腦損傷的作用，見圖7。

圖7 新橙皮苷與核心靶蛋白的分子對接圖Fig.7 Molecular docking diagram of neohesperidin and core target protein

表2 新橙皮苷與核心靶點的結合能Table 2 Binding energy between neohesperidin and core target

2.7 實驗驗證

2.7.1 大鼠mNSS 評分 在第1～7 天，相較于假手術組，模型組大鼠mNSS 評分顯著升高（P＜0.05），在第2～7 天時，與模型組比較，新橙皮苷組大鼠mNSS 評分均顯著降低（P＜0.05），見表3。

表3 各組大鼠神經(jīng)功能缺損mNSS 評分（，n =6）Table 3 mNSS score for neurological deficits in each group of rats (,n =6)

表3 各組大鼠神經(jīng)功能缺損mNSS 評分（，n =6）Table 3 mNSS score for neurological deficits in each group of rats (,n =6)

與假手術組比較：*P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05。*P ＜ 0.05 vs sham-operation group;#P ＜ 0.05 vs model group.

2.7.2 大鼠腦組織病理學變化 給藥3 d 后，尼氏染色顯示，假手術組神經(jīng)元細胞排列有序，細胞形態(tài)規(guī)則，染色較淡，核仁明顯；模型組腦組織損傷灶神經(jīng)元細胞排列紊亂而稀松，細胞固縮，神經(jīng)元數(shù)量減少；新橙皮苷組正常形態(tài)細胞較多，排列相對規(guī)則，固縮減輕，神經(jīng)元細胞及尼氏小體數(shù)量顯著增加，見圖8。

圖8 新橙皮苷對創(chuàng)傷性腦損傷大鼠腦組織損傷灶病理變化的影響（尼氏染色，×400）Fig.8 Effect of neohesperidin on pathological changes of brain tissue injury foci in traumatic brain injury rats（Niss staining,×400）

2.7.3 大鼠腦組織神經(jīng)細胞凋亡情況 給藥3 d 后，相較于假手術組，模型組大鼠腦組織細胞凋亡率明顯上調(diào)（P＜0.05），與模型組比較，新橙皮苷組大鼠腦組織細胞凋亡率的顯著降低（P＜0.05），見圖9、10。

圖9 給藥3 d 后各組大鼠腦組織損傷灶神經(jīng)細胞凋亡情況（Tunel，×400）Fig.9 Neurocell apoptosis in the injury foci of rat brain tissue in each group after 3 d of drug administration（Tunel staining,×400）

圖10 各組大鼠腦組織損傷灶神經(jīng)元凋亡率Fig.10 Neuronal apoptosis rate of brain tissue injury lesion

2.7.4 大鼠腦組織炎癥因子含量比較 與假手術組相比，模型組大鼠損傷灶中炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α 的含量顯著升高（P＜0.05），相較于模型組，新橙皮苷組大鼠損傷灶中炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α 的含量明顯下降（P＜0.05），見圖11。

圖11 各組大鼠腦組織中IL-6、IL-1β、TNF-α 含量（，n =6）Fig.11 Levels of IL-6,IL-1β,and TNF-α in the brain tissue of rats in each group (,n =6)

2.7.5 大鼠腦組織VEGF、SRC、AKT1mRNA 表達量的比較 給藥3 d 后，相較于假手術組，模型組大鼠腦組織中SRC、Akt1mRNA 表達水平均顯著下調(diào)，而VEGFmRNA 表達水平明顯上調(diào)（P＜0.05），與模型組相比較，新橙皮苷組大鼠腦組織中VEGF、SRC、AKT1mRNA 表達水平明顯上調(diào)（P＜0.05），見圖12。

圖12 新橙皮苷治療對大鼠腦組織VEGF、SRC、AKT1 mRNA 表達量的影響（，n =6）Fig.12 Effect of neohesperidin treatment on the expression of VEGF,SRC,and Akt1 mRNA in rat brain tissue (,n =6)

3 討論

目前，創(chuàng)傷性腦損傷已成為全球第3 大死因[16]。全球每年有超過5 000 萬人患有不同程度的創(chuàng)傷性腦損傷[17]。嚴重的創(chuàng)傷性腦損傷會導致癡呆、長期殘疾或死亡，并且預后不良，給家庭和社會帶來沉重的經(jīng)濟負擔[18]。創(chuàng)傷性腦損傷包括原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷。其中，由機械力造成的原發(fā)性神經(jīng)損傷通常為難逆甚至不可逆。因此，如何早期減輕繼發(fā)性腦損傷具有非常重要的意義[19]。本研究為探討新橙皮苷治療創(chuàng)傷性腦損傷的作用機制，通過網(wǎng)絡藥理學方法篩選出新橙皮苷的主要作用靶點，并應用動物實驗驗證了篩選的預測結果。

通過網(wǎng)絡藥理學和分子對接技術篩選并驗證了10 個核心靶基因，包括MMP9、PTGS2、PPARG、EGFR、MAPK8、IL-6、SRC、MAPK14、TNF、Akt1等，其中MMP9與腦水腫發(fā)生密切相關，過度表達可導致血腦屏障通透性增加，加重腦水腫[20]。PTGS2 可將花生四烯酸轉(zhuǎn)化為生物活性前列腺素，腦損傷后急性炎癥級聯(lián)反應中發(fā)揮核心作用[21]。PPARG 具有保護中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用，表現(xiàn)為抑制炎癥、抑制神經(jīng)元凋亡、保護血腦屏障等[22]。EGFR信號通路激活，引起小膠質(zhì)細胞活化，產(chǎn)生IL-6、IL-1β 和TNF-α 等炎癥因子，從而加速神經(jīng)細胞損傷[23]。MAPK8 又稱為JNK，屬于MAPK 家族，在炎癥與細胞凋亡等應激反應中發(fā)揮重要作用[24]。IL-6 在創(chuàng)傷性腦損傷后炎癥反應、神經(jīng)創(chuàng)傷修復等方面起著重要作用，研究表明，IL-6 作為變化指標能提高對創(chuàng)傷性腦損傷不良預后的預測特異性和敏感性[25]。SRC 是一種非受體蛋白酪氨酸激酶，可調(diào)節(jié)細胞外信號調(diào)節(jié)激酶，繼而發(fā)揮腦保護作用[26]。MAPK14 是MAPKs 超家族的一員，在顱腦創(chuàng)傷后病情發(fā)展的信號傳遞過程中發(fā)揮著重要作用[27]。Akt1 可以通過抑制細胞凋亡過程參與細胞存活途徑，可以阻止細胞凋亡從而促進細胞存活[28]。TNF是重要的免疫調(diào)節(jié)和炎癥因子，參與創(chuàng)傷性腦損傷后炎癥反應等過程[29]，TNF-α 在腦組織中高表達具有神經(jīng)毒性，可加速神經(jīng)細胞的死亡[30]。GO 生物過程富集分析結果顯示，新橙皮苷可能通過對細胞凋亡過程的負調(diào)控、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）信號的正調(diào)控過程、蛋白水解作用參與生物過程。KEGG 通路富集分析發(fā)現(xiàn)，新橙皮苷可能主要通過抗凋亡、抗炎等途徑治療創(chuàng)傷性腦損傷，保護神經(jīng)功能，主要涉及VEGF 信號通路、Rap1 信號通路、TNF 信號通路等。新橙皮苷與MMP9、EGFR、MAPK8、IL-6、TNF、Akt1 等10 個核心靶點均具有較好的結合活性及穩(wěn)定性，具有良好的親和力。上述核心靶點與VEGF 信號通路明顯相關，表明新橙皮苷可能通過VEGF 信號通路治療創(chuàng)傷性腦損傷。研究發(fā)現(xiàn)，VEGF 信號通路在血管新生、血管通透性、增強神經(jīng)元細胞的再生與分化等方面發(fā)揮重要作用[31]。據(jù)報道，發(fā)生創(chuàng)傷性腦損傷后，腦組織損傷區(qū)域VEGF 表達上調(diào)，促進微血管發(fā)生，改善損傷大腦缺血缺氧狀態(tài)，促進腦損傷神經(jīng)修復。并且VEGF 可以通過參與損傷血管的修復與再生，可以加快損傷區(qū)域腦組織新血管的形成及微環(huán)境的構建，從而達到修復受損神經(jīng)組織的目的[32]。SRC為VEGF 通路的下游基因。SRC 蛋白激活后會進一步促使PI3K/Akt 通路激活[33]，在PI3K 通路中，PI3K 激活后誘導Akt 自身磷酸化，來調(diào)節(jié)下游底物表達，如Foxo、Caspase-9、mTOR 等，通過激活數(shù)個信號轉(zhuǎn)導通路發(fā)揮多重生物學效應，包括抗氧化、調(diào)節(jié)細胞周期、抗炎、抗凋亡等作用?；诰W(wǎng)絡藥理學預測結果，通過體內(nèi)實驗表明，新橙皮苷治療可以改善神經(jīng)功能缺損，減輕神經(jīng)細胞損傷，抑制細胞凋亡，并且顯著抑制創(chuàng)傷性腦損傷大鼠腦組織中炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α 的表達，同時明顯上調(diào)VEGF、SRC、Akt1mRNA 表達水平，從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

綜上所述，本研究采用網(wǎng)絡藥理學、分子對接及體內(nèi)實驗初步預測了新橙皮苷治療創(chuàng)傷性腦損傷關鍵靶點及通路。新橙皮苷可能通過MMP9、PTGS2、PPARG、EGFR、MAPK8、IL-6、SRC、MAPK14、TNF、Akt1 等核心靶點，通過干預VEGF信號通路、TNF 通路、Rap1 信號通路等通路，進而發(fā)揮治療創(chuàng)傷性腦損傷的作用，本研究可為新橙皮苷治療創(chuàng)傷性腦損傷的進一步實驗及臨床研究提供參考，但相關研究結果仍有待進一步的生物學驗證。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突