陳穎，劉小鋒，陳一萍，廖麗萍，傅洪濤

(1.湖南化工研究院有限公司國(guó)家農(nóng)藥創(chuàng)制工程技術(shù)研究中心，長(zhǎng)沙 410014；2.湖南化肥農(nóng)藥質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)授權(quán)站，長(zhǎng)沙 410014)

農(nóng)藥在農(nóng)作物病蟲草害防治中被廣泛地使用，是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中不可缺的一種特殊產(chǎn)品，對(duì)農(nóng)作物穩(wěn)產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)具有很重要的作用。隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展，政府部門對(duì)農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量安全日趨重視。中國(guó)作為農(nóng)藥生產(chǎn)和使用大國(guó)，近年來(lái)，大量的劣質(zhì)農(nóng)藥和假冒農(nóng)藥經(jīng)常出現(xiàn)在市場(chǎng)上，對(duì)農(nóng)民和消費(fèi)者產(chǎn)生極大的危害。因此，農(nóng)業(yè)農(nóng)村局對(duì)農(nóng)資店的農(nóng)藥檢查非常嚴(yán)格，每年國(guó)家農(nóng)業(yè)農(nóng)村部及省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳都開展了大量的樣品監(jiān)督抽查行動(dòng)。目前我國(guó)農(nóng)藥種類很多，已有農(nóng)藥1000 多種，其中常用農(nóng)藥有400 多種，主要為殺菌劑、殺蟲劑、除草劑和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。面對(duì)上千種農(nóng)藥產(chǎn)品，要確定農(nóng)藥里面添加的每一個(gè)隱性成分對(duì)分析人員而言是相當(dāng)困難的，要系統(tǒng)地排查農(nóng)藥隱性添加成分就需要建立農(nóng)藥產(chǎn)品的指紋譜庫(kù)。

關(guān)于農(nóng)藥產(chǎn)品中隱性成分的排查手段，主要采用氣質(zhì)聯(lián)用儀建立的標(biāo)準(zhǔn)普庫(kù)，王興寧等[1]通過(guò)氣質(zhì)譜庫(kù)檢測(cè)97 種農(nóng)藥殘留樣品，其匹配度高，但是此方法一般只能檢測(cè)揮發(fā)性比較強(qiáng)的農(nóng)藥，且大部分農(nóng)藥都是熱不穩(wěn)定的、不易揮發(fā)的，通常不適合采用氣質(zhì)譜聯(lián)儀來(lái)完成，必須使用液相色譜或者液質(zhì)譜聯(lián)用儀完成[2-3]。于峰等[4]建立了194 種常規(guī)農(nóng)藥的HPLC-DAD-MS/MS 標(biāo)準(zhǔn)指紋譜圖數(shù)據(jù)庫(kù)，其匹配性良好、特征性和專屬性很強(qiáng)。液質(zhì)聯(lián)用儀能夠很好應(yīng)用于未知成分的排查，但是其儀器昂貴、使用成本高，一般檢測(cè)機(jī)構(gòu)配備少或沒有配備。目前國(guó)內(nèi)有關(guān)采用高效液相色譜儀分離和提取紫外-可見光譜圖并建立紫外-可見光譜庫(kù)在農(nóng)藥隱性成分排查中的應(yīng)用尚未見報(bào)道?；诖?，本文采用液相色譜儀開展了紫外-可見光譜標(biāo)準(zhǔn)庫(kù)的構(gòu)建及其在農(nóng)藥產(chǎn)品中隱性成分的監(jiān)測(cè)應(yīng)用研究，為農(nóng)藥市場(chǎng)監(jiān)管和產(chǎn)品質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器

LC-20 AT 型高效液相色譜儀配SPD-M20 A 型光電二極管陣列檢測(cè)器、SIL-20 A 型自動(dòng)進(jìn)樣器和N2000 工作站(日本島津公司)；AUY2200 型電子天平(日本島津公司)；AS3120 型超聲波清洗儀(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)；CASCADA 超純水儀(美國(guó)PALL 公司)；過(guò)濾器(濾膜直徑為0.45 μm)(上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)；100 μL 微量進(jìn)樣針(江蘇治宇醫(yī)療器材有限公司)。

1.2 藥劑及試劑

農(nóng)藥制劑樣品2 個(gè)：20%乙螨唑懸浮劑和10%阿維菌素·甲氧蟲酰肼懸浮劑，系湖南省地方農(nóng)業(yè)農(nóng)村局市場(chǎng)抽查送檢樣品。農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)樣品共計(jì)137 個(gè)，其中自國(guó)家農(nóng)藥質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心購(gòu)買91 種，即苯線磷(fenamiphos)、吡蟲啉(imidacloprid)、吡蚜酮(pymetrozine)、丙硫克百威(benfuracarb)、丙溴磷(profenofos)、殘殺威(propoxur)、蟲螨腈(chlorfenapyr)、蟲酰肼(tebufenozide)、噠嗪硫磷(pyridaphenthion)、單甲脒(semiamitraz chloride)、稻豐散(phenthoate)、敵百蟲(trichlorfon)、敵敵畏(dichlorvos)、地蟲硫磷(fonofos)、丁硫克百威(carbosulfan)、丁醚脲(diafenthiuron)、啶酰菌胺(boscalid)、毒死蜱(chlorpyrifos)、多殺霉素(spinosad)、噁蟲威(bendiocarb)、二嗪磷(diazinon)、二溴磷(dibrom)、伏殺硫磷(phosalone)、氟胺氰菊酯(tau-fluvalinate)、氟蟲腈(fipronil)、氟蟲脲(flufenoxuron)、氟蟲雙酰胺(sulfluramid)、氟啶蟲酰胺(flufenamide)、氟硅菊酯(acrinathrin)、氟氯氰菊酯(cyfluthrin)、氯氰菊酯(cypermethrin)、己唑醇(hexaconazole)、甲氨基阿維菌素(emamectin benzoate)、甲拌磷(phorate)、甲基毒死蜱(chlorpyrifos-methyl)、甲基硫環(huán)磷(posfolan-methyl)、甲氧蟲酰肼(methoxyfenozide)、甲基嘧啶磷(pirimiphos-methyl)、甲基異柳磷(isofenphosmethyl)、甲萘威(carbaryl)、甲氰菊酯(fenpropathrin)、甲胺磷(methamidophos)、抗蚜威(pirimicarb)、克百威(carbofuran)、苦參堿(matrine)、喹硫磷(quinalphos)、樂果(dimethoate)、聯(lián)苯菊酯(bifenthrin)、硫丹(endosulfan)、硫雙威(thiodicarb)、硫線磷(cadusafos)、氯胺磷(chloramine phosphorus)、二氯異丙蟲酰胺(dichloroisopropanamide)、氯氟氰菊酯(cyhalothrin)、氯菊酯(permethrin)、氯噻啉(imidaclothiz)、氯唑磷(isazofos)、螺蟲乙酯(spirotetramat)、馬拉硫磷(malathion)、醚菊酯(ethofenprox)、滅多威(methomyl)、滅線磷(ethoprophos)、氰氟蟲腙(metaflumizone)、氰戊菊酯(fenvalerate)、炔咪菊酯(imiprothrin)、噻蟲胺(clothianidin)、噻蟲啉(thiacloprid)、噻蟲嗪(thiamethoxam)、噻嗪酮(buprofezin)、噻唑磷(fosthiazate)、三氟甲吡醚(f-methyl methyl ether)、殺蟲單(monosulta)、殺蟲環(huán)(thiocyclam)、殺鈴脲(triflumuron)、殺螺胺(clouitrilide)、殺螟丹(cartap)、殺螟硫磷(fenitrothion)、殺撲磷(methidathion)、虱螨脲(lufenuron)、水胺硫磷(isocarbophos)、四氟甲醚菊酯(dimefluthrin)、四氟醚菊酯(tetramethylfluthrin)、氟醚唑(tetraconazole)、四溴菊酯(thralomethric)、速滅威(metolcarb)、涕滅威(aldicarb)、烯啶蟲胺(nitenpyram)、硝蟲硫磷(xiaochongthion)、辛硫磷(phoxim)、溴氰菊酯(deltamethrin)和亞胺硫磷(phosmet)，自上海市農(nóng)藥研究所有限公司購(gòu)買39 種，即氧樂果(omethoate)、乙蟲腈(ethiprole)、乙酰甲胺磷(acephate)、異丙威(isoprocarb)、茚蟲威(indoxacarb)、仲丁威(fenobucarb)、治螟磷(sulfotep)、阿維菌素(B1a+B1b)[avermectin(B1a+B1b)]、阿維菌素B2a(avermectin B2a)、胺菊酯(tetramethrin)、苯醚氰菊酯(cyphenothrin)、吡丙醚(pyriproxyfen)、避蚊胺(DEET)、噠螨靈(pyridaben)、啶蟲脒(acetamiprid)、多氟脲(noviflumuron)、氟蟲胺(sulfluramid)、呋蟲胺(dinotefuran)、氟氯苯菊酯(flumethrin)、氟酰脲(novaluron)、甲基吡噁磷(azamethiphos)、甲醚菊酯(methothrin)、喹螨醚(fenazaquin)、聯(lián)苯肼酯(biphenylhydrazine)、螺螨酯(spirodiclofen)、氯氟醚菊酯(meperfluthrin)、氯烯炔菊酯(chlorempenthrin)、驅(qū)蚊酯(BAAPE)、炔丙菊酯(prallethrin)、炔螨特(propargite)、噻螨酮(hexythiazox)、三氯殺蟲酯(acetofenate) 、 三氯殺螨醇(dicofol) 、 三唑磷(triazophos)、雙甲脒(amitraz)、雙硫磷(temephos)、四氟苯菊酯(transfluthrin)、四螨嗪(clofentezine)和溴螨酯(bromopropylate)，自美國(guó)Chemservice 購(gòu)買7 種，即乙螨唑(etoxazole)、乙唑螨腈(cyetpyrafen)、唑蟲酰胺(tolfenpyrad)、唑螨酯(fenpyroximate)、氯蟲苯甲酰胺(chlorantraniliprole)、氟磺酰胺(sulfonamides)和硫蟲酰胺(thiotraniliprole)，上述所有農(nóng)藥標(biāo)樣的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98.0%。乙腈，色譜純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)有限公司；超純水，采用CASCADA 超純水儀制備。

1.3 液相色譜操作條件

保護(hù)柱：4.0×10 mm 不銹鋼柱，內(nèi)填C18的填充物，粒徑5 μm；色譜柱：250 mm×4.6 mm 不銹鋼柱，內(nèi)填C18的填充物，粒徑5 μm；流速：1.0 mL/min；柱溫：25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：190～800 nm；進(jìn)樣體積：10 μL；梯度洗脫：乙腈(A 相)-水溶液(B 相)，如表1 所示。

表1 梯度洗脫

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及測(cè)定

1.4.1 配制

稱取上述1.2 中的137 種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)樣品0.04 g 于25 mL 容量瓶中，加乙腈或水15 mL 置于超聲波中溶解超聲7 min 后，冷卻到室溫用乙腈或水稀釋至刻度線，混勻。標(biāo)樣響應(yīng)值高的用移液管繼續(xù)移取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL 于另一個(gè)25 mL 的容量瓶中，用稀釋液(乙腈∶水=5∶5，體積比)稀釋至刻度，混勻，備用。

1.4.2 測(cè)定

在上述1.3 的液相色譜操作條件下，待液相色譜儀基線穩(wěn)定后，依次進(jìn)上述1.2 中的標(biāo)準(zhǔn)樣品測(cè)定，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品重復(fù)測(cè)定3 次。所有標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)完以后其保留時(shí)間分布在3.0～30 min 之間。標(biāo)準(zhǔn)樣品保留時(shí)間在18～24 min 分布最多，基本上呈現(xiàn)一個(gè)高斯分布圖，左右兩邊少，中間最多的分布趨勢(shì)。該梯度洗脫能夠很好的分開各標(biāo)樣之間的保留時(shí)間，使標(biāo)樣能夠很好的分開。

1.5 紫外-可見光譜庫(kù)的建立

標(biāo)樣梯度洗脫完以后，通過(guò)N2000 工作站提取137 種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的紫外-可見光譜圖建立紫外-可見光譜庫(kù)。農(nóng)藥紫外-可見光譜庫(kù)以波長(zhǎng)(190～800 nm)為橫座標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)的光譜圖組成，以下簡(jiǎn)稱為“譜庫(kù)”。

1.6 試樣溶液的配制和測(cè)定

分別稱取20%乙螨唑懸浮劑樣品(有效成分乙螨唑含量為20%)和10%阿維菌素·甲氧蟲酰肼懸浮劑樣品(有效成分阿維菌素(B1a+B1b)和甲氧蟲酰肼含量分別為2%和8%)0.040 g 于25 mL 容量瓶中，加乙腈-水溶液(V∶V=5∶5)15 mL 置于超聲波超聲溶解7 min 后，冷卻到常溫后用乙腈-水溶液稀釋至刻度，混勻，備用。用濾膜直徑為0.45 μm 的過(guò)濾頭過(guò)濾2 個(gè)樣品溶液，按1.3 液相色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。色譜圖分別見圖1 和圖2。

圖1 20%乙螨唑懸浮劑樣品的液相色譜圖

圖2 10%阿維菌素·甲氧蟲酰肼懸浮劑樣品的液相色譜圖

2 結(jié)果與分析

2.1 譜庫(kù)對(duì)20%乙螨唑懸浮劑樣品中的隱性成分確定分析

從圖1 20%乙螨唑懸浮劑樣品的色譜圖中選取波長(zhǎng)254 nm 的吸光度作為譜庫(kù)檢索色譜圖，發(fā)現(xiàn)色譜圖中出現(xiàn)3 個(gè)強(qiáng)的色譜峰，從左至右依次按數(shù)字標(biāo)記為目標(biāo)物T1、T2 和T3，其色譜保留時(shí)間分別為3.910、16.495 和24.844 min。分別經(jīng)農(nóng)藥紫外-可見光譜庫(kù)進(jìn)行檢索，其結(jié)果見圖3、圖4、圖5 及其相應(yīng)表2。

圖3 T1色譜峰紫外-可見光譜庫(kù)檢索結(jié)果(Target為目標(biāo)物T1，Library 為農(nóng)藥譜庫(kù)中的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì))

圖4 T2色譜峰紫外-可見光譜庫(kù)檢索結(jié)果(Target為目標(biāo)物T2，Library 為農(nóng)藥譜庫(kù)中的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì))

圖5 T3色譜峰紫外-可見光譜庫(kù)檢索結(jié)果(Target為目標(biāo)物T3，Library 為農(nóng)藥譜庫(kù)中的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì))

表2 10%阿維菌素·甲氧蟲酰肼懸浮劑色譜峰紫外-可見光譜庫(kù)檢索結(jié)果

表2 20%乙螨唑懸浮劑色譜峰紫外-可見光譜庫(kù)檢索結(jié)果

從圖3 可以看出，目標(biāo)物T1 的紫外可見吸收曲線與農(nóng)藥譜庫(kù)中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)呋蟲胺的相似度達(dá)到了0.999 9，2 者的紫外-可見光譜線完全重疊，且目標(biāo)物T1 與呋蟲胺(3.896min)的保留時(shí)間很接近，據(jù)此可以初步確定乙螨唑懸浮劑樣品中存在農(nóng)藥隱性成分呋蟲胺。

從圖4 可以看出，目標(biāo)物T2 檢索的結(jié)果為二氯異丙蟲酰胺[5]，目標(biāo)物T2 與農(nóng)藥譜庫(kù)中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)二氯異丙蟲酰胺的紫外-可見光譜線在200～230 nm雖然并未完全重合，但是其形狀和位置變化很相似，其相似度達(dá)到了0.999 7，且目標(biāo)物T2 與二氯異丙蟲酰胺(16.612 min)的保留時(shí)間很接近，由此可以初步確認(rèn)該懸浮劑樣品中存在隱性成分二氯異丙蟲酰胺。

從圖5 可以看出，雖然目標(biāo)物T3 與農(nóng)藥譜庫(kù)中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)乙螨唑的紫外-可見光譜吸收線在200～230 nm之間疊合較差，但是其形狀和位移變化相同，其相似度達(dá)到了0.999 8，只是吸光度強(qiáng)度有點(diǎn)改變，且2 者的保留時(shí)間接近，據(jù)此可以確認(rèn)該目標(biāo)物為產(chǎn)品中的有效成分乙螨唑[6]。

根據(jù)以上分析初步確認(rèn)，20%乙螨唑懸浮劑樣品中存在有呋蟲胺和二氯異丙蟲酰胺2 個(gè)隱性成分，屬于不合格產(chǎn)品。

2.2 譜庫(kù)對(duì)10%阿維菌素·甲氧蟲酰肼懸浮劑樣品中隱性成分確認(rèn)分析

從圖2 10%阿維菌素·甲氧蟲酰肼懸浮劑樣品的色譜圖中選取波長(zhǎng)245 nm 的吸光度作為譜庫(kù)檢索色譜圖，發(fā)現(xiàn)色譜圖中出現(xiàn)4 個(gè)強(qiáng)的色譜峰，從左至右依次按數(shù)字標(biāo)記為目標(biāo)物T4、T5、T6 和T7，其色譜保留時(shí)間分別為15.468、17.039、25.219 和26.533 min。分別經(jīng)農(nóng)藥紫外-可見光譜庫(kù)進(jìn)行檢索，其結(jié)果見圖6、圖7、圖8、圖9 及其相應(yīng)表2。

圖6 T4色譜峰紫外-可見光譜庫(kù)檢索結(jié)果(Target為目標(biāo)物T4，Library 為農(nóng)藥譜庫(kù)中的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì))

圖7 T5色譜峰紫外-可見光譜庫(kù)檢索結(jié)果(Target為目標(biāo)物T5，Library 為農(nóng)藥譜庫(kù)中的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì))

圖8 T6色譜峰紫外-可見光譜庫(kù)檢索結(jié)果(Target為目標(biāo)物T6，Library 為農(nóng)藥譜庫(kù)中的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì))

圖9 T7色譜峰紫外-可見光譜庫(kù)檢索結(jié)果(Target為目標(biāo)物T7，Library 為農(nóng)藥譜庫(kù)中的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì))

從圖6 可以看出，目標(biāo)物T4 檢索的結(jié)果為乙蟲腈，目標(biāo)物T4 與農(nóng)藥譜庫(kù)中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)乙蟲腈的紫外-可見光譜線在200、220 nm 2 個(gè)波長(zhǎng)雖然并未完全重合，但是其形狀和位置變化很相似，其相似度達(dá)到了0.999 1，且目標(biāo)物T4 與乙蟲腈(15.461 min)的保留時(shí)間很接近，由此可以初步確定阿維菌素·甲氧蟲酰肼懸浮劑樣品中存在隱性成分乙蟲腈。

從圖7 可以看出，目標(biāo)物T5 的紫外可見吸收曲線與農(nóng)藥譜庫(kù)中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)甲氧蟲酰肼[7]標(biāo)樣的相似度達(dá)到了0.999 9，2 者的紫外-可見光譜線完全重疊，且目標(biāo)物T5 與甲氧蟲酰肼(17.043min)的保留時(shí)間很接近，據(jù)此可以初步確認(rèn)該懸浮劑樣品中存在農(nóng)藥隱性成分甲氧蟲酰肼。

從圖8 可以看出，目標(biāo)物T6 的紫外可見吸收曲線與農(nóng)藥譜庫(kù)中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)甲氰菊酯的相似度達(dá)到了0.999 8，2 者的紫外-可見光譜線完全重疊，且目標(biāo)物T6 與甲氰菊酯(25.187min)的保留時(shí)間很接近，據(jù)此可以確認(rèn)該目標(biāo)物為產(chǎn)品的有效成分甲氰菊酯[8]。

從圖9 可以看出，雖然目標(biāo)物T7 與農(nóng)藥譜庫(kù)中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)阿維菌素(B1a+B1b)的紫外-可見光譜吸收線在200～300 nm 之間有小部分疊合較差，但是其形狀和位移變化相同，其相似度達(dá)到了0.999 3，只是吸光度強(qiáng)度有點(diǎn)改變，且2 者的保留時(shí)間接近，據(jù)此可以確認(rèn)該目標(biāo)物為產(chǎn)品中的有效成分阿維菌素(B1a+B1b)[9]。

根據(jù)以上分析初步確認(rèn)，10%阿維菌素·甲氧蟲酰肼懸浮劑樣品中存在有乙蟲腈和甲氰菊酯2 個(gè)隱性成分，屬于不合格產(chǎn)品。根據(jù)《農(nóng)藥管理?xiàng)l例》的規(guī)定，農(nóng)藥制劑中所含有效成分的名稱與產(chǎn)品說(shuō)明書或標(biāo)簽上注明農(nóng)藥有效成分的名稱不相符的為假農(nóng)藥。

3 結(jié)論

本研究表明，農(nóng)藥紫外可見吸收光譜圖庫(kù)的構(gòu)建和檢索驗(yàn)證可以較好應(yīng)用于農(nóng)藥產(chǎn)品中隱性成分的排查，準(zhǔn)確率可達(dá)到了100%，即只要譜庫(kù)含有的目標(biāo)化合物，通過(guò)特征性和專屬性很強(qiáng)的相似度和保留時(shí)間分析，就能匹配到較滿意的結(jié)果。該方法具有成本相對(duì)低(相對(duì)于液-質(zhì)-質(zhì)和氣-質(zhì)-質(zhì)而言)、操作簡(jiǎn)單、快速、可靠性和準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)，克服了以往單一依靠目標(biāo)物保留時(shí)間定性很容易出現(xiàn)假陽(yáng)性現(xiàn)象，但是該譜庫(kù)法依然存在一些不足，例如，譜庫(kù)圖的建立耗時(shí)費(fèi)力，且根據(jù)紫外-可見光吸收峰構(gòu)建的農(nóng)藥譜庫(kù)僅適用于常規(guī)農(nóng)藥制劑產(chǎn)品的隱性排查，難以用于無(wú)生色團(tuán)或助色團(tuán)的目標(biāo)物及農(nóng)藥殘留排查，因此尚需進(jìn)一步完善和優(yōu)化譜庫(kù)。