王博寧，李佳星，周沙，陳杰

(1.浙江農(nóng)林大學(xué)林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江省綠色農(nóng)藥2011 協(xié)同創(chuàng)新中心，杭州 311300；2.鄂爾多斯市林業(yè)和草原事業(yè)發(fā)展中心，鄂爾多斯 017010)

油茶(Camellia oleiferaAbel)是山茶科(Theaceae)山茶屬(Camellia)植物，起源于中國，是我國生產(chǎn)食用油的主要作物[1-2]。油茶主要生長在我國中南部地區(qū)，由于其較強的環(huán)境適應(yīng)性，少量分布在東南亞和日本[3]。雖然我國油茶種植面積大，但產(chǎn)量因油茶易感病而受到一定限制，其中油茶炭疽病尤為嚴重[4]，但目前尚無防治油茶炭疽病的登記藥劑。

苯醚甲環(huán)唑(difenoconazole，圖1A)是一種植物病原菌甾醇脫甲基化抑制劑，通過抑制病菌細胞麥角甾醇的生物合成，從而破壞病原菌細胞膜結(jié)構(gòu)與功能，可用于果樹、蔬菜、小麥、馬鈴薯、豆類、瓜類等作物多種真菌性病害的防控[5-9]。嘧菌酯(azoxystrobin，圖1B)屬于甲氧丙烯酸酯類殺菌劑，具有內(nèi)吸性傳導(dǎo)性好、滲透性強、持效期長等特點，對幾乎所有真菌病害都具有保護、治療和鏟除作用，既可用于莖葉噴霧，也可用于種子處理和土壤處理[10-15]。

圖1 苯醚甲環(huán)唑(A)和嘧菌酯(B)的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

同一作物病原菌的敏感性因殺菌劑種類而異。為了提高防治效果，擴大殺菌譜，延長使用壽命，生產(chǎn)實際中往往將2 種或以上的農(nóng)藥進行混合使用。一些研究也已證明，苯醚甲環(huán)唑和嘧菌酯的混用對一些作物病原菌表現(xiàn)出明顯的增效作用[16-18]。陳建等[16]發(fā)現(xiàn)，苯醚甲環(huán)唑與嘧菌酯質(zhì)量比為5∶8 的混配抑制山藥炭疽病菌菌絲生長最明顯，EC50值為2.88 mg/L，通過聯(lián)合毒力測定增效系數(shù)為4.75；在田間藥效試驗中，2 種藥劑質(zhì)量比為5∶8 時對山藥炭疽病的防效最好。陸德玲等[17]報道苯醚甲環(huán)唑和嘧菌酯復(fù)配比例為3∶5 時，其對冬棗炭疽病的共毒系數(shù)為198.72，增效最明顯，且防效在75.69%～90.44%之間，優(yōu)于單劑。張蕊蕊等[18]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)嘧菌酯與苯醚甲環(huán)唑的質(zhì)量分數(shù)比為5∶2 時，其對水稻稻瘟病的共毒系數(shù)為142.99，表現(xiàn)出最大增效作用，且對水稻稻瘟病具有良好的田間防治效果。但目前尚未見苯醚甲環(huán)唑和嘧菌酯對油茶炭疽病的聯(lián)合作用報道。基于此，本文以油茶炭疽病原菌(Colletotrichum camelliae)為對象，開展苯醚甲環(huán)唑和嘧菌酯的復(fù)配配方篩選及聯(lián)合作用研究，同時選擇最佳配比的制劑產(chǎn)品325 g/L 苯甲·嘧菌酯懸浮劑進行田間試驗驗證，以期為油茶炭疽病防治和茶油的食品安全提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 主要供試儀器

可調(diào)式移液器[大龍興創(chuàng)實驗儀器(北京)股份有限公司]；YXQ-100SII 滅菌鍋(上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司)；JY10002 電子天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；SW-CJ-2FD 潔凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)。

1.2 供試材料

1.2.1 供試藥劑

試驗藥劑：96.5%苯醚甲環(huán)唑原藥，96.0%嘧菌酯原藥，325 g/L 苯甲·嘧菌酯懸浮劑；對照藥劑：40%苯醚甲環(huán)唑懸浮劑和25%嘧菌酯懸浮劑，上述原藥和藥劑均來源于杭州宇龍化工有限公司。

1.2.2 供試菌株

油茶炭疽病原菌(Colletotrichum Camelliae)，分離自常山受感染油茶葉上，菌種由實驗室保存。

1.2.3 培養(yǎng)基

PDA 固體培養(yǎng)基：無水葡萄糖20.0 g/L、馬鈴薯200.0 g/L、瓊脂粉18.0 g/L，蒸餾水1 L，pH 自然。

1.3 試驗方法

1.3.1 室內(nèi)毒力測定

根據(jù)NY/T 1156.2-2006《農(nóng)藥室內(nèi)生物測定試驗準則殺菌劑第2 部分：抑制病原真菌菌絲生長試驗平皿法》推薦的菌絲生長速率法進行試驗。

(1)供試菌株活化培養(yǎng)：將植物病原菌接種于PDA 平板上，在25 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，選擇培養(yǎng)皿外圍活力旺盛菌株備用。

(2)藥劑配制：苯醚甲環(huán)唑、嘧菌酯原藥用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解配制成5%的母液，用0.1%的吐溫80 水溶液稀釋。根據(jù)藥劑活性，將苯醚甲環(huán)唑標為A，嘧菌酯記為B。將A 設(shè)置20、10、5、2.5、1.25、0.625 mg/L 的6 個質(zhì)量濃度梯度，B 設(shè)置100、50、25、12.5、6.25、3.125 mg/L 的6 個質(zhì)量濃度梯度。A∶B 為5∶4、4∶5 的混配比例設(shè)置10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 5 mg/L 的6 個質(zhì)量濃度梯度，A∶B 為5∶8 的混配比例設(shè)置20、10、5、2.5、1.25、0.625 mg/L 的6 個質(zhì)量濃度梯度。同時設(shè)置不含藥劑的DMF 和0.1%吐溫80 溶液為對照CK。

(3)藥劑處理：在無菌操作條件下，根據(jù)試驗處理將預(yù)先融化的滅菌培養(yǎng)基定量加入無菌錐形瓶中，從CK、低濃度到高濃度依次定量吸取藥液，分別加入上述錐形瓶中，充分搖勻。然后等量倒入3 個直徑為9 cm 的一次性培養(yǎng)皿中，制成相應(yīng)濃度的含藥平板。每處理3 個重復(fù)。

(4)接種：含毒培養(yǎng)基冷卻凝固后，將培養(yǎng)好的膠孢炭疽菌用直徑6 mm 的打孔器取邊緣活性較強的菌塊，用接種針將打好的菌塊放置在含毒PDA 培養(yǎng)基中央，倒置在25 ℃左右培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。觀察CK菌落的生長情況，當(dāng)CK 的菌落生長至直徑6～7 cm時采用十字法用直尺測量各處理菌落的直徑，采用下列公式計算出菌絲生長抑制率。

式中，I表示菌絲生長抑制率(%)；D0表示空白對照菌落增長直徑(cm)；Dt表示藥劑處理菌落增長直徑(cm)。

(5)共毒系數(shù)計算：采用DPS 統(tǒng)計軟件對各單劑及不同配比混劑的濃度對數(shù)值和相應(yīng)抑制率幾率值進行回歸分析，計算EC50值及95%置信限。根據(jù)NY/T 1156.6-2006《農(nóng)藥室內(nèi)生物測定試驗準則殺菌劑第6 部分：混配的聯(lián)合作用測定》推薦的共毒系數(shù)法評價兩種藥劑的聯(lián)合作用，其共毒系數(shù)(CTC)計算公式如下：

式中，ATI 表示混劑實測的毒力指數(shù)；S 表示標準藥劑的EC50(mg/L)；M 表示混劑的EC50(mg/L)。

式中，TTI 表示混劑的理論毒力指數(shù)；TIA表示A 藥劑毒力指數(shù)；PA表示A 藥劑在混劑中的百分含量(%)；TIB表示B 藥劑毒力指數(shù)；PB表示B 藥劑在混劑中的百分含量(%)。

式中，CTC 表示共毒系數(shù)；ATI 表示混劑實測毒力指數(shù)；TTI 表示混劑理論毒力指數(shù)。

1.3.2 田間藥效試驗

根據(jù)NY/T 1464.7-2007《農(nóng)藥田間藥效試驗準則第7 部分：殺菌劑防治煙草炭疽病》開展田間試驗。

(1) 試驗地點選擇

選擇浙江、湖南和江西等3 個油茶種植區(qū)進行田間藥效試驗，即浙江省開化縣長虹鄉(xiāng)虹橋村：試驗作物為7 年盛果期油茶樹，供試品種為長林4 號；湖南省長沙市瀏陽市小河鄉(xiāng)潭灣村：試驗作物為2008 年種植的油茶，供試品種為湘林所油茶無性系16；江西省豐城市白土鎮(zhèn)崗霞村：作物為6 年生油茶，供試品種為贛無24。

(2) 試驗設(shè)計

將試驗藥劑325 g/L 苯甲·嘧菌酯懸浮劑設(shè)置3 個施藥劑量，分別為216.67、325.00、406.25 mg/kg，對照藥劑40%苯醚甲環(huán)唑懸浮劑設(shè)置1 個使用劑量133.33 mg/kg，對照藥劑25%嘧菌酯懸浮劑設(shè)置1 個使用劑量250.00 mg/kg，CK 噴施清水，共6 個處理，如表1 所示。

表1 試驗藥劑使用劑量設(shè)計

具體施藥時間：3 個試驗地均施藥2 次。浙江試驗地于2020 年6 月21 日進行第1 次施藥，2020 年7 月1 日進行第2 次施藥；湖南試驗地于2020 年4 月8 日進行第1 次施藥，2020 年4 月18 日進行第2 次施藥；江西試驗地于2020 年6 月6 日進行第1 次施藥，2020 年6 月16 日進行第3 次施藥。

(3) 結(jié)果調(diào)查及計算

油茶葉片炭疽病的病情等級按以下方法進行調(diào)查：每小區(qū)定點調(diào)查3 株油茶樹，每株調(diào)查5 個新梢枝條上的全部葉片，記錄葉片總數(shù)、各級病葉數(shù)。病情分級按以下標準進行：

0 級：無病斑；

1 級：病斑面積占整個葉面積的1%以下；

3 級：病斑面積占整個葉面積的2%～5%；

5 級：病斑面積占整個葉面積的6%～20%；

7 級：病斑面積占整個葉面積的21%～35%；

9 級：病斑面積占整個葉面積的36%以上。

所有實驗數(shù)據(jù)采用DPS 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)軟件進行統(tǒng)計分析，先采用反正弦平方根轉(zhuǎn)換，再用鄧肯氏新復(fù)極差(DMRT)法進行統(tǒng)計分析。藥效按下列公式計算：

式中：X為病情指數(shù)；Ni為各級病葉數(shù)(片)；i為相對級數(shù)值；N為調(diào)查總?cè)~數(shù)(片)。

式中：P為防治效果(%)；CK0為空白對照區(qū)施藥前病情指數(shù)；CK1為空白對照區(qū)施藥后病情指數(shù)；PT0為藥劑處理區(qū)施藥前病情指數(shù)；PT1為藥劑處理區(qū)施藥后病情指數(shù)。

1.3.3 作物安全性評價

參照NY/T 1965.1-2010《農(nóng)藥對作物安全性評價準則第1 部分：殺蟲劑和殺菌劑對作物安全性評價室內(nèi)試驗方法》，采用噴霧法對油茶樹進行處理。325 g/L 苯甲·嘧菌酯懸浮劑設(shè)置3 個施藥劑量，分別為406.25、812.50、1 625.00 mg/kg，另外設(shè)置1 個清水對照。藥后20 d 開始調(diào)查?？梢詫⑺巹┨幚韰^(qū)與空白對照區(qū)比較，評價其藥害程度。同時記錄葉片變色、壞死、生長抑制等情況。藥害分級標準如表2 所示。

表2 作物安全性試驗?zāi)繙y法評價標準

2 結(jié)果與分析

2.1 苯醚甲環(huán)唑和嘧菌酯對油茶炭疽病的聯(lián)合作用

室內(nèi)毒力測定結(jié)果如表3 所示，苯醚甲環(huán)唑和嘧菌酯對油茶炭疽病原菌的EC50分別為0.858 6、10.305 mg/L。在混配試驗中，當(dāng)混配比(A∶B)為5∶4、5∶8 和4∶5 時，EC50分別為1.509、1.533、1.651 mg/L。

表3 苯醚甲環(huán)唑與嘧菌酯及其不同配比對油茶炭疽病原菌的室內(nèi)毒力測定結(jié)果

CTC 是衡量殺菌劑混劑是否具有增效作用的指標。采用Sun-Johnson 的共毒系數(shù)法測定了苯醚甲環(huán)唑和嘧菌酯對油茶炭疽病原菌的聯(lián)合作用，結(jié)果見表4?？梢?，苯醚甲環(huán)唑和嘧菌酯的混配比(A∶B)為5∶4 和4∶5 時，其CTC 分別為96.10 和106.19，介于80、120 之間，表現(xiàn)為相加作用；混配比(A∶B)為5∶8 時，其CTC 為128.43，大于120，表現(xiàn)出增效作用。

表4 苯醚甲環(huán)唑(A)與嘧菌酯(B)對油茶炭疽病原菌的聯(lián)合作用測定結(jié)果

2.2 田間藥效試驗

2.2.1 325 g/L 苯甲·嘧菌酯懸浮劑防治油茶炭疽病田間藥效試驗結(jié)果

325 g/L 苯甲·嘧菌酯懸浮劑對防治油茶炭疽病的田間防治試驗結(jié)果見表5?？梢姡?25 g/L 苯甲·嘧菌酯懸浮劑對油茶炭疽病具有較好的防效。在浙江地區(qū)，325 g/L 苯甲·嘧菌酯懸浮劑在有效成分用量為216.67、325.00、406.25 mg/kg 對油茶炭疽病的防效分別為76.04%、82.51%、83.39%，防治效果與施藥劑量成正相關(guān)。325 g/L 苯甲·嘧菌酯懸浮劑有效成分325.00、406.25 mg/kg 對油茶炭疽病的防效顯著高于對照藥劑40%苯醚甲環(huán)唑懸浮劑有效成分133.33 mg/kg、25%嘧菌酯懸浮劑有效成分250.00 mg/kg 的防效；325 g/L 苯甲·嘧菌酯懸浮劑有效成分216.67 mg/kg對油茶炭疽病的防效與對照藥劑40%苯醚甲環(huán)唑懸浮劑有效成分133.33 mg/kg和25%嘧菌酯懸浮劑有效成分250.00 mg/kg 的防效相當(dāng)。

表5 325 g/L 苯甲·嘧菌酯懸浮劑防治油茶炭疽病田間藥效試驗結(jié)果

在湖南地區(qū)，325 g/L 苯甲·嘧菌酯懸浮劑在有效成分用量為216.67、325.00、406.25 mg/kg 對油茶炭疽病的防效分別為73.03%、81.18%、89.36%，各處理間均差異顯著；試驗藥劑有效成分用量216.67 mg/kg 處理對油茶炭疽病的防效顯著低于對照藥劑40%苯醚甲環(huán)唑懸浮劑有效成分用量133.33 mg/kg 的防效，略低于對照藥劑25%嘧菌酯懸浮劑有效成分用量為250.00 mg/kg 的防效，但差異不顯著；試驗藥劑325.00 mg/kg 的有效成分劑量下對油茶炭疽病的防效均顯著高于對照藥劑25%嘧菌酯懸浮劑有效成分用量為250.00 mg/kg 的防效，高于對照藥劑40%苯醚甲環(huán)唑懸浮劑有效成分用量133.33 mg/kg 的防效，但差異不顯著；試驗藥劑406.25 mg/kg 的有效成分劑量下對油茶炭疽病的防效最好，顯著高于其它處理的防效。

在江西地區(qū)，325 g/L 苯甲·嘧菌酯懸浮劑有效成分用量216.67、325.00、406.25 mg/kg 對油茶炭疽病的防效分別為72.51%、76.64%、80.61%。供試藥劑3 個劑量處理的防效均有顯著性差異，且供試藥劑劑量為325.00、406.25 mg/kg 的防效均顯著性高于對照藥劑40%苯醚甲環(huán)唑懸浮劑(有效成分133.33 mg/kg)和25%嘧菌酯懸浮劑(有效成分250 mg/kg)處理的防效，供試藥劑劑量為216.67 mg/kg 的防效與對照藥劑40%苯醚甲環(huán)唑懸浮劑(有效成分133.33 mg/kg)和25%嘧菌酯懸浮劑(有效成分250 mg/kg)處理的防效均無顯著差異。

2.2.4 325 g/L 苯甲·嘧菌酯懸浮劑對油茶的安全性

325 g/L 苯甲·嘧菌酯懸浮劑對油茶的安全性試驗結(jié)果如圖2 所示?？梢?，325 g/L 苯甲·嘧菌酯懸浮劑施藥劑量為406.25、812.50、1 625.00 mg/kg 時，通過油茶22 號、油茶53 號和油茶4 號3 個油茶品種的葉片、枝條和果實調(diào)查，未見油茶出現(xiàn)任何明顯藥害癥狀，葉片無變色、壞死等癥狀，說明該混劑對油茶安全。

圖2 325 g/L 苯甲·嘧菌酯懸浮劑對油茶作物的安全性

3 結(jié)論

為提高苯醚甲環(huán)唑和嘧菌酯的防治效果，延長兩種殺菌劑的使用壽命，擴大殺菌譜，應(yīng)對多病并發(fā)，本文通過苯醚甲環(huán)唑和嘧菌酯對油茶炭疽病的室內(nèi)聯(lián)合毒力及最佳配比組合制劑產(chǎn)品325 g/L 苯甲·嘧菌酯懸浮劑的田間藥效試驗評價，為油茶炭疽病防治提供理論依據(jù)。

3.1 苯醚甲環(huán)唑和嘧菌酯對油茶炭疽病的復(fù)配配方篩選

采用共毒系數(shù)法進行混配配方篩選，發(fā)現(xiàn)苯醚甲環(huán)唑和嘧菌酯的混配比為5∶8 時，其對油茶炭疽菌的抑菌效果最佳，表現(xiàn)為明顯的增效作用，可以將該配比作為防治油茶炭疽病的最適配比。

3.2 325 g/L 苯甲·嘧菌酯懸浮劑的田間藥效試驗研究

在浙江、江西和湖南開展田間藥效試驗結(jié)果表明，325 g/L 苯甲·嘧菌酯懸浮劑可有效防治油茶炭疽病的為害，建議在油茶炭疽病未發(fā)病或發(fā)病初期，以推薦有效成分用量216.67～406.25 mg/kg(制劑稀釋倍數(shù)800～1 500 倍)全株噴霧處理，連續(xù)施藥2 次，間隔7～10 d，且對油茶樹安全。