蘆瑞霞，林文勇，靳琪鵬，王肖龍

摘要目的：研究靈寶護心丹改善動脈粥樣硬化的療效和潛在作用機制。方法：C57BL/6小鼠喂以正常飲食，載脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠喂養(yǎng)高脂飲食誘導動脈粥樣硬化模型，12周后隨機分為模型組、靈寶護心丹低劑量組、靈寶護心丹中劑量組、靈寶護心丹高劑量組和他汀組。給予藥物8周后，檢測血清總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平；通過油紅O染色、Masson染色、蘇木素-伊紅（HE）染色觀察主動脈根部的病理變化。通過轉錄組學測序分析靈寶護心丹減輕動脈粥樣硬化的機制。結果：與模型組相比，靈寶護心丹組的斑塊及TC、TG、LDL-C水平明顯降低，斑塊的膠原面積明顯增多，炎性細胞浸潤減少。轉錄組學測序結果顯示，靈寶護心丹組和模型組相比篩選出733個差異基因，富集到的通路包括脂肪酸生物合成、膠原蛋白形成、炎癥信號通路等。結論：靈寶護心丹對動脈粥樣硬化有顯著改善作用，機制可能涉及脂質代謝和炎癥反應的關鍵通路。

關鍵詞動脈粥樣硬化；靈寶護心丹；轉錄組學；血脂；實驗研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.08.008

Transcriptomic Mechanism of Lingbao Huxin Pill for the Treatment of Atherosclerosis

LU Ruixia， LIN Wenyong， JIN Qipeng， WANG Xiaolong

Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai 201203， China

Corresponding AuthorWANG Xiaolong， E-mail： wxlqy0214@163.com

AbstractObjective：To study the therapeutic effect and potential mechanism of Lingbao Huxin? Pill? in improving atherosclerosis.Methods：C57BL/6 mice were fed with normal diet，and apolipoprotein E gene knockout（ApoE-/-） mice were fed with high-fat diet to induce the atherosclerosis model.After 12 weeks，the mice were randomly divided into model group，Lingbao Huxin Pill? low-dose group，Lingbao Huxin Pill medium-dose group，Lingbao Huxin? Pill? high-dose group and statin group.After 8 weeks of administration，the levels of serum total cholesterol（TC），triglyceride（TG），low density lipoprotein cholesterol（LDL-C） and high density lipoprotein cholesterol（HDL-C） were detected.The pathological changes of aortic root were detected by oil red O staining，Masson staining and hematoxylin-eosin（HE） staining.The mechanism of alleviating atherosclerosis of Lingbao Huxin Pill? was analyzed by transcriptomic sequencing.Result：Compared with model group，the levels of plaque，TC，TG and LDL-C in the Lingbao Huxin? Pill? groups significantly decreased，the collagen area of plaque was significantly cells increased，and inflammatory infiltration was decreased.Transcriptomic sequencing results showed that compared with the model group，733 differential genes were screened out in the Lingbao Huxin? Pill? groups and the pathways enriched included fatty acid biosynthesis，collagen formation，and inflammation signaling pathways.Conclusion：Lingbao Huxin Pill? could significantly improve atherosclerosis，and the mechanism might involve the key pathways of lipid metabolism and inflammatory response.

Keywordsatherosclerosis; Lingbao Huxin Pill; transcriptomics; lipids; experimental study

JAMA Cardiology雜志2019年發(fā)表了中國心血管疾病負擔統(tǒng)計結果，心血管疾病導致的死亡人數(shù)從1990年的251萬人增加到2016年的397萬人，缺血性心臟疾病是心血管疾病死亡的前三大原因之一，死亡率增長了184.1%［1］。根據(jù)2021年發(fā)表在Nature雜志的評論［2］，動脈粥樣硬化現(xiàn)已成為全球性的挑戰(zhàn)，其普遍性和越發(fā)年輕化的趨勢導致動脈粥樣硬化性心血管疾病成為全球死亡原因的主要貢獻者。盡管目前的治療策略在控制低密度脂蛋白、血壓以及其他傳統(tǒng)危險因素方面取得了顯著成效，但動脈粥樣硬化性心血管疾病的殘余風險仍然顯著。因此，迫切需要推動其綜合管理策略的發(fā)展，并致力于開發(fā)新的治療手段以減輕其對公共健康的負擔。

靈寶護心丹由人工麝香、蟾酥、人工牛黃、冰片、紅參、三七、琥珀、丹參和蘇合香共9味中藥組成，收錄在《中華人民共和國藥典》［3］，臨床研究已證實其在治療冠心病等方面療效明顯［4］。本課題組前期研究顯示，靈寶護心丹的臨床療效較顯著，具有改善血脂的功效。動脈粥樣硬化是冠心病的病理基礎，但是關于靈寶護心丹減輕動脈粥樣硬化的具體作用機制，目前的研究證據(jù)還不充足。

轉錄組學在揭示中藥治療疾病的分子機制方面發(fā)揮著重要作用。通過精確測定疾病狀態(tài)下的基因表達水平，能夠定位中藥治療過程中調控發(fā)生變化的關鍵基因和生物通路，獲得深入的生物學見解［5］。王瑩等［6］的轉錄組學研究表明，毛冬青三萜皂苷緩解脂多糖引發(fā)的小鼠腸道損傷可能與調節(jié)腸道IgA免疫及TRP通道的炎癥反應有關。因此，本研究旨在運用轉錄組學測序技術，篩選出關鍵基因和調控途徑，深化對靈寶護心丹改善動脈粥樣硬化分子機制的理解。

1材料與方法

1.1動物

無特定病原體（SPF）級野生型C57BL/6小鼠5只，基于C57BL/6小鼠背景進行載脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）的小鼠25只，體質量19～23 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。動物在上海中醫(yī)藥大學動物實驗中心SPF屏障系統(tǒng)內飼養(yǎng)，動物使用許可證號：SYXK（滬）2020-0009。適應性喂養(yǎng)1周，濕度40%～60%，環(huán)境溫度20～25 ℃，自由飲食，每日12 h光照維持，晝夜循環(huán)。

1.2藥品與試劑

靈寶護心丹（國藥準字Z32021181）購自蘇州雷允上藥業(yè)集團有限公司；阿托伐他汀鈣片（立普妥，國藥準字J20130129）購自美國輝瑞公司；無水乙醇、二甲苯、中性樹膠、異丙醇購自國藥集團化學試劑有限公司；環(huán)保型脫蠟液、通用型組織固定液、蘇木素-伊紅（HE）染液套裝、Masson染液套裝、分化液、油紅染液均購自Servicebio公司。

1.3儀器

NanoDrop 2000分光光度計（Thermo Scientific，USA）；VAHTS Universal V5 RNA-seq Library Prep試劑盒；Pannoramic MIDI組織切片數(shù)字掃描儀（3DHISTECH）；Chemray 240全自動生化分析儀（深圳雷杜生命科技有限公司）；Donatello脫水機（DIAPATH）；JB-P5包埋機（武漢俊杰電子有限公司）；RM2016病理切片機（上海徠卡儀器有限公司）；KD-P組織攤片機（浙江省金華市科迪儀器設備有限公司）；GFL-230烤箱（天津市萊玻瑞儀器設備有限公司）；CRYOSTAR NX50冰凍切片機（賽默飛世爾科技有限公司）；NIKON ECLIPSE E100正置光學顯微鏡（日本尼康）。

1.4動物分組與給藥

ApoE-/-小鼠高脂飼料喂養(yǎng)12周后，隨機分為模型組、靈寶護心丹低劑量組［4.68 mg/（kg·d）］、靈寶護心丹中劑量組［9.36 mg/（kg·d）］、靈寶護心丹高劑量組［18.72 mg/（kg·d）］和他汀組［2.4 mg/（kg·d）］，每組5只，連續(xù)8周，給藥同時維持高脂飲食。另外，將C57BL/6小鼠5只作為空白組，普通飼料喂養(yǎng)20周。模型組和空白組給予等體積生理鹽水。

1.5血脂檢測

第20周末，小鼠眼球取血，室溫靜置2 h后，3 000 r/min離心10 min，吸取上層血清，采用全自動生化儀檢測血清總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平。

1.6主動脈根部病理染色

將小鼠四肢固定于操作板上，打開胸腔和腹腔，剪右心房，灌流針插入心尖，灌流磷酸緩沖鹽溶液，直至肝臟顏色變淺、肺組織變白后結束。將小鼠心臟置于4%多聚甲醛固定24 h，最佳切割溫度化合物（optimal cutting temperature compound，OCT）冰凍包埋，固定于冰凍過切片機，以8～10 μm的厚度進行切片，進行油紅O染色、HE染色和Masson染色。用光學顯微鏡觀察切片，并使用成像系統(tǒng)拍照，用Image J軟件對斑塊面積進行測量。

1.7轉錄組學文庫的構建及測序

為了研究靈寶護心丹對動脈粥樣硬化的影響，從空白組、模型組及靈寶護心丹最佳劑量組小鼠各隨機選取3只，收集主動脈組織樣本，并委托上海歐易生物醫(yī)學科技有限公司進行核糖核酸（RNA）提取及轉錄組學序列分析。通過QIAGEN RNeasy Lipid Tissue Mini Kit 從主動脈組織樣本中提取總RNA，使用NanoDrop 2000分光光度計鑒定RNA純度和定量，使用Agilent 2100 Bioanalyzer評估RNA完整性。依據(jù)VAHTS Universal V5 RNA-seq Library Prep試劑盒說明書構建轉錄組文庫。采用 llumina Novaseq 6000 測序平臺對文庫進行測序，并生成150 bp 雙端讀段（reads）。采用fastp軟件［7］對 fastq格式的原始測序序列進行處理，從3′端及5′端去除低質量測序序列后進行后續(xù)數(shù)據(jù)分析。使用 HISAT2軟件［8］進行參考基因組比對，并進行基因表達量計算，再通過HTSeq-count［9］獲得每個基因的測序序列計數(shù)。使用每百萬片段數(shù)每千堿基外顯子的片段數(shù)（fragments per kb per million reads，F(xiàn)PKM）法估算基因表達水平。

1.8轉錄組學分析

利用DESeq2［10］軟件對所有樣本基因的數(shù)目進行標準化處理，計算差異倍數(shù)，并采用負二項分布檢驗的方式進行差異顯著性檢驗，首先對每個基因進行P值計算，再用假發(fā)現(xiàn)率錯誤控制法對P值作多重假設檢驗矯正得到q值，最終將q＜0.05且差異倍數(shù)大于2的基因定義為差異表達基因（DEGs）。

基于超幾何分布算法對靈寶護心丹組和模型組的DEGs進行基因本體（gene ontology，GO）［11］、京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）［12］、Reactome［13］和 WikiPathways［14］富集分析。其中GO富集分析包含生物學過程（biological process，BP）、細胞組分（cellular component）和分子功能（molecular function，MF）。

1.9統(tǒng)計學處理

采用GraphPad Prism（版本9.4.1）進行統(tǒng)計分析和繪圖。符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，應用單因素方差分析（one-way analysis of variance，ANOVA）進行多組間比較；采用Tukey多重比較測試作為后續(xù)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1靈寶護心丹對高脂飼料喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠動脈粥樣斑塊的影響

空白組小鼠的主動脈壁結構分界清晰，內皮層完整，細胞排列規(guī)整，核染色均勻，沒有炎癥細胞浸潤或其他病理改變，內皮下區(qū)域未見明顯的脂質積累，膠原纖維分布正常。模型組小鼠的主動脈竇內皮下可見大量炎性細胞浸潤和泡沫細胞堆積，細胞排列不規(guī)整，斑塊區(qū)域內膠原纖維增加。與模型組相比，靈寶護心丹中劑量組、靈寶護心丹高劑量組和他汀組的炎癥細胞浸潤明顯減少，血管內皮的結構部分恢復，泡沫細胞減少，斑塊區(qū)域脂質沉積明顯減少，膠原纖維含量在斑塊區(qū)域增加。表明靈寶護心丹可以減緩動脈粥樣硬化進程，減少炎癥細胞和泡沫細胞浸潤，有助于斑塊穩(wěn)定，改善病理狀態(tài)。詳見圖1。

2.2靈寶護心丹對ApoE-/-小鼠血清脂質水平的調節(jié)作用

與空白組相比，模型組小鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C的水平均顯著升高。與模型組相比，靈寶護心丹在不同劑量下TC、TG和LDL-C水平均有效降低，但靈寶護心丹低劑量組改善程度較弱，靈寶護心丹中劑量組和高劑量組的降脂效果與他汀組相似。靈寶護心丹低劑量不能明顯提升HDL-C水平，而靈寶護心丹中劑量和高劑量能夠提高HDL-C水平。說明靈寶護心丹在調節(jié)血脂方面具有顯著的療效。詳見圖2。

2.3轉錄組學測序數(shù)據(jù)的基因表達水平

根據(jù)靈寶護心丹不同劑量組小鼠血脂水平和主動脈竇斑塊面積的研究結果顯示，靈寶護心丹中劑量組和高劑量組在改善動脈粥樣硬化方面的效果差異無統(tǒng)計學意義?？紤]到從經濟學角度評估療效與成本之間的關系，選取靈寶護心丹中劑量組為最佳劑量組進行后續(xù)的機制研究是更為合理的選擇。在不影響治療效果的前提下，避免了不必要的藥物過量。所以從空白組、模型組和靈寶護心丹中劑量組各隨機選取了3個主動脈組織進行轉錄組學測序分析。質量檢測結果顯示（見表1），各樣本的有效數(shù)據(jù)量分布在5.97～7.01 G，測序質量分數(shù)達到或超過30（Q30）的堿基分布在92.78%～92.98%，平均鳥嘌呤和胞嘧啶（GC）含量為47.53%。通過將reads比對到參考基因組上，得到各樣本的基因組比對情況，比對率為97.75%～98.69%。這反映了測序數(shù)據(jù)與參考基因組的高度一致性，為本研究提供了可靠的基礎數(shù)據(jù)。

2.4DEGs分析

與空白組相比，模型組上調基因964個、下調基因337個，共有1 301個DEGs，說明動脈粥樣硬化疾病條件下會發(fā)生廣泛的基因表達變化。與模型組相比，靈寶護心丹組上調基因426個、下調基因307個，共有733個DEGs（見圖3）。其中靈寶護心丹回調了部分小鼠動脈粥樣硬化后主動脈組織的DEGs，說明靈寶護心丹在一定程度上改善了模型組中誘發(fā)的基因表達異常［15］。詳見圖4。

2.5GO富集分析

模型組和空白組的DEGs富集的GO通路結果提示，MF過程包括細胞外基質結構成分、膠原蛋白結合、鈣離子結合等；CC類別包括細胞外區(qū)、細胞外空間、細胞外基質、質膜等；BP包括炎癥反應、細胞黏附、先天免疫反應等。靈寶護心丹組和模型組的DEGs進行的GO富集結果提示，MF包括鈣離子結合、細胞外基質結構成分、蛋白質結合；CC類別包括細胞外區(qū)、細胞外基質、肌漿網、突觸、基底膜等；BP過程包括肌節(jié)組織、心肌收縮、心率調節(jié)等。詳見圖5。

2.6KEGG富集分析

模型組和空白組的DEGs富集的KEGG通路包括趨化因子信號通路、脂質與動脈粥樣硬化、膽固醇代謝、脂肪的消化和吸收、花生四烯酸代謝等；靈寶護心丹和模型組的DEGs富集的KEGG結果包括心肌收縮、檸檬酸循環(huán)、脂肪酸生物合成、丙氨酸代謝等通路。詳見圖6。

2.7Reactome 富集分析

模型組和空白組的DEG富集的Reactome通路包括細胞外基質組織、先天免疫系統(tǒng)、中性粒細胞脫顆粒、膠原蛋白形成、彈性纖維形成、整合素細胞表面相互作用、免疫系統(tǒng)、細胞外基質的降解等生物過程。靈寶護心丹組和模型組的DEGs富集的Reactome通路包括膠原蛋白形成、細胞外基質的降解、脂肪酰輔酶A生物合成、膠原纖維的交聯(lián)等生物過程。詳見圖7。

2.8WikiPathways 富集分析

模型組和空白組的DEGs富集的WikiPathways通路包括補體激活、類二十烷酸脂質合成、氧化損傷反應、炎癥反應途徑等。靈寶護心丹組和模型組的DEGs富集的WikiPathways通路包括脂肪酸生物合成、氧化應激反應、心肌細胞中的鈣調節(jié)、心臟發(fā)育、炎癥反應途徑等。詳見圖8。

3討論

動脈粥樣硬化是一種以脂質堆積和慢性炎癥為特征的動脈疾病。本研究結果總體揭示了靈寶護心丹對高脂飼料喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化方面的影響。通過對主動脈竇油紅O染色、Masson染色、HE染色和血脂水平的檢測，發(fā)現(xiàn)靈寶護心丹不僅減少了斑塊區(qū)域的炎癥細胞浸潤和泡沫細胞堆積，增加斑塊內膠原纖維面積，而且能夠降低血清TC、TG和LDL-C，同時提高HDL-C。增加的纖維帽厚度有助于防止斑塊破裂，從而減少心血管事件的風險［16］。

轉錄組學結果提示靈寶護心丹可以回調差異基因的水平，如腺苷三磷酸檸檬酸裂解酶（adenosine triphosphate citrate lyase，ACLY）、白細胞介素36γ（interleukin 36 gamma，IL-36γ）、神經調節(jié)素1（neuregulin 1，NRG1）、鈣黏蛋白（calreticulin，CALR）等。IL-36γ通過磷酸肌醇3-激酶（PI3K）途徑特異性上調巨噬細胞清除率受體的表達，加重巨噬細胞泡沫細胞的形成和動脈粥樣硬化的進展［17］。NRG1可調節(jié)心臟炎癥、氧化應激、壞死凋亡等［18］。非凋亡調節(jié)的細胞死亡蛋白CALR可能在動脈粥樣硬化的沉默進化中發(fā)揮關鍵作用，并可能具有尚未開發(fā)的治療潛力［19-20］。ACLY是他汀類藥物靶點3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（3 hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase，HMGCR）上游的關鍵酶，連接碳水化合物和脂質代謝，通過將檸檬酸轉化為乙酰輔酶A，參與脂肪酸和膽固醇的生物合成［21］。

本研究結果顯示，靈寶護心丹組與模型組的差異基因在WikiPathways富集到的PI3K-AKT-mTOR信號通路和炎癥反應途徑，在Reactome富集到的膠原蛋白生物合成和修飾酶、膠原蛋白形成、細胞外基質的降解、膠原蛋白降解通路，在KEGG富集到的低氧誘導因子1（hypoxia-inducible factor 1，HIF-1）信號通路、脂肪酸延伸、轉化生長因子-β（transforming growth factor beta，TGF-β）信號通路、趨化因子信號通路、不飽和脂肪酸的生物合成通路，在模型組與空白組差異基因富集的疾病通路中也存在，說明靈寶護心丹可以通過調節(jié)這些途徑來發(fā)揮改善動脈粥樣硬化的作用。脂肪酸合成與動脈粥樣硬化之間的關系復雜多變，不飽和脂肪酸在動脈粥樣硬化相關的巨噬細胞功能調節(jié)中發(fā)揮核心作用。他們不僅作為前列腺素、白三烯等生物活性分子的前體，而且作為磷脂的組成部分，調節(jié)細胞膜的流動性和細胞過程，在動脈粥樣硬化中的巨噬細胞功能中也扮演重要角色［22］。TGF-β信號通路是動脈粥樣硬化相關血管炎癥的主要驅動因素之一，通過促進血管壁炎癥和血管通透性加速動脈粥樣硬化進展［23］。PI3K-蛋白激酶B（AKT）通路能夠促進動脈血栓形成，抑制巨噬細胞排出，促進脂質沉積［24-26］。靈寶護心丹通過這些通路的調節(jié)可能對動脈粥樣硬化的治療具有潛在的益處。

4小結

靈寶護心丹對高脂飼料喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠模型的動脈粥樣硬化具有顯著改善效果，包括減少主動脈斑塊的炎癥細胞浸潤、降低血脂水平，并增加斑塊內膠原纖維含量。通過對脂肪酸代謝途徑、炎癥反應途徑和膠原纖維形成等相關通路的調節(jié)，靈寶護心丹展現(xiàn)了其潛在的治療動脈粥樣硬化的可能性。這些發(fā)現(xiàn)為靈寶護心丹在心血管疾病治療領域的應用提供了科學依據(jù)。

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（收稿日期：2023-12-01）

（本文編輯王雅潔）