腰果CBF基因家族的鑒定及響應(yīng)冷脅迫的表達(dá)模式

崔恒久 曾教科 李雯 黃海杰 彭世清 郭冬 蒲金基 周永凱 李輝亮

關(guān)鍵詞：腰果；低溫響應(yīng)；CBF 轉(zhuǎn)錄因子；基因家族；qRT-PCR

植物生長(zhǎng)受多種環(huán)境因素的控制，其中溫度是重要的因素之一[1]。低溫脅迫會(huì)影響甚至破壞細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡，導(dǎo)致植物生長(zhǎng)發(fā)育受到嚴(yán)重影響[2]。C-repeat binding factor（CBF）轉(zhuǎn)錄因子，也叫做dehydration responsive element binding factor1蛋白（DREB1 蛋白）[3-4]，在響應(yīng)低溫脅迫中起重要作用，冷應(yīng)答途徑是植物感受低溫信號(hào)重要的調(diào)控途徑之一。ICE-CBF-COR 是被研究最透徹的一條通路。植物對(duì)低溫等非生物脅迫抗性的提高與脯氨酸、可溶性糖等物質(zhì)的積累密不可分，而相關(guān)物質(zhì)的積累需要下游基因的激活表達(dá)。下游基因的激活表達(dá)需要CBF 轉(zhuǎn)錄激活因子與下游COR 基因啟動(dòng)子中的DRE/CRT （C-repeat/dehydration responsiveelement）順式作用元件特異性結(jié)合[5-8]。

CBF轉(zhuǎn)錄因子屬于Apetala2/Ethylene responsivefactor 基因家族（AP2/ERF 基因家族），AP2/ERF由AP2 亞家族、ERF 亞家族和RAV 亞家族組成。目前，CBF 基因家族已經(jīng)在多種植物中得以研究，擬南芥（Arabidopsis thaliana）研究表明，擬南芥基因組中含有6 個(gè)CBF 基因[9]。此外，CBF/DREB1轉(zhuǎn)錄因子還存在于其他植物中，如番茄[10-13]、水稻[14-20]、大豆[21-25]等。CBF/DREB1 轉(zhuǎn)錄因子具有高度保守的AP2/ERF 結(jié)構(gòu)域。AP2/ERF 結(jié)構(gòu)域含約60 個(gè)氨基酸[26]。

腰果（Anacardium occidentalie Linn）被譽(yù)為世界四大著名堅(jiān)果之一。是典型的熱帶果樹，原產(chǎn)地在巴西東北部地區(qū)，16 世紀(jì)被引入亞洲、非洲以及南美洲的熱帶國(guó)家和地區(qū)[27]。栽培的緯度范圍在北緯20°和南緯20°之間，但主要分布在15°以內(nèi)地區(qū)。我國(guó)腰果種植主要集中在云南、海南等地。

腰果仁有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，用途十分廣泛，可作為甜品、點(diǎn)心、菜肴的原材料。副產(chǎn)品主要有果梨、果殼液等，果殼液被作為重要的工業(yè)原料被大量使用，果梨可以食用，用在果酒、果醬、腌菜等[28]。因此，種植腰果可以帶來很大的經(jīng)濟(jì)效益、社會(huì)效益和生態(tài)效益。在中國(guó)熱帶地區(qū)脫貧攻堅(jiān)和鄉(xiāng)村振興中起到重要作用。腰果對(duì)低溫比較敏感，當(dāng)溫度低于15 ℃時(shí)生長(zhǎng)緩慢，在8 ℃時(shí)受到嚴(yán)重傷害，此前，海南等地的腰果因低溫受災(zāi)嚴(yán)重。目前，對(duì)腰果的研究主要集中在生理層面，對(duì)于分子層面的研究較少?？鼓婊蛞呀?jīng)在許多物種中進(jìn)行了挖掘和應(yīng)用，本研究將腰果作為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)腰果的CBF 基因家族進(jìn)行相關(guān)生物信息學(xué)分析，分離鑒定得到AoCBF 基因，為后續(xù)深入開展腰果耐寒性研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

將保存于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院種質(zhì)庫的腰果種質(zhì)資源CJSX 作為實(shí)驗(yàn)材料。通過篩選得到有活力的種子，將篩選的種子進(jìn)行催芽，長(zhǎng)出真葉后移栽至育苗盤中，在溫度為25 ℃，16 h 光照，2800 lx 的環(huán)境下生長(zhǎng)。生長(zhǎng)到6 片真葉時(shí)，移栽至人工氣候屋，保持光照條件不變，對(duì)照溫度25 ℃（CK）不變，溫度分別調(diào)至8 ℃、16 ℃，2個(gè)溫度下處理時(shí)間為6 h、24 h，共4 個(gè)處理（T1：8 ℃ 6 h，T2：8 ℃ 24 h，T3：16 ℃ 6 h，T4：16 ℃24 h）。將低溫處理過的腰果葉片采摘，液氮處理，送公司進(jìn)行Illumina 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1.2 方法

1.2.1 腰果CBF 基因家族的鑒定和分析 在擬南芥資源網(wǎng)站TAIR（https：//www.arabidopsis.org/）上獲取相關(guān)AtCBFs 蛋白序列。將得到的AtCBFs蛋白序列進(jìn)行本地BLAST 分析， 相關(guān)參數(shù)E_value 設(shè)置為10e–50；蛋白的篩選標(biāo)準(zhǔn)為identity≥60%，align_ratio≥60%。將蛋白是否含有AP2結(jié)構(gòu)域作為重要的判斷依據(jù)，使用NCBI-CDD 數(shù)據(jù)庫與Pfam_scan 軟件進(jìn)行驗(yàn)證，由此得到具有AP2 結(jié)構(gòu)域的候選腰果CBF 基因。利用在線軟件Expasy（ https：//web.expasy.org/protparam/）分析腰果AoCBF 蛋白序列，對(duì)每個(gè)AoCBF 蛋白的等電點(diǎn)、長(zhǎng)度、相對(duì)分子質(zhì)量進(jìn)行預(yù)測(cè)[29]。使用Cell-PLoc 2.0（http：//www. csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）在線軟件對(duì)候選的腰果CBF 基因進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)[30]。

1.2.2 AoCBF 蛋白保守結(jié)構(gòu)域和保守基序（motif）分析 對(duì)每個(gè)AoCBF 氨基酸序列使用MEGA-X軟件進(jìn)行比對(duì)，使用MEME 在線軟件（https：//meme-suite.org/meme/）對(duì)AoCBF 蛋白保守結(jié)構(gòu)域?qū)M(jìn)行分析。對(duì)相關(guān)AoCBF 蛋白的保守基序進(jìn)行分析[31]，設(shè)置為5 個(gè)基序，設(shè)置基序?yàn)?0～200個(gè)氨基酸長(zhǎng)度，其他參數(shù)均為默認(rèn)值。使用SWISS軟件對(duì)AoCBF 蛋白進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)[26]。

1.2.3 AoCBF 蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析為了進(jìn)一步研究腰果和擬南芥之間的進(jìn)化關(guān)系，將6 個(gè)AoCBF 蛋白和6 個(gè)AtCBF 蛋白采取Neighborjoining（NJ）法在MEGA-X 軟件上構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[24]，Bootstrp method 參數(shù)值設(shè)為1000。

1.2.4 AoCBF 基因上游序列的順式作用元件分析從 JGI（https：//phytozome-next.jgi.doe.gov/info/Aoccidentalev0_9）網(wǎng)站上獲取AoCBF 基因上游2000 bp 的序列，利用PlantCARE 軟件對(duì)其進(jìn)行順式作用元件預(yù)測(cè)分析[32]。

1.2.5 AoCBFs 在冷脅迫下的表達(dá)模式 用TBtools（v1.082）軟件提取轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中腰果CBF 基因家族的CDS 序列，并通過IDT（https：//sg.idtdna.com/pages）在線網(wǎng)站進(jìn)行引物設(shè)計(jì)（表1）。使用多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒（成都福際生物技術(shù)有限公司）按照說明書從每個(gè)樣品中提取總RNA，并對(duì)其濃度和純度進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示A260/A280 和A260/A230 的參數(shù)均在2.0 左右，表明RNA 無明顯的DNA 和蛋白污染，此外，通過瓊脂糖電泳也檢測(cè)RNA 的完整性。隨后通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（蘇州莫納生物科技有限公司）按照說明書合成cDNA 第一鏈并檢測(cè)其濃度，稀釋后備用。并使用2–ΔΔCT 方法計(jì)算每個(gè)AoCBFs 的最終相對(duì)表達(dá)水平。使用GraphPad Prism 8 軟件制圖，每個(gè)處理3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 腰果CBF 基因家族成員的鑒定和分析

用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫和6 個(gè)已知的擬南芥AtCBFs序列進(jìn)行本地BLAST 分析，共得到15 個(gè)注釋的DREB 基因。經(jīng)過結(jié)構(gòu)域分析，鑒定出11 個(gè)腰果CBF 基因。設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，獲得6 條腰果序列（AoCBF1～AoCBF6）。

理化性質(zhì)分析結(jié)果顯示，AoCBFs 編碼的氨基酸序列存在較大差異，預(yù)測(cè)蛋白的長(zhǎng)度為189～334 aa，最長(zhǎng)的為AoCBF1，最短的為AoCBF4。蛋白分子量介于21.31～37.89 kDa 之間；6 個(gè)AoCBFs全部呈酸性，其理論等電點(diǎn)（pI）介于4.93～5.79之間。通過亞細(xì)胞定位分析得出所有AoCBFs 都有核定位信號(hào)（表2）。

2.2 AoCBF 蛋白保守基序分析

保守基序（motif）預(yù)測(cè)結(jié)果表明（圖1），AoCBFs 含有5 個(gè)保守motifs。motif 1、motif 2存在所有AoCBFs 中，表明2 個(gè)基序高度保守。AoCBF1只包含motif1、motif2，AoCBF2、 AoCBF3、AoCBF4、AoCBF5、AoCBF6 包含motif1、motif2、motif3、motif5，原因可能是串聯(lián)重復(fù)過程中堿基丟失造成的。對(duì)上述保守基序檢測(cè)發(fā)現(xiàn)motif 1 含有AP2 結(jié)構(gòu)域。根據(jù)其在結(jié)構(gòu)上有所不同，推測(cè)不同AoCBF 在功能上存在一定差異。

2.3 腰果和擬南芥CBF 蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹分析

將6 個(gè)AoCBFs 氨基酸序列和6 個(gè)AtCBFs氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果顯示，上述CBF氨基酸序列可分成A、B 兩個(gè)亞家族。AoCBFs在A 組有1 個(gè)，B 組有5 個(gè)。AtCBFs 在A 組有2個(gè)，B 組有6 個(gè)（圖2）。

2.4 AoCBFs 三維結(jié)構(gòu)及序列特征分析

6 個(gè)AoCBF 蛋白序列相似性在46%～58%之間。一段長(zhǎng)度為60 個(gè)氨基酸左右較為保守的序列在N 段被發(fā)現(xiàn)，軟件預(yù)測(cè)其為CBF 蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（圖3）。AoCBFs 的identity 最高為AoCBF4 和AoCBF6。最高的同源性為58.21%。對(duì)AoCBFs 進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)建模分析，1 個(gè)α-螺旋和2 個(gè)β-折疊構(gòu)成AoCBFs 的三維結(jié)構(gòu)。

2.5 AoCBFs 上游序列的順式作用元件分析

利用PlantCARE 軟件注釋AoCBFs 基因上游2000 bp 啟動(dòng)子區(qū)域序列，在其上游發(fā)現(xiàn)了參與激素反應(yīng)的相關(guān)順式作用元件（茉莉酸甲酯、脫落酸、赤霉素、生長(zhǎng)素、水楊酸有關(guān)的順式作用元件）、參與低溫、干旱和高鹽誘導(dǎo)脅迫相關(guān)的響應(yīng)元件、光響應(yīng)元件。此外，普遍存在于啟動(dòng)子與增強(qiáng)子區(qū)的核心元件、生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)調(diào)控順式作用元件也被發(fā)現(xiàn)。結(jié)果表明，AoCBF 基因在抵御非生物脅迫、生長(zhǎng)發(fā)育、激素調(diào)控中發(fā)揮重要作用（表3）。

2.6 AoCBFs 在冷脅迫下的表達(dá)模式

為了探明AoCBFs 在冷脅迫下的表達(dá)模式，對(duì)AoCBFs 進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析。結(jié)果表明，經(jīng)8 ℃和16 ℃低溫誘導(dǎo)處理6 h 和24 h 后，除了AoCBF5 在8 ℃時(shí)相對(duì)表達(dá)量變化較少，在16 ℃表達(dá)變化較大，其他基因在8 ℃的表達(dá)量均顯著升高。表明AoCBF 基因參與響應(yīng)冷脅迫相關(guān)生物學(xué)過程（圖4）。

3 討論

腰果是典型的熱帶果樹，對(duì)低溫極敏感。主要在我國(guó)熱區(qū)的海南、云南等地種植。但是近年來冬季寒潮頻發(fā)，溫度降低使腰果受到冷害的問題愈加嚴(yán)重。植物中CBF 家族在面對(duì)低溫時(shí)發(fā)揮調(diào)控作用，減少低溫對(duì)植株的損傷。因此，本課題組對(duì)腰果CBF 家族進(jìn)行生物信息學(xué)分析，以期發(fā)現(xiàn)腰果CBF 基因在低溫脅迫下的調(diào)控機(jī)制。

本研究共鑒定獲得6 個(gè)AoCBF 基因。并對(duì)其理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位、系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹、蛋白三維結(jié)構(gòu)、順式作用元件以及對(duì)低溫脅迫下的表達(dá)方式進(jìn)行研究。由于AoCBFs 的等電點(diǎn)為4.93～5.79，蛋白呈酸性，故在酸性亞細(xì)胞環(huán)境下，AoCBF 蛋白可能會(huì)發(fā)揮作用。AoCBFs 可以分為2 個(gè)亞族：AoCBF1 為A 族，AoCBF2、AoCBF3、AoCBF4、AoCBF5、AoCBF6 為B 族。而B 族中AoCBF3、AoCBF4 具有更高親緣性，AoCBF2、AoCBF5、AoCBF6 可能具有類似的調(diào)控方式。

目前CBF 基因在十字花科植物、禾本科植物、豆科植物、漆樹科植物、茄科植物中均有研究。最早是STOCKINGER 等[33]在模式植物擬南芥中克隆得到相關(guān)CBF 基因。擬南芥的6 個(gè)家族成員，受外源ABA 誘導(dǎo)的有CBF1、CBF2 和CBF3。CBF1 和CBF3 的表達(dá)受CBF2 的負(fù)調(diào)控。CBF4不能響應(yīng)低溫脅迫誘導(dǎo)但是能夠響應(yīng)干旱和ABA誘導(dǎo)[34]。DREB1E 和DREB1F 均可以受高鹽脅迫誘導(dǎo)。本研究在6 個(gè)AoCBFs 啟動(dòng)子上不僅篩選到響應(yīng)低溫誘導(dǎo)、干旱誘導(dǎo)、光響應(yīng)元件有關(guān)的順式作用元件，而且篩選到與茉莉酸、生長(zhǎng)素、水楊酸、脫落酸、赤霉素等激素有關(guān)的順式作用元件。后續(xù)可開展分子對(duì)激素和冷信號(hào)調(diào)控的相關(guān)機(jī)制。

AoCBF 基因家族6 個(gè)成員均不存在內(nèi)含子，所以AoCBF 基因?yàn)閮?nèi)含子缺失型。內(nèi)含子缺失型基因在面對(duì)脅迫時(shí)，可通過減少轉(zhuǎn)錄處理的方法提高轉(zhuǎn)錄本積累的效率[35]。

本研究發(fā)現(xiàn)，腰果經(jīng)過冷脅迫處理后，6 個(gè)AoCBF 基因均對(duì)低溫產(chǎn)生響應(yīng)，除了AoCBF1、AoCBF3、AoCBF4、AoCBF5 在16 ℃表達(dá)顯量著提高，其余的基因均在8 ℃時(shí)表達(dá)量顯著提高。

相較于傳統(tǒng)的雜交育種、誘變育種等方式，基因工程技術(shù)有高效率、短周期、提高植物抗逆性等優(yōu)勢(shì)?？蒲泄ぷ髡呖梢岳没蚩寺〖夹g(shù)、基因重組技術(shù)、轉(zhuǎn)基因技術(shù)等基因工程技術(shù)提升植物抵御低溫脅迫的能力。本研究通過對(duì)AoCBF基因家族進(jìn)行生物信息學(xué)分析，分析AoCBF 基因在低溫脅迫下的調(diào)控機(jī)制，為未來的腰果抗性分子輔助育種研究工作奠定基礎(chǔ)。