姜昱雯　陳滿靜　趙應(yīng)　任艷　周棱波　沈佳奇　邵明波

摘要：在高等植物中，SQUAMOSA Promocer Binding Procein-Box（SBP）普遍參與植物的生長(zhǎng)、開花調(diào)控及細(xì)胞程序性死亡等過程。本研究對(duì)高粱（Sorghum bicolor L.）SBP轉(zhuǎn)錄因子家族進(jìn)行鑒定并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，同時(shí)利用qRT-PCR對(duì)高粱SBP基因在PEG-6000模擬干旱脅迫下的表達(dá)進(jìn)行分析，以驗(yàn)證其功能。結(jié)果表明，從高粱中共鑒定出19個(gè)SBP成員，除第8條染色體外，其他9條染色體上均分布有SBP基因：絕大部分SBP蛋白在亞細(xì)胞水平定位于細(xì)胞核，且均為親水性蛋白質(zhì)。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，與水稻類似，這19個(gè)高粱SBP基因也可分為3個(gè)亞類，分別含有7、5、7個(gè)SBP基因：相比于擬南芥，高粱SBP與水稻、玉米的SBP關(guān)系更近。啟動(dòng)子順式作用元件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，高粱SBP可能參與了脫落酸、茉莉酸甲酯信號(hào)通路，部分成員可能與植物的低溫響應(yīng)、晝夜節(jié)律調(diào)控有關(guān)。qRT-PCR分析結(jié)果顯示，高粱SBP基因的表達(dá)具有組織特異性，有17個(gè)基因受干旱脅迫誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，且隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)存在差異化表達(dá)模式。本研究結(jié)果可為后續(xù)研究高粱SBP基因的功能提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：高粱；SBP基因家族；生物信息學(xué)分析；基因表達(dá)；干旱脅迫

中圖分類號(hào)：S514：Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2024）03-0001-10

轉(zhuǎn)錄因子是生物體中分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分，控制著植物生長(zhǎng)發(fā)育、脅迫響應(yīng)等一系列生物學(xué)過程，不同的轉(zhuǎn)錄因子家族結(jié)合的下游基因啟動(dòng)子基序存在顯著差別。SQUAMOSA romoter Binding Protein-Box（SBP）是一類植物特異性的轉(zhuǎn)錄因子家族，因其成員含有高度保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域SBP而得名。SBP保守結(jié)構(gòu)域由約76個(gè)氨基酸殘基組成，參與下游基因啟動(dòng)子DNA的GTAC核心基序結(jié)合及細(xì)胞核定位，并有兩個(gè)典型的鋅指結(jié)構(gòu)。SBP家族成員于1996年首次在金魚草（Antirrhinum majus）中鑒定獲得，即AmSBP1與AmSBP2，且研究發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)SBP成員可以直接結(jié)合到花分生相關(guān)基因SQUA-MOSA的啟動(dòng)子上調(diào)控基因表達(dá)。其后在多個(gè)物種中鑒定到SBP家族成員，如藍(lán)莓（Vacciniumspp.）、甜根子草（Saccharum spontaneum L.）、黑胡椒（Piper nigrum L.）、擬南芥（Arabidopsis thali-ana）及水稻（Oryza sativa）等，其功能涉及到植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、防御響應(yīng)、花和果實(shí)發(fā)育及相變過程等。如在模式植物擬南芥中共鑒定到16個(gè)SBP家族成員，其中，SPL3、SPA和SPL5是開花調(diào)控基因LEAFY、FRUITFUL和APETALA1的上游調(diào)控子，三者功能冗余，共同調(diào)控?cái)M南芥的花發(fā)育過程：SPL9和SPL15是植物間隔期和分枝的調(diào)控子。在黑胡椒中共鑒定到34個(gè)SBP成員，其中17個(gè)成員上發(fā)現(xiàn)有MiR156的結(jié)合位點(diǎn)。水稻中共鑒定到19個(gè)SBP成員，其中SPL14控制著水稻分蘗，SPL16可以調(diào)控水稻籽粒性狀和質(zhì)量。

高粱（Sorghum bicolor L.）是禾本科高粱屬一年生草本植物，是世界第五大禾谷類作物，同時(shí)也是極為重要的旱糧作物，被廣泛應(yīng)用于釀酒、食用、飼料、制糖及淀粉制造等方面，具有很高的應(yīng)用價(jià)值。2009年高粱全基因組測(cè)序完成，推動(dòng)了其生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控關(guān)鍵基因家族鑒定工作的開展。另外，全球氣候的極端變化也使得生物基因家族的鑒定及功能研究變得尤為重要。高粱具有較強(qiáng)的抗旱性，挖掘其抗旱基因?qū)涌炱淇购涤N進(jìn)程、提高產(chǎn)量具有重要意義。本研究對(duì)高粱SBP基因家族進(jìn)行鑒定，并基于基本理化性質(zhì)分析、系統(tǒng)發(fā)育分析、蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)及啟動(dòng)子基序預(yù)測(cè)等對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，同時(shí)利用qRT-PCR分析其在高粱不同組織中及在干旱脅迫不同時(shí)間下的表達(dá)模式，以期為后續(xù)深入研究SBP轉(zhuǎn)錄因子家族在高粱生長(zhǎng)發(fā)育過程中的功能并篩選出優(yōu)良基因奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品處理

受試高粱種子購(gòu)白紅纓子農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司。2023年10月將種子播于營(yíng)養(yǎng)豐富的土壤基質(zhì)中進(jìn)行光照恒溫培養(yǎng)，溫度為23℃。待幼苗長(zhǎng)出4-5片葉時(shí)進(jìn)行干旱脅迫處理，即將幼苗根部直接浸在10%的PEG-6000溶液中，分別于處理0、4、12、18、24、36h采集樣品，并置于液氮中速凍后保存于-80℃冰箱。

1.2 數(shù)據(jù)來源

擬南芥的SBP基因下載于TAIR（https：／／ww.arabidopsis.org/），水稻和高粱的SBP家族成員從PlantTFDB（http：//planttfdb.cbi.pku.edu.cn/）網(wǎng)站獲得。高粱基因組、mRNA、蛋白組及相應(yīng)的GFF文件來自于Phytozome（http：//phyto-zome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）數(shù)據(jù)庫。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 高粱SBP家族成員鑒定

通過NCBI（ht-tps：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）的Blast功能，利用擬南芥16個(gè)SBP成員的氨基酸序列在高粱蛋白組中進(jìn)行序列預(yù)測(cè)（E value≤10-5），獲得SBP候選蛋白序列，再通過NCBI的保守結(jié)構(gòu)域分析功能及pfam（http：//pfam.xfam.org/）網(wǎng)站檢測(cè)序列中是否存在SBP結(jié)構(gòu)域。通過TBtools軟件提取高粱SBP成員的CDS、啟動(dòng)子序列，方便后續(xù)分析。

1.3.2 SBP家族系統(tǒng)發(fā)育分析

獲得擬南芥、水稻、玉米及高粱的SBP氨基酸序列后，利用MEGA軟件使用鄰接法（Neighbor-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap設(shè)置為1000，構(gòu)建好的系統(tǒng)發(fā)育樹使用Figtree軟件進(jìn)行優(yōu)化。另用高粱的19個(gè)SBP家族成員構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap設(shè)置為1000。

1.3.3 高粱.SBP基因染色體定位

使用TBtools工具箱中的Gene Location Visualize from GFT/CFF工具，按照操作指示，分別導(dǎo)入高粱基因組的GFF文件和.SBP基因的ID信息，獲得染色體定位圖片，并用Photoshop軟件進(jìn)行美化調(diào)整。

1.3.4 高粱SBP成員的理化性質(zhì)分析

在Prot-Param（http：//us.expasy.0rg/tools/protparam.html）網(wǎng)站上對(duì)高粱SBP成員的氨基酸序列長(zhǎng)度、等電點(diǎn)、帶負(fù)電荷殘基數(shù)、帶正電荷殘基數(shù)、不穩(wěn)定指數(shù)、脂肪族氨基酸指數(shù)和平均疏水性進(jìn)行預(yù)測(cè)，并利用PSORT（http：//psort.hgc.jp/）對(duì)其進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。

1.3.5 高粱SBP基因啟動(dòng)子順式作用元件分析

利用TBtools提取SBP基因的2000bp啟動(dòng)子序列，然后以fasta格式導(dǎo)入Plantcare（http：／／bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/ht-ml/）網(wǎng)站分析潛在的順式作用元件，并統(tǒng)計(jì)各基序在.SBP啟動(dòng)子上的分布。

1.3.6 SBP基因家族共線性分析

利用TBtools軟件分析高粱與擬南芥.SBP基因在染色體上的分布和共線性關(guān)系并作圖，使用Adobe IllustratorCS5軟件對(duì)圖片進(jìn)行優(yōu)化。

1.3.7 總RNA的提取和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）分析

用TIANCEN RNA Easy Fast植物組織RNA快速提取試劑盒提取總RNA，用TIAN-GEN FastKingCDNA第一鏈合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄為CDNA，-20℃保存?zhèn)溆谩Ｓ肞remier 5.0設(shè)計(jì)qRT-PCR引物（表1），以SbACTIN為內(nèi)參基因。PCR反應(yīng)體系10μL：2xSYBRGreen5μL，上、下游引物各0.2μL，cDNA 0.5μL，ddH20 4.1μL。qRT-PCR程序：95℃30s;95℃Ss，58℃25s，72℃18s，循環(huán)40次：95℃Ss，650C1min。用2-△△Ct法進(jìn)行基因表達(dá)量計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 高粱SBP家族成員的鑒定

利用已發(fā)表的16個(gè)擬南芥SBP成員的氨基酸序列在Phytozome網(wǎng)站進(jìn)行BLASTP序列比對(duì)，共獲得21個(gè)高粱候選SBP基因。進(jìn)一步通過Pfam和NCBI在線網(wǎng)站分析獲得基因的蛋白結(jié)構(gòu)域，去除不含SBP結(jié)構(gòu)域的序列，最終得到19個(gè)高粱SBP家族成員（表2、圖1）。

理化性質(zhì)分析（表2）發(fā)現(xiàn)，高粱SBP家族成員的氨基酸序列長(zhǎng)度差異較大，最短的僅218aa，最長(zhǎng)的為SORBI_3007G207000，達(dá)1119aa。預(yù)測(cè)等電點(diǎn)差異也較為明顯，其中酸性蛋白較少，僅有3條，堿性蛋白有16條，表明高粱SBP蛋白多為堿性蛋白。不穩(wěn)定指數(shù)小于40的蛋白僅有SOR-BI_3010G254200，穩(wěn)定性較高，其余蛋白的穩(wěn)定性均較低。所有高粱SBP成員的平均疏水性均為負(fù)數(shù)，表明SBP蛋白都是親水蛋白。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，除SORBI_3007G207000外，其余蛋白均定位在細(xì)胞核中，這可能與SBP轉(zhuǎn)錄因子行使功能有關(guān)。

蛋白結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果（圖1）表明，所有高粱SBP成員的氨基酸序列上均含有典型的SBP結(jié)構(gòu)域，包括兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)和核定位信號(hào)。此外，SORBI_3001G026500、SORBI_3003G139900、SOR_BI_3007G207000及SORBI_3009G135000的氨基酸序列羧基端包含一個(gè)Ank_2 superfamily結(jié)構(gòu)域，暗示著他們可能有一些共同的特殊功能。

2.2 高粱SBP家族系統(tǒng)發(fā)育分析

用擬南芥（16個(gè)）、水稻（19個(gè)）、玉米（28個(gè)）及高粱（19個(gè)）的SBP成員氨基酸序列，通過MEGA進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果將所有SBP大致分為3個(gè)亞類（圖2），這與在水稻中的研究結(jié)果類似。每個(gè)亞類均包含水稻、擬南芥、玉米和高粱的SBP成員，表明SBP家族的分化在物種分化前即已形成。從進(jìn)化枝上看，相對(duì)于擬南芥，高粱與水稻、玉米的SBP家族進(jìn)化關(guān)系更為接近。

高粱的SBP成員也分為3類，分別含有7、5、7個(gè)SBP成員（圖3）。DNA結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，在系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系上比較靠近的基因，其外顯子和內(nèi)含子分布結(jié)構(gòu)更為相似，如SORBI_3006G247700、SORBI_3004C062100和SORBI_3010C215700均包含3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子；SORBI_3001G026500、SORBI_3003G139900和SORBI_3007G207000分別含有10、10個(gè)和9個(gè)內(nèi)含子。

2.3 高粱SBP家族成員的染色體定位分析

對(duì)高粱SBP基因的染色體定位分析發(fā)現(xiàn)，除第8條染色體外，其余9條染色體上均分布有SBP基因（圖4）。其中，2號(hào)染色體上分布有4個(gè)SBP基因，數(shù)量最多，且表現(xiàn)出聚類分布的情況，兩兩聚在一起：4號(hào)和7號(hào)染色體上均分布有3個(gè)SBP基因，3、6、10號(hào)染色體上均有2個(gè)SBP基因，1、5、9號(hào)染色體上均僅有一個(gè).SBP基因。

對(duì)高粱染色體的基因密度及其與擬南芥的共線性分析結(jié)果（圖5）顯示，高粱與擬南芥間存在61對(duì)共線性關(guān)系，并且高粱的SBP基因在染色體上主要位于基因高密度區(qū)域，表明SBP基因在高粱染色體上呈熱點(diǎn)區(qū)域分布。

2.4 高粱SBP家族基因的啟動(dòng)子基序分析

為了解高粱SBP基因可能參與的生物學(xué)過程，對(duì)19個(gè)成員轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2000bp的啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行順式作用元件預(yù)測(cè)，結(jié)果（表3）顯示，高粱SBP基因啟動(dòng)子區(qū)擁有豐富的順式作用元件，主要包含有脫落酸響應(yīng)元件、厭氧誘導(dǎo)響應(yīng)元件、茉莉酸甲酯響應(yīng)元件、光響應(yīng)元件、低溫響應(yīng)元件、MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)及晝夜節(jié)律調(diào)控位點(diǎn)等。這些順式作用元件的存在暗示著SBP基因廣泛參與了高粱的生物學(xué)過程。如除SORBI_3004G036900和SORBI_3002C312200外，其余17個(gè)成員啟動(dòng)子上均包含有脫落酸響應(yīng)的ABRE結(jié)合基序，暗示著高粱SBP家族可能普遍參與了其干旱響應(yīng)過程：茉莉酸甲酯響應(yīng)元件TGACG在SORBI_300IG026500等15個(gè)成員啟動(dòng)子上均有分布，表明這些基因可能受到茉莉酸甲酯的誘導(dǎo)：此外，光響應(yīng)元件G-box、MyB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)等在高粱SBP基因啟動(dòng)子上的分布也較為普遍。推測(cè)高粱SBP家族可能參與了植物響應(yīng)干旱、光和低溫等多種生物學(xué)過程。

2.5 高粱SBP家族基因的表達(dá)模式分析

為進(jìn)一步研究高粱SBP基因的潛在功能，對(duì)19個(gè)SBP基因在高粱幼苗全株、葉、根、莖和花／種子中的表達(dá)模式進(jìn)行了分析。通過Phytozome網(wǎng)站獲得各個(gè)成員的組織表達(dá)量，并利用TBtools軟件構(gòu)建組織表達(dá)熱圖。結(jié)果（圖6A）發(fā)現(xiàn)，各基因在高粱幼苗不同組織中的表達(dá)量存在明顯差異，其中SORBI_3003G139900、SORBI_3007G207000、SORBI_300IG026500和SORBI_3009G135000在各組織中的表達(dá)量均最高，而SORBI_3006C171000、SORBI_3004G062100和SORBI_3010G215700在各組織中的表達(dá)豐度均較低。其中，SORBI_3003G139900、SORBI_3007G207000、SORBI_300IG026500等在莖中的表達(dá)量最高，SORBI_3007G193500在花／種子中的表達(dá)量最高，SORBI_3002G312200和SORBI_3002G312300在根中的表達(dá)量最低。表明這些SBP基因在高粱生長(zhǎng)發(fā)育過程中發(fā)揮的功能具有差異性。

此外，本研究選取啟動(dòng)子區(qū)含有脫落酸響應(yīng)元件ABRE的17個(gè)SBP基因檢測(cè)其在干旱脅迫下的表達(dá)模式，結(jié)果（圖6B）發(fā)現(xiàn)，這17個(gè)基因在干旱處理一段時(shí)間后，均呈現(xiàn)出表達(dá)量上調(diào)的趨勢(shì)，暗示SBP家族基因參與高梁響應(yīng)下旱脅迫的積極作用。其中SORBI_300IG026500、SORBI_3003G139900、SORBI_3004G058900、SORBI_3004_062100、SORBI_3005G120600、SORBI_3006G24770和SORBI_3009G135000均在干旱處理24h表達(dá)量最高，而SORBI_3010G254200、SORBI_3010G215700、SORBI_3002G247800、SOR-BI_3006G171000和SORBI_3007G210200在干旱處理36h表達(dá)量才達(dá)到最高。此外，SORBI_3010G254200和SORBI_3007G193500在干旱誘導(dǎo)初期先表現(xiàn)出抑制下調(diào)，隨后才逐漸上調(diào)表達(dá)?？梢?，高粱的SBP家族成員隨干旱脅迫時(shí)問的延長(zhǎng)呈現(xiàn)出差異化的表達(dá)模式，暗示著其在響應(yīng)干旱脅迫時(shí)可能有著不同的功能。

3 討論與結(jié)論

作為植物特有的轉(zhuǎn)錄因子家族，當(dāng)前的研究認(rèn)為SBP家族參與了植物體內(nèi)多種生物學(xué)過程，不僅參與了植物的生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控，而且在植物響應(yīng)逆境脅迫過程中發(fā)揮著重要作用。因此，開發(fā)植物SBP家族基因并進(jìn)行功能研究具有重要意義。

不同物種的SBP基因數(shù)量存在顯著差異，如矮牽牛（Petunia axillari.s）中有21個(gè)SBP基因，梅花（Prunus mume）中有15個(gè)SBP基因，白梨（Pyrus bretschneideri）中有32個(gè).SBP基因。本研究從高粱中鑒定出l9個(gè).SBP家族基因，與水稻的SBP基因數(shù)量相當(dāng)，多于擬南芥，少于玉米。SBP基因數(shù)量的變化可能與物種的進(jìn)化歷史及環(huán)境選擇相關(guān)。

本研究結(jié)果表明，高粱SBP基因的氨基酸序列均包含有典型且高度保守的SBP結(jié)構(gòu)域，與在其他物種中的結(jié)果一致：部分基因的氨基酸序列羧基端包含一個(gè)Ank_2 superfamily結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域?yàn)殄^蛋白重復(fù)序列，但其在SBP行使功能過程中發(fā)揮的作用還未知。

系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，高粱、擬南芥、水稻、玉米的SBP家族成員可分為3個(gè)亞枝，并且每個(gè)亞枝中均含有這4個(gè)物種的SBP成員，表明SBP家族在單子葉和雙子葉植物分化前即已擴(kuò)張為3個(gè)亞枝，這與之前的研究結(jié)果一致。此外，高粱與水稻、玉米的SBP基因具有更近的進(jìn)化關(guān)系，且同一進(jìn)化枝的SBP直系同源基因可能具有類似功能。從系統(tǒng)發(fā)育樹還可看出，擬南芥的SBP家族擁有更多的旁系同源基因?qū)?，如AT1 G20980.J與AT2CA7070.1，AT1G53160.1與AT3C15270.1等，表明在單雙子葉物種分化后，高粱與擬南芥^SBP基因經(jīng)歷了不同的物種特異性基因復(fù)制或丟失事件。

有報(bào)道表明，SBP基因在植物響應(yīng)非生物脅迫如干旱、鹽脅迫等過程中發(fā)揮重要功能。如白樺（Betula platyphylla Suk.）SBP家族成員SPL9會(huì)受到鹽和PEG-6000的誘導(dǎo)表達(dá)，擬南芥異源轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)SP/9通過清除活性氧提高植物對(duì)鹽旱的耐受性：中國(guó)野生葡萄（Vitis）的SBP16在擬南芥中表達(dá)后通過調(diào)控SOS和ROS信號(hào)通路提高植株的干旱和鹽抗性：水稻miR156k通過降低靶基因SPL3、SPL14和SPL17的表達(dá)減弱其抗冷性：玉米的部分SBP家族基因會(huì)受到干旱、冷、鹽等的誘導(dǎo)表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，高粱19個(gè)SBP成員中有17個(gè)含有ABRE脫落酸響應(yīng)元件，進(jìn)一步的qRT-PCR檢測(cè)顯示，這17個(gè)基因受到干旱脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)，但隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)的表達(dá)模式存在差異，結(jié)合這些基因在高粱不同組織中的差異化表達(dá)，推測(cè)它們可能在高梁響應(yīng)干旱過程中發(fā)揮著不同的功能，這為后續(xù)探究SBP基因在高粱生長(zhǎng)發(fā)育及非生物脅迫響應(yīng)方面的作用機(jī)制奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

基金項(xiàng)目：貴州省科技計(jì)劃項(xiàng)目（黔科合基礎(chǔ)-ZK[2023]一般169）；貴州省基層農(nóng)技推廣項(xiàng)目（仁懷基地示范[2301]01號(hào)）；貴 州省科技成果應(yīng)用及產(chǎn)業(yè)計(jì)劃項(xiàng)目（黔科中引地[2022]4045）