馮立娟　李英朋　王傳增　尹燕雷　郭琳　譚偉

摘要：蔗糖磷酸合成酶（SPS）和蔗糖轉(zhuǎn)化酶（INV）是蔗糖代謝的關(guān)鍵調(diào)控酶，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起重要作用。本研究利用生物信息學(xué)和熒光定量PCR等分子手段，鑒定石榴SPS和INV基因家族成員，分析其理化性質(zhì)、保守結(jié)構(gòu)域、保守基序、二級(jí)結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞定位、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系和表達(dá)模式。結(jié)果表明，從石榴基因組中鑒定出4個(gè)SPS基因和11個(gè)INV基因，其編碼蛋白均為不穩(wěn)定蛋白，具有典型的保守結(jié)構(gòu)域，家族成員間特征motif數(shù)量和種類(lèi)大致相同，蛋白結(jié)構(gòu)高度保守：這些蛋白不均勻地分布在染色體上，均定位于葉綠體中，二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲組成。石榴SPS和INV基因家族成員間存在不同程度的親緣關(guān)系，與巨桉同源性較高；不同SPS和INV基因在石榴果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)模式存在差異，PgINV3在9月15日（果實(shí)增大期）表達(dá)水平最高，顯著高于其他時(shí)期。本研究結(jié)果對(duì)解析石榴果實(shí)中蔗糖代謝的分子機(jī)理具有重要意義。

關(guān)鍵詞：石榴：SPS基因：INV基因：生物信息學(xué)分析：基因表達(dá)

中圖分類(lèi)號(hào)：S665.4：Q781 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2024）03-0011-08

石榴（Punica granatum L）是我國(guó)重要的特色果樹(shù)之一，果實(shí)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，保健功能強(qiáng)，越來(lái)越受到消費(fèi)者青睞。山東石榴栽培歷史悠久，種質(zhì)資源豐富，發(fā)展面積日益增加，成為山東省打造鄉(xiāng)村振興齊魯樣板的良好選擇。果實(shí)品質(zhì)提升是提高石榴市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力的重要途徑。蔗糖積累是決定石榴果實(shí)風(fēng)味和品質(zhì)的重要因子，在其生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量形成過(guò)程中起重要作用。研究石榴果實(shí)蔗糖代謝機(jī)理對(duì)其果實(shí)品質(zhì)調(diào)控具有重要的理論意義。

蔗糖磷酸合成酶（sucrose phosphate synthase，SPS）催化尿苷二磷酸葡糖（UDPG）和果糖-6-磷酸（F6P）生成蔗糖-6-磷酸（S6P），S6P在蔗糖磷酸酯酶（SPP）作用下不可逆形成蔗糖。SPS是植物體內(nèi)控制蔗糖合成的關(guān)鍵酶，由多基因家族編碼，在不同物種中的成員數(shù)量不同，且同一物種中不同家族成員調(diào)控蔗糖合成的能力也不相同。目前已在柑橘和甜櫻桃中鑒定出4個(gè)SPS基因，在蘋(píng)果和梨中鑒定出8個(gè)SPS基因。蔗糖轉(zhuǎn)化酶（invertase，INV）不可逆地催化蔗糖裂解為果糖和葡萄糖，分為酸性細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶（CWIN），酸性液泡轉(zhuǎn)化酶（VIN）和堿性／中性轉(zhuǎn)化酶（A/N-Inv）。在草莓中鑒定出8個(gè)Fa，A/N-Inv基因家族成員，其中4個(gè)不僅具有組織特異性，還具有果實(shí)發(fā)育階段特異性和品種特異性表達(dá)特點(diǎn)，受細(xì)胞分裂素、赤霉素和生長(zhǎng)素誘導(dǎo)。過(guò)表達(dá)SoSPS1基因可提高轉(zhuǎn)基因甘蔗葉片的SPS活性和蔗糖含量，提高可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶（SAI）活性及葡萄糖和果糖水平。

目前，國(guó)內(nèi)外在石榴蔗糖代謝方面的研究甚少，SPS和INV基因家族成員鑒定與表達(dá)方面的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究基于全基因組測(cè)序結(jié)果對(duì)石榴SPS和INV基因家族成員進(jìn)行鑒定，分析其理化性質(zhì)、保守結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系等生物信息學(xué)特性，并解析其在果實(shí)發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)模式，以期為深入研究石榴果實(shí)蔗糖積累的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 石榴SPS和INV基因家族成員鑒定

從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載PgSPS和PgINV蛋白序列，與石榴全基因組（ASM765513v2）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源比對(duì)，初步獲得SPS和INV候選序列。通過(guò)Pfam在線數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//pfam.xfam.org）進(jìn)行進(jìn)一步的蔗糖合成結(jié)構(gòu)域（PF00862）、糖基轉(zhuǎn)移結(jié)構(gòu)域（PF00534）和蔗糖-6-磷酸磷酸水解酶結(jié)構(gòu)域（PF05116）驗(yàn)證。利用SMART（http：／／smart.embl-heidelberg.de）進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)域分析，去除結(jié)構(gòu)不完整的序列，最終確定目的基因。

1.2 石榴SPS和INV基因家族成員生物信息學(xué)分析

利用在線軟件ProtParam預(yù)測(cè)石榴SPS和INV蛋白分子量、等電點(diǎn)、脂肪系數(shù)等理化性質(zhì)。利用CDD和MEME軟件分析保守結(jié)構(gòu)域和保守基序。利用SOPMA和Plant-mPLoc軟件預(yù)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞定位。

1.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

使用MEGA6.0軟件，采用NJ法（neighbor-joining）對(duì)石榴、蘋(píng)果、葡萄和巨桉的SPS和INV蛋白進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建。Bootstrap值設(shè)為1000，去除Bootstrap支持率低于50%的節(jié)點(diǎn)，顯示各分支長(zhǎng)度。

1.4 熒光定量表達(dá)分析

2022年7月15日開(kāi)始采集‘泰山紅石榴果實(shí)，分別在7月30日、8月15日、8月30日、9月15日、9月30日采1次，直至果實(shí)成熟（10月15日）。利用RNA prep Pure Plant Kit試劑盒提取籽?？俁NA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用SYBR GreenPCR Master Mix試劑盒、利用BIO-RAD IQ5實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行qRT-PCR分析。每個(gè)樣品設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)。采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物（表1）。以石榴Actin（GU376750.1）為內(nèi)參，默認(rèn)條件下讀取Ct值，相對(duì)表達(dá)量用2-△△Ct法計(jì)算。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

利用Microsoft Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及作圖，用SPSS 19.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 石榴SPS和INV基因家族成員鑒定

從石榴中鑒定出4個(gè)SPS基因和11個(gè)INV基因，分別命筆為PgSPS1-PgSPS4和PgINV1-PgINV11（表2）。通過(guò)分析蛋白理化性質(zhì)可知，4個(gè)SPS蛋白的氨基酸數(shù)量在1029-1067之間，相對(duì)分子量在114816.80-119337.14 Da范圍內(nèi)：等電點(diǎn)在6.26-6.72之間，均在酸性范圍內(nèi)：脂肪系數(shù)在84.87-87.92之間，不穩(wěn)定系數(shù)在42.60-49.65范圍內(nèi)，均為不穩(wěn)定蛋白。11個(gè)INV家族成員的氨基酸數(shù)量在531-679范圍內(nèi)，等電點(diǎn)在5.62-7.58之間：脂肪系數(shù)為79.48-94.80.不穩(wěn)定系數(shù)介于43.62-55.16之間，也均為不穩(wěn)定蛋白。

2.2 石榴SPS和INV蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析

PgSPS1、PgSP52和PgSPS3蛋白屬于PLN00142超級(jí)家族成員，其中PgSPSI和PgSP53包含糖基轉(zhuǎn)移酶（Clycos_transf_1）保守結(jié)構(gòu)域，PgSPS2含GlycosVltransferase_GT保守結(jié)構(gòu)域；Pg-SPS4也含有Glycos_transf_1保守結(jié)構(gòu)域（圖1）。

PgINV5和PgINV10含有Glyco_hydro_100糖基水解酶結(jié)構(gòu)域。除PgINV5外，其余10個(gè)INV蛋白均含有GDB1結(jié)構(gòu)域。

2.3 石榴SPS和INV蛋白保守基序分析

由圖2可見(jiàn)，4個(gè)SPS家族成員的保守基序數(shù)量均為7，且均為Motif2、Motif9、Motif11、Mo-tif12、Motif13、Motif14和Motif15基序。11個(gè)INV家族成員均包含12個(gè)保守基序，分別為Motif1、Motif2、Motif3、Motif4、Motif5、Motif6、Motif7、Mo-tif8、Motif9、Motif10、Motif11和Motif12。同一基因家族成員間的保守基序數(shù)量和種類(lèi)大致相同。

2.4 石榴SPS和INV各成員蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)與亞細(xì)胞定位

又表3可見(jiàn)，石榴SPS和INV蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、延伸鏈和無(wú)規(guī)則卷曲組成，以α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲占比較高；其中，Pg-SPS3及PgINV1、PgINV2、PgINV6、PgINV7、Pg-INVII各組分占比表現(xiàn)為無(wú)規(guī)則卷曲>α-螺旋>延伸鏈>β-轉(zhuǎn)角，其他蛋白則均表現(xiàn)為α-螺旋>無(wú)規(guī)則卷曲>延伸鏈>β-轉(zhuǎn)角。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)表明，石榴SPS和INV家族成員均定位于葉綠體中。

染色體分布顯示，pgSPS1和PgSPS2位于Chr1，其余兩個(gè)SPS基因位于Chr2。PgINV1、PgINV6、Pg-INV10、PgINV11位于Chr1，PgINV4和PgINV5位于Chr4，PgINV7和PgINV8位于Chr6，PgINV2、PgINV3和PgINV9分別位于Chr2、Chr3和Chr7。

2.5 石榴SPS和INV基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

用4個(gè)石榴SPS蛋白、5個(gè)巨桉SPS蛋白、9個(gè)蘋(píng)果SPS蛋白和10個(gè)葡萄SPS蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖3A），可分為兩大類(lèi)。PgSPS1、PgSP52和PgSPS4聚為一類(lèi)，其中PgSPS1和Pg-SPS2聚為一小類(lèi)。PgSPS3則與EgSPS2、MdSPS2和MsSPS2聚為一類(lèi)，親緣關(guān)系較近。

11個(gè)石榴INV蛋白、9個(gè)巨桉INV蛋白、7個(gè)蘋(píng)果INV蛋白和10個(gè)葡萄INV蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)如圖3B所示，也主要分為兩大類(lèi)。在第一大類(lèi)中，PgINV2、PgINV7和PgINV8聚為一類(lèi)，其中PgINV2與EgINV2聚為一小類(lèi)，PgINV7和Pg-INV8聚為一小類(lèi)：PgINV6、PgINV10和PgINV11聚為一類(lèi)，其中PgINV6與EgINV5親緣關(guān)系較近，PgINV10和PgINV11緣關(guān)系較近。在第二大類(lèi)中，PgINV1與EgINV4聚為一類(lèi)，PgINV3與PgINV5親緣關(guān)系較近。PgINV4與PgINV9聚為一類(lèi)，其中PgINV4與EgINV3、EgINV6聚為一小類(lèi)，PgINV9與EgINV8親緣關(guān)系較近。

2.6 PgSPSs和PgINVs基因表達(dá)分析

本研究選用2個(gè)SPS基因（PgSPS2和PgASPS4）、6個(gè)INV基因（PgINV2、PgINV3、Pg-INV4、PgINV7、PgINV9、PgINV11），均以7月15日的表達(dá)量為1，分析其在石榴果實(shí)發(fā)育期的表達(dá)模式，結(jié)果（圖4）顯示，兩個(gè)SPS基因均下調(diào)表達(dá)，但隨著石榴果實(shí)發(fā)育進(jìn)程的推進(jìn)，其變化趨勢(shì)存在差異，PgSP52表現(xiàn)為降→升→降→升→降→升的較規(guī)律波動(dòng)變化，PgSPS4則表現(xiàn)為降→升→降→升，均以9月15日的表達(dá)水平較高。PgINV2整體下調(diào)表達(dá)，隨著生育進(jìn)程的推進(jìn)呈先降低后升高的變化趨勢(shì)；PgINV3在7月30日、9月15日和10月15日上調(diào)表達(dá)，以9月15日的相對(duì)表達(dá)量最高，8月30日的相對(duì)表達(dá)量最低；PgINV4、PgINV7和PgINV9在石榴果實(shí)發(fā)育期間的表達(dá)水平較低，除PgINV7在8月15日下調(diào)表達(dá)較少外，其余時(shí)期均明顯下調(diào)表達(dá)：PgINV11的變化趨勢(shì)與PgINV3相似，但僅在9月15日明顯上調(diào)表達(dá)。

3 討論與結(jié)論

蔗糖是植物體內(nèi)光合產(chǎn)物從“源器官”運(yùn)輸?shù)健皫?kù)器官”的主要形式，是影響產(chǎn)量和果實(shí)品質(zhì)形成的重要因素。SPS和INV是蔗糖代謝的關(guān)鍵調(diào)控酶，影響植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的生物量形成和糖分積累。本研究從石榴中鑒定出4個(gè)SPS基因，其編碼蛋白均為不穩(wěn)定的酸性蛋白，與柑橘和甜櫻桃中的數(shù)量一致：鑒定出11個(gè)INV基因家族成員，均為不穩(wěn)定蛋白，數(shù)量少于無(wú)籽蜜柚而多于草莓。

通過(guò)對(duì)蛋白保守結(jié)構(gòu)域和保守基序分析發(fā)現(xiàn)，石榴SPS和INV蛋白均具有典型的保守結(jié)構(gòu)域，家族成員間特征motif數(shù)量和種類(lèi)大致相同，蛋白結(jié)構(gòu)高度保守，這表明石榴SPS和INV基因家族在進(jìn)化上具有保守性，這與蘋(píng)果和獼猴桃上的研究結(jié)果一致。其中，PgINV5和Pg-INV10具有中堿性蔗糖轉(zhuǎn)化酶典型的Glyco_hydro_100糖基水解酶結(jié)構(gòu)域，等電點(diǎn)分別為6.30和6.53，有可能是中堿性蔗糖轉(zhuǎn)化酶，這與黑皮果蔗和南瓜中的研究結(jié)果相似。

蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)與空間結(jié)構(gòu)分析對(duì)了解其功能具有重要意義。石榴SPS和INV蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲組成，延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角所占比例較低，說(shuō)明α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲在石榴SPS和INV蛋白結(jié)構(gòu)中起重要作用，這與甘蔗中的研究結(jié)果相似。本研究發(fā)現(xiàn)，石榴SPS和INV家族成員不均勻地分布在染色體上，均定位于葉綠體中，其精確定位和調(diào)控功能還需深入研究。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明，石榴SPS和INV基因家族成員間存在不同程度的親緣關(guān)系，石榴與巨桉、蘋(píng)果的SPS基因家族成員同源性較高，與巨桉的INV基因家族成員同源性較高。這進(jìn)一步證實(shí)了石榴與巨桉的親緣關(guān)系較近，為深入研究石榴SPS和INV基因家族成員的生物學(xué)功能奠定了理論基礎(chǔ)。

本研究進(jìn)一步對(duì)2個(gè)SPS基因和6個(gè)INV基因在石榴果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)模式進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)其在不同時(shí)期的表達(dá)量存在差異。在9月15日（果實(shí)增大期），PgSPS2和PgSPS4的相對(duì)表達(dá)量較高，PgINV3和PgINV11的相對(duì)表達(dá)量顯著高于其他時(shí)期。說(shuō)明石榴SP^S和INV基因家族不同成員調(diào)控蔗糖代謝的功能具有特異性，這與甘蔗和萱草中的研究結(jié)果一致。

綜上，不同SPS和INV基因調(diào)控石榴果實(shí)蔗糖代謝的機(jī)理存在差異，具有發(fā)育時(shí)期表達(dá)特異性，后續(xù)將從轉(zhuǎn)錄調(diào)控、功能鑒定、蛋白互作等方面深入研究石榴SPS、INV基因家族成員調(diào)控蔗糖代謝的分子機(jī)理。

基金項(xiàng)目：棗莊學(xué)院山東省石榴精深加工工程技術(shù)研究中心／山東省石榴資源綜合開(kāi)發(fā)工程實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題（SLKF2021001）；山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2022TZXD009）；山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程項(xiàng)目（CXGC2023A12）；山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院揭榜科技難題項(xiàng)目（SHJB2022-42）