陳瑩 張春渝 許小瓊 林玉玲 賴鐘雄

收稿日期：2024-01-05

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31572088）；福建省高原學(xué)科建設(shè)經(jīng)費(fèi)（102/71201801101）；福建農(nóng)林大學(xué)科技創(chuàng)新專項(xiàng)基金

項(xiàng)目（KFA19037A）

作者簡(jiǎn)介：*為通訊作者，賴鐘雄（1966-），男，研究員，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事園藝植物的生物技術(shù)與遺傳資源研究，E-mail：

Laizx01@163.com。陳瑩（2003-），女，從事果樹(shù)生物技術(shù)研究，E-mail：863445312@qq.com

4種無(wú)患子科植物的SMXL家族全基因組鑒定、進(jìn)化

及DlSMXLs在龍眼體胚發(fā)生過(guò)程中的表達(dá)分析

陳? ? 瑩，張春渝，許小瓊，林玉玲，賴鐘雄*

（福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所，福建福州? ?350002）

摘要：【目的】為研究無(wú)患子科SMXL家族的生物學(xué)特性提供理論參考，深入探究該基因家族在無(wú)患子科植物非生物脅迫響應(yīng)中的調(diào)控機(jī)制?！痉椒ā炕谀Ｊ街参飻M南芥SMXL家族的氨基酸序列，利用TBtools對(duì)龍眼、紅毛丹、無(wú)患子和荔枝的SMXL家族成員進(jìn)行全基因組鑒定，Expasy、MEGA11等軟件用于4種無(wú)患子科植物的進(jìn)化和功能分析，同時(shí)利用龍眼轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行體胚發(fā)生早期階段的表達(dá)分析?！窘Y(jié)果】4種無(wú)患子科植物共鑒定出48個(gè)SMXL家族成員，其中龍眼11個(gè)、紅毛丹11個(gè)、無(wú)患子9個(gè)以及荔枝17個(gè)。依據(jù)擬南芥SMXL家族成員的分類，將4種無(wú)患子科SMXL家族成員分為5個(gè)亞族且亞細(xì)胞定位于葉綠體、細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)或線粒體。蛋白互作分析表明，無(wú)患子科SMXL家族成員可能與多種蛋白存在互作關(guān)系，主要分為兩類：一種是與受到非生物脅迫時(shí)大量表達(dá)的熱休克蛋白（HSPs）或CLPs互作；另一種是與獨(dú)角金內(nèi)酯受體蛋白D14、karrikins受體蛋白KAI2和調(diào)控SL信號(hào)傳導(dǎo)途徑的蛋白MAX2進(jìn)行互作。啟動(dòng)子順式作用元件分析表明，4種無(wú)患子科植物SMXL家族成員存在較多的光響應(yīng)元件、抗氧化反應(yīng)元件（ARE）和脫落酸響應(yīng)元件（ABRE）等，推測(cè)該基因家族廣泛參與非生物脅迫響應(yīng)。此外，DlSMXL家族成員在龍眼體胚發(fā)生早期存在5種不同的表達(dá)模式，其中DlSMXL4基因家族成員在胚性愈傷組織（EC）、不完全胚性緊實(shí)結(jié)構(gòu)（ICpEC）和球形胚（GE）階段相較其他成員呈現(xiàn)較高表達(dá)?；?-氮胞苷、PEG、SL、光、溫度和各種激素處理龍眼EC時(shí)期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析可知，龍眼DlSMXL5在干旱、GR24、黑暗和高溫處理下表達(dá)量均明顯增加，推測(cè)該成員能夠通過(guò)響應(yīng)植物激素和應(yīng)激脅迫維持胚性愈傷組織形態(tài)。其次DlSMXL8在5-氮胞苷處理時(shí)表達(dá)上調(diào)，推測(cè)其可能參與DNA甲基化在龍眼體胚發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮作用。【結(jié)論】4種無(wú)患子科植物SUPPRESSOR OF MAX2-LIKE（SMXL）家族除了在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程種發(fā)揮重要的作用，同時(shí)還廣泛參與植物非生物脅迫調(diào)控過(guò)程。本研究結(jié)果為無(wú)患子科植物中SMXL的分類和生物學(xué)功能提供了理論依據(jù)，并為SMXL在龍眼早期體細(xì)胞胚胎發(fā)生中的功能驗(yàn)證提供了更好的認(rèn)識(shí)。

關(guān)鍵詞：無(wú)患子科；SMXL基因家族；全基因組鑒定；進(jìn)化分析；龍眼早期表達(dá)分析

中圖分類號(hào)：S667? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文章編號(hào)：2095-5774（2024）01-0017-13

Genome-wide Identification and Evolutionary Analysis of the SMXL Gene Family

in Four Sapindaceae Species and Expression Analysis of DlSMXLs during Somatic

Embryogenesis in Longan

Chen Ying，Zhang Chunyu，Xu Xiaoqiong，Lin Yuling，Lai Zhongxiong*

（Institute of Horticultural Bioengineering，F(xiàn)ujian Agriculture and Forestry University，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian 350002，China）

Abstract：【Objective】To provide a theoretical reference for the study of the biological characterization of the SMXL family of Sapindaceae，and to delve into the regulatory mechanism of this gene family in the abiotic stress response of Sapindaceae plants. 【Method】Based on the amino acid sequences of the SMXL family of the model plant Arabidopsis thaliana，TBtools was used for genome-wide identification of SMXL family members from longan，rambutan， sapindus，and litchi. MEGA11 was used to construct the phylogenetic tree，and online software such as Expasy，WoLF PSORT，MEME，STRING，PlantCARE，etc. were used to predict the protein physicochemical properties，subcellular structural localization，conserved motifs，protein interactions，cis-acting elements，etc. respectively. Longan transcriptome data were also utilized for expression analysis in the early stages of somatic embryogenesis. 【Result】Forty-eight SMXL family members were identified in four Sapindaceae species，including 11 in longan，11 in rambutan，9 in sapindus，and 17 in litchi. According to the classification of the SMXL family of Arabidopsis thaliana，the SMXL family members in four Sapindaceae species could be divided into 5 subfamilies，and the subcells were located in chloroplasts，nuclei，cytoplasm or mitochondria. Protein interaction analyses showed that SMXL family members in Sapindaceae could interact with a variety of proteins，which were mainly classified into two categories：one with the heat shock proteins （HSP） or CLP，which were abundantly expressed when subjected to abiotic stress; the other interacted with the strigolactone receptor protein D14，the karrikin receptor protein KAI2，and the MAX2 protein，which regulated the SL signaling pathway. The results of the cis-element analysis showed that among the SMXL family members of the four Sapindaceae species，there were more light-responsive elements，anaerobiosis-inducible elements （ARE），and abscisic acid-responsive elements （ABRE），etc. Therefore，it was hypothesized that the SMXL members were largely involved in the response to abiotic stress in Sapindaceae. Furthermore，there were five different expression profiles of the DlSMXL family during the early SE in longan，with the DlSMXL4 showing higher expression at embryogenic callus （EC），incomplete compact pro-embryogenic （ICpEC），and globular embryos （GE） stages compared with the other members. Based on analysis of transcriptomic data at longan EC treated with 5-azacytidine，PEG，SL，light，temperature，and various hormones，it could be seen that DlSMXL5 expression was significantly increased by drought，GR24，darkness，and high-temperature treatments. It is hypothesized that this member is capable of maintaining embryonic healing tissue morphology in response to phytohormones and stressful stresses. Secondly，DlSMXL8 was up-regulated after 5-azacytidine treatment，which might be involved in DNA methylation playing a role during somatic embryogenesis in longan. 【Conclusion】As well as playing a critical role in plant growth and development，the SMXL family of four Sapindaceae species is also widely implicated in the regulation of abiotic stress. Our results provide a theoretical basis for the classification and biological function of SMXLs in the Sapotaceae and give a better understanding of the functional validation of SMXLs in early somatic embryogenesis longan.

Key words：Sapindaceae；SMXL；Genome-wide identification；Evolutionary analysis；Early somatic embryogenesis in longan

無(wú)患子科植物全世界共有144屬，1680余種，廣泛分布于熱帶和亞熱帶，少數(shù)種類可分布到溫帶，為一典型的泛熱帶分布科［1］，主要包括龍眼、紅毛丹、無(wú)患子和荔枝等，均屬于喬木，樹(shù)體高大，童期長(zhǎng)，遺傳上高度雜合，常規(guī)育種難度大［2］。但其在材用、工業(yè)用、藥用、食用、生態(tài)環(huán)境保護(hù)和綠化觀賞等方面發(fā)揮重要的作用［3］，以其作為研究對(duì)象有較高的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)價(jià)值。

獨(dú)腳金內(nèi)酯（Strigolactones，SLs）是一類萜類小分子化合物，廣泛存在于植物界中［4］，來(lái)源于類胡蘿卜素，涉及廣泛的生理功能，包括調(diào)節(jié)植物結(jié)構(gòu)（抑制芽生長(zhǎng)和芽分枝）、光形態(tài)發(fā)生、種子萌發(fā)、結(jié)瘤和對(duì)非生物因素的生理反應(yīng)［5］。此外，獨(dú)腳金內(nèi)酯作為根際信號(hào)能促進(jìn)寄主植物與叢枝菌根真菌的共生，有助于植物吸收水分和營(yíng)養(yǎng)，但也會(huì)刺激寄生雜草種子的萌發(fā)，造成農(nóng)作物的嚴(yán)重減產(chǎn)［6］。負(fù)責(zé)獨(dú)腳金內(nèi)酯信號(hào)傳導(dǎo)的蛋白大體分為 3 類：α/β 折疊型水解酶 DWARF14（D14）/ DECREASED APICAL DOMINANCE2（DAD2）/ RAMOSUS3（RMS3），富亮氨酸重復(fù)序列 F- box 蛋白 DWARF3（D3）/MORE AXILLARY GROWTH2（MAX2） 以及 Clp 蛋白酶家族 DWARF53（D53）/SUPPRESSOR OF MORE AXILLARY GROWTH2 LIKE I（SMXLs）［7-10］。已有研究表明，在擬南芥和水稻中，SMXL6、SMXL7和SMXL8及其同源物、與蛋白D14和蛋白MAX2在獨(dú)腳金內(nèi)酯感知過(guò)程中形成一個(gè)復(fù)合物，并在獨(dú)腳金內(nèi)酯信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮核心作用［6，11-16］。玉米DWARF 53與SL受體DWARF 14A/B（ZmD14A/B）相互作用影響植株過(guò)多分蘗和減少雄穗分枝，是玉米SL信號(hào)途徑的抑制因子［17］。D53/SMXLs基因除了作為獨(dú)角金內(nèi)酯信號(hào)傳導(dǎo)的抑制因子，還可以通過(guò)此通路來(lái)控制其他激素，李家洋團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，抑制SL信號(hào)通路可能導(dǎo)致水稻莖基部生長(zhǎng)素含量升高［18］。

SMXL基因?qū)χ参锏纳L(zhǎng)和發(fā)育起重要的調(diào)控作用，目前已從擬南芥［19］、大豆［20］、蘋果［21］、油菜籽［22］和龍眼［23］等植物中鑒定出SMXL家族成員，但在荔枝、無(wú)患子和紅毛丹等無(wú)患子科植物中尚未見(jiàn)到詳細(xì)報(bào)道。本研究對(duì)4種無(wú)患子科植物SMXL基因的結(jié)構(gòu)、其編碼蛋白的亞細(xì)胞定位及其互作蛋白等進(jìn)行研究，為揭示無(wú)患子科植物SMXL家族成員的潛在功能提供理論依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料及方法

1.1試驗(yàn)材料

利用第三代龍眼基因組數(shù)據(jù)（NCBI登錄號(hào)：PRJNA792504）和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及從SapBase（http：//www.sapindaceae.com/about.html）獲取紅毛丹、無(wú)患子和荔枝的基因組數(shù)據(jù)和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。從TAIR網(wǎng)站獲取擬南芥SMXL家族成員并下載其氨基酸序列，從NCBI網(wǎng)站上獲取甘蔗SMXL家族成員及其氨基酸序列，甜橙的基因組數(shù)據(jù)下載于CPBD網(wǎng)站。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1? 4種無(wú)患子科植物SMXL家族成員的鑒定、蛋白基本理化性質(zhì)分析和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位

通過(guò)TAIR獲取擬南芥的SMXL基因家族的氨基酸序列，利用TBtools［24］以E-value參數(shù)為10-5為限制與龍眼、紅毛丹、無(wú)患子和荔枝的基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行單向blastp的同源比對(duì)。使用NCBI獲取保守結(jié)構(gòu)域文件，再刪除重復(fù)序列，最終確定龍眼、紅毛丹、無(wú)患子和荔枝SMXL家族成員。

利用Expasy進(jìn)行蛋白質(zhì)理化性質(zhì)預(yù)測(cè)；通過(guò)WoLF PSORT網(wǎng)站預(yù)測(cè)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位；在線軟件SignalP 6.0用于進(jìn)行蛋白信號(hào)肽的預(yù)測(cè)。

1.2.2? 4種無(wú)患子科植物SMXL家族成員系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建和進(jìn)化分析

利用MEGA11軟件對(duì)龍眼、紅毛丹、無(wú)患子、荔枝、擬南芥、甜橙和甘蔗SMXL家族成員的氨基酸序列進(jìn)行進(jìn)化分析，使用ClustalW進(jìn)行蛋白序列比對(duì)，參數(shù)設(shè)置：鄰接法（NJ）、自展值（Bootstrap）為1000、Passion Model并刪除數(shù)值小于70的枝干，構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，最后利用在線軟件iTOL （version 6.9）進(jìn)行美化。

1.2.3? 4種無(wú)患子科植物SMXL基因家族成員的染色體定位

基于龍眼、紅毛丹、無(wú)患子和荔枝的基因組數(shù)據(jù)，利用TBtools進(jìn)行染色體位置定位分析。

1.2.4? 4種無(wú)患子科植物SMXL家族成員基因結(jié)構(gòu)、保守基序、蛋白保守結(jié)構(gòu)域和蛋白互作分析

利用MEME進(jìn)行保守基序預(yù)測(cè)與分析，保守基序數(shù)設(shè)定為9，其他默認(rèn)參數(shù)；利用NCBI進(jìn)行蛋白保守結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)，默認(rèn)參數(shù)值；最后，基于龍眼、紅毛丹、無(wú)患子和荔枝的基因組數(shù)據(jù)，利用TBtools對(duì)各個(gè)物種的基因結(jié)構(gòu)、保守基序和蛋白保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行可視化。利用STRING （https：//string-db.org/）在線軟件，以模式植物擬南芥為選擇標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行蛋白互作分析，選擇一致性百分比最高的蛋白，置信水平設(shè)置為0.4。

1.2.5? 4種無(wú)患子科植物SMXL家族啟動(dòng)子順式元件分析和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)

基于龍眼、紅毛丹、無(wú)患子和荔枝的基因組數(shù)據(jù)，利用TBtools 提取DlSMXL、NlSMXL、SsSMXL 和LcSMXL家族成員上游2 000 bp基因序列，并獲取目的基因的啟動(dòng)子文件，再利用PlantCARE預(yù)測(cè)啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件，TBtools用于結(jié)果的可視化。

1.2.6? 龍眼SMXL家族在體胚發(fā)生早期階段的表達(dá)分析

利用龍眼轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)獲取龍眼SMXL基因家族成員在體胚發(fā)生早期不同階段中特異表達(dá)的FPKM值，利用TBtools繪制熱圖，分析各成員在體胚發(fā)生早期不同階段的表達(dá)模式。

利用龍眼5-氮胞苷［25］、PEG（PEG 5%和PEG 7.5%）［26］、SL［23］、溫度（15℃、25℃和35℃）［27］、光照［28］和各種激素處理（2，4-D、2，4-D+KT、KT和MS）轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，提取DlSMXL家族成員在EC階段不同處理狀態(tài)下的FPKM值，借助TBtools繪制熱圖，分析各成員在不同處理下的表達(dá)模式。

2 結(jié)果與分析

2.1? 4種無(wú)患子科植物SMXL家族成員的鑒定

通過(guò)鑒定，從龍眼基因組中初步獲取14個(gè)DlSMXL家族成員，利用NCBI和TBtools分析DlSMXL的保守結(jié)構(gòu)域，刪除了2個(gè)不含基本保守結(jié)構(gòu)域的DlSMXL成員：Dlo016182和Dlo016183，繼續(xù)將剩下成員的氨基酸序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)龍眼Dlo011406和Dlo010410為冗余序列，刪除Dlo011406成員，最終確定DlSMXL家族有11個(gè)成員。結(jié)合各成員在龍眼基因組中的相對(duì)位置，按照順序依次命名為DlSMXL1-DlSMXL11。按照同樣的方法獲取紅毛丹11個(gè)SMXL家族成員并將其命名為NlSMXL1-NlSMXL11；無(wú)患子SMXL家族9個(gè)成員命名為SsSMXL1-SsSMXL9；荔枝SMXL家族17個(gè)成員命名為L(zhǎng)cSMXL1-LcSMXL17。

2.2? 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建和進(jìn)化分析

為進(jìn)一步了解4種無(wú)患子科植物SMXL家族成員的生理功能和進(jìn)化關(guān)系，利用MEGA11對(duì)龍眼、紅毛丹、無(wú)患子、荔枝、擬南芥、甜橙和甘蔗共75條SMXL蛋白序列，進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析表明（圖1），依據(jù)擬南芥SMXL家族成員的分類，可將本研究SMXL家族的75個(gè)成員分為5個(gè)亞族。亞族Ⅰ有6個(gè)成員，亞族Ⅱ有15個(gè)成員，亞族Ⅲ共11個(gè)成員，亞族Ⅳ共7個(gè)成員及亞族Ⅴ共36個(gè)成員。亞族Ⅰ中成員數(shù)最少且不包括無(wú)患子成員。亞族Ⅴ中成員數(shù)量最多，包含甘蔗成員，但不具有擬南芥成員，推測(cè)亞族Ⅴ中的成員在進(jìn)化過(guò)程中出現(xiàn)了功能的特異性分化。本文亞族分類均由此得出。

2.3? 4種無(wú)患子科植物SMXL蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位預(yù)測(cè)

4種無(wú)患子科植物的蛋白氨基酸數(shù)介于306 aa～1149 aa，分子量介于34.34 kDa～125.72 kDa，同亞族成員之間大小差異較??；等電點(diǎn)介于4.95～8.51，大量成員呈酸性，僅亞族Ⅰ、Ⅲ和Ⅴ中存在成員表現(xiàn)為堿性；不穩(wěn)定系數(shù)介于34.95～60.56，除了亞族Ⅴ，其余亞族成員均為不穩(wěn)定蛋白；脂溶指數(shù)介于74.84～103.14，均為親水蛋白，且均無(wú)信號(hào)肽。根據(jù)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位分析可知，亞族Ⅰ和亞族Ⅱ成員主要在細(xì)胞核上行使功能，亞族Ⅲ和亞族Ⅳ成員主要在葉綠體上發(fā)揮作用，亞族Ⅴ成員主要定位在葉綠體或細(xì)胞質(zhì)上。

2.4? 4種無(wú)患子科植物SMXL家族成員的染色體定位分析

為進(jìn)一步了解各個(gè)家族成員之間的關(guān)系，通過(guò)TBtools對(duì)家族成員進(jìn)行染色體的定位分析，根據(jù)結(jié)果可知：龍眼DlSMXL家族的11個(gè)成員分布在6條染色體上：chr1（DlSMXL1、DlSMXL8、DlSMXL9）、chr5（DlSMXL10、DlSMXL11）、chr12（DlSMXL6）、chr13（DlSMXL3、DlSMXL4）、chr14（DlSMXL2、DlSMXL7）和chr15（DlSMXL5）。紅毛丹NlSMXL家族的11個(gè)成員分布也在6條染色體上，分別是chr8（NlSMXL3、NlSMXL5、NlSMXL10）、chr11（NlSMXL6、NlSMXL9）、chr2（NlSMXL1、NlSMXL11）、chr7（NlSMXL4、NlSMXL7）、chr15（NlSMXL8）和chr9（NlSMXL2）。無(wú)患子SsSMXL家族的9個(gè)成員分布在5條染色體上，分別是chr02（SsSMXL1、SsSMXL5）、chr05（SsSMXL4）、chr06（SsSMXL3、SsSMXL9）、chr13（SsSMXL2、SslSMXL8）和chr14（SsSMXL6、SsSMXL7）。荔枝LcSMXL家族的17個(gè)成員分布在7條染色體上，染色體由長(zhǎng)到短分別是Chr1，其包括LcSMXL1、LcSMXL7、LcSMXL8、LcSMXL11四個(gè)成員；Chr3包括LcSMXL14、LcSMXL17兩個(gè)成員；Chr7包括LcSMXL2、LcSMXL9、LcSMXL16三個(gè)成員；Chr10包括LcSMXL5一個(gè)成員；Chr12包括LcSMXL4、LcSMXL12、LcSMXL13、LcSMXL15四個(gè)成員；Chr13包括LcSMXL6一個(gè)成員和Chr15包括LcSMXL3、LcSMXL10兩個(gè)成員。

2.5? 4種無(wú)患子科植物SMXL家族成員蛋白保守結(jié)構(gòu)域、基因結(jié)構(gòu)和保守基序種類預(yù)測(cè)分析

為更深入了解DlSMXL、NlSMXL、SsSMXL和LcSMXL基因結(jié)構(gòu)多樣性，將龍眼、紅毛丹、無(wú)患子和荔枝的SMXL家族5個(gè)亞族成員的保守基序、蛋白保守結(jié)構(gòu)域和基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行可視化分析。結(jié)果（圖2）表明：4種無(wú)患子科植物SMXL家族成員的外顯子數(shù)量為1～13，LcSMXL15和LcSMXL16的基因長(zhǎng)度較短，DlSMXL4、SsSMXL3和LcSMXL12的基因長(zhǎng)度較長(zhǎng)。Motif 3是所有成員均具備的保守基序，保守性較強(qiáng)。保守結(jié)構(gòu)域共有6種，分別是RecA-like_ClpB_Hsp104-like、ClpA superfamily、P-loop_NTPase superfamily、chaperone_ClpB superfamily、clpC和clpC superfamily。同一亞族成員的基因結(jié)構(gòu)、保守基序的種類和保守結(jié)構(gòu)域極為相似，故推測(cè)處于同一亞族的成員在結(jié)構(gòu)和功能上具有相似性。

2.6? 4種無(wú)患子科植物SMXL家族成員蛋白互作分析

為了解無(wú)患子科SMXL家族成員表達(dá)的蛋白與其他蛋白的互作關(guān)系，進(jìn)一步挖掘核心的調(diào)控基因，探究基因的潛在功能，采用STRING在線軟件，得到蛋白互作預(yù)測(cè)結(jié)果表明：亞族Ⅰ成員與SMAX1為同源蛋白，并與蛋白SMXL7、D14、MAX2、DAD2、SKIP25、KAI2、RL2、CYP711A1、CCD7和CCD8互作；亞族Ⅱ成員與SMXL6為同源蛋白，與蛋白KAI2、D14、MAX2、CCD7、SMXL7、DAD2、OST1A、STT3A、RPN2、OST48和STT3B發(fā)生互作；亞族Ⅲ成員與SMXL3為同源蛋白，與蛋白MAX2、KAI2、D14、CPLS1、F5H14.16、CCD7、CCD8、SMAXI、CLPT2和CLPT1互作；亞族Ⅳ成員與SMXL5為同源蛋白，與蛋白TDR、KAI2、D14、MAX2、CCD8、SMAX1、SMXL4、CLE41、CLE44、Q9LW52_ARATH和F17I23.200進(jìn)行互作；亞族Ⅴ成員與CLPB3為同源蛋白，與蛋白CLPD、CLPR1、CLPB1、CLPP4、CLPP5、clpP1、HSP70-4、TIC40、CLPB4、CLPC1、CLPP3、TIC110、TOC159和TOC75-3互作。

2.7? 4種無(wú)患子科植物啟動(dòng)子順式作用元件分析

為了解龍眼、紅毛丹、無(wú)患子和荔枝SMXL家族成員潛在的生物學(xué)功能，利用PlantCARE對(duì)龍眼、紅毛丹、無(wú)患子和荔枝該家族成員的啟動(dòng)子順式作用元件進(jìn)行預(yù)測(cè)（圖3）。SMXL家族5個(gè)亞族成員的啟動(dòng)子上均具有大量控制轉(zhuǎn)錄起始的TATA-box元件和控制轉(zhuǎn)錄效率的CAAAT-box元件，說(shuō)明該基因家族成員均具有必須的轉(zhuǎn)錄元件。此外，還具有光響應(yīng)元件、植物激素響應(yīng)元件（脫落酸、MeJA、赤霉素、生長(zhǎng)素、水楊酸響應(yīng)元件等）、應(yīng)激響應(yīng)元件（厭氧誘導(dǎo)、干旱誘導(dǎo)、低溫誘導(dǎo)、防御和應(yīng)激響應(yīng)元件等）和與生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的元件（參與玉米醇溶蛋白代謝調(diào)節(jié)、分生組織表達(dá)、胚乳表達(dá)、種子特異性調(diào)控等響應(yīng)元件），其中Box 4光響應(yīng)元件、與脫落酸響應(yīng)相關(guān)的ABRE植物激素響應(yīng)元件和抗氧化反應(yīng)元件ARE數(shù)量最多，同時(shí)亞族Ⅱ成員還具有較多的G-box光響應(yīng)元件，亞族Ⅲ成員具有較多的MeJA響應(yīng)元件，亞族Ⅳ參與赤霉素響應(yīng)的P-box元件最多。進(jìn)一步分析可知，DlSMXL2、NlSMXL8、SsSMXL2和LcSMXL3具有較多的啟動(dòng)子順式作用元件，預(yù)測(cè)其可能行使較多的功能。

2.8? 龍眼DlSMXL家族在體胚發(fā)生早期階段的表達(dá)分析

為了解無(wú)患子科植物在體胚發(fā)生早期的表達(dá)模式，基于已知上傳的龍眼轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，繪制熱圖進(jìn)行結(jié)果分析，在龍眼體胚發(fā)生早期階段（EC、ICpEC和GE），DlSMXL家族成員出現(xiàn)了5種不同的表達(dá)模式（圖4-A）：在GE階段上調(diào)，EC、ICpEC階段下調(diào)（DlSMXL3、DlSMXL7、DlSMXL8、DlSMXL11）；在ICpEC、GE階段上調(diào)，EC階段下調(diào)（DlSMXL1、DlSMXL10）；在ICpEC階段上調(diào)，EC、GE階段下調(diào)（DlSMXL4）；在EC階段上調(diào)，ICpEC、GE階段下調(diào)（DlSMXL5）；在EC、ICpEC階段上調(diào)，GE階段下調(diào)（DlSMXL2、DlSMXL6、DlSMXL9）。此外，DlSMXL4在EC、ICpEC和GE 階段相較其他成員呈現(xiàn)較高表達(dá)，可能意味著該成員在體胚早期的形成中發(fā)揮著重要的作用。同時(shí)，DlSMXL5在EC階段有較高的表達(dá)，而在ICpEC和GE階段表達(dá)量相對(duì)較低。而其他成員均呈現(xiàn)出較低表達(dá)或者不表達(dá)。

通過(guò)龍眼5-氮胞苷處理表達(dá)分析可知（圖4-B），DlSMXL家族成員出現(xiàn)了兩種不同的表達(dá)模式：經(jīng)過(guò)5-氮胞苷處理后的家族成員基因表達(dá)下調(diào)（DlSMXL1、DlSMXL2、DlSMXL4、DlSMXL5、DlSMXL6、DlSMXL10、DlSMXL11），另外一種是經(jīng)過(guò)5-氮胞苷處理后的家族成員基因表達(dá)上調(diào)（DlSMXL3、DlSMXL7、DlSMXL8、DlSMXL9）。5-氮胞苷處理可以使龍眼球形胚提前發(fā)生［29］。根據(jù)分析結(jié)果可知，DlSMXL家族成員能夠響應(yīng)5-氮胞苷的處理，但是不同成員的響應(yīng)模式不一樣，其中DlSMXL8經(jīng)過(guò)處理后表達(dá)水平上調(diào)顯著，由此推測(cè)，DlSMXL8在5-氮胞苷影響龍眼球形胚的形成過(guò)程中發(fā)揮作用。

基于龍眼PEG處理（PEG 5%和PEG 7.5%）表達(dá)分析，根據(jù)熱圖結(jié)果可知（圖4-C），DlSMXL家族成員表現(xiàn)出5種不同的表達(dá)模式：在PEG 5%和PEG 7.5%處理下表達(dá)上調(diào)、未處理組表達(dá)下調(diào)（DlSMXL11）；在PEG 7.5%處理下表達(dá)上調(diào)，PEG 5%處理和未處理組的表達(dá)下調(diào)（DlSMXL2、DlSMXL5）；在未處理組表達(dá)上調(diào)，PEG 7.5%和PEG 5%處理下表達(dá)下調(diào)（DlSMXL3、DlSMXL4、DlSMXL6、DlSMXL7、DlSMXL9）；在PEG 5%處理下表達(dá)上調(diào)，PEG 7.5%處理和未處理組表達(dá)下調(diào)（DlSMXL10）；在PEG 5%處理和未處理組表達(dá)上調(diào)，PEG 7.5%處理下表達(dá)下調(diào)（DlSMXL1、DlSMXL8）。其中DlSMXL2和DlSMXL5在PEG處理時(shí)表達(dá)量明顯增加，說(shuō)明這2個(gè)成員可能參與干旱脅迫過(guò)程。

根據(jù)龍眼SL處理的表達(dá)分析可知（圖4-D），共表現(xiàn)出5種表達(dá)模式：經(jīng)過(guò)外源GR24處理表達(dá)量增加，未經(jīng)處理和加入丙酮處理后表達(dá)量下降（DlSMXL2、DlSMXL3、DlSMXL4、DlSMXL9、DlSMXL11）；未經(jīng)過(guò)處理的表達(dá)量增加，經(jīng)外源GR24和丙酮處理表達(dá)量下降（DlSMXL6、DlSMXL8）；經(jīng)過(guò)外源GR24和丙酮處理表達(dá)量升高，未經(jīng)處理表達(dá)量降低（DlSMXL5）；未經(jīng)處理、加入外源GR24和丙酮均不表達(dá)（DlSMXL7）；在丙酮處理下表達(dá)量升高，未經(jīng)處理和加入外源GR24表達(dá)量下降（DlSMXL1、DlSMXL10）。通過(guò)分析可知，龍眼SMXL家族大部分成員都能夠在GR24處理后表達(dá)量上升，推測(cè)該基因家族在調(diào)控龍眼的生長(zhǎng)發(fā)育以及對(duì)干旱、低磷、低氮等逆境的適應(yīng)能力中發(fā)揮重要的作用，其中DlSMXL5經(jīng)GR24處理后表達(dá)量顯著增加，說(shuō)明該成員在SLs通路中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。

基于龍眼光處理的表達(dá)分析可知（圖4-E），共表現(xiàn)出5種表達(dá)模式：經(jīng)過(guò)黑暗和白光處理表達(dá)量增加，經(jīng)藍(lán)光處理表達(dá)量降低（DlSMXL4）；經(jīng)過(guò)白光處理表達(dá)量增加，黑暗和藍(lán)光處理表達(dá)量降低（DlSMXL6）；經(jīng)過(guò)藍(lán)光處理表達(dá)量增加，黑暗和白光處理表達(dá)量下降（DlSMXL3、DlSMXL9、DlSMXL10）；經(jīng)過(guò)黑暗和藍(lán)光處理的表達(dá)量增加，白光處理的表達(dá)量降低（DlSMXL1）；經(jīng)過(guò)黑暗處理表達(dá)量增加，藍(lán)光和白光處理表達(dá)量降低（DlSMXL2、DlSMXL5）。其中DlSMXL5在黑暗處理下表達(dá)量顯著上調(diào)，而藍(lán)光和白光處理下表達(dá)量顯著下降，推測(cè)該成員在光響應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。

通過(guò)龍眼溫度處理表達(dá)分析，繪制熱圖可知（圖4-F），共表現(xiàn)出6種表達(dá)模式：經(jīng)過(guò)15℃和25℃處理的表達(dá)量增加，35℃處理的表達(dá)量降低（DlSMXL9）；經(jīng)25℃處理的表達(dá)量增加，15℃和35℃處理的表達(dá)量降低（DlSMXL7、DlSMXL11）；經(jīng)過(guò)15℃處理的表達(dá)量增加，25℃和35℃處理的表達(dá)量降低（DlSMXL1、DlSMXL4）；經(jīng)過(guò)15℃和35℃處理的表達(dá)量增加，25℃處理的表達(dá)量降低（DlSMXL3）；經(jīng)過(guò)35℃處理的表達(dá)量增加，15℃和25℃處理的表達(dá)量降低（DlSMXL2、DlSMXL5、DlSMXL6、DlSMXL10）；經(jīng)過(guò)25℃和35℃處理的表達(dá)量增加，15℃處理的表達(dá)量降低（DlSMXL8）。DlSMXL4在低溫處理時(shí)，表達(dá)量顯著增加，推測(cè)其在應(yīng)對(duì)低溫脅迫時(shí)發(fā)揮重要作用。DlSMXL5在高溫處理時(shí)表達(dá)量顯著增加，表明在高溫環(huán)境中該成員發(fā)揮至關(guān)重要的作用。

基于龍眼各種激素（2，4-D、2，4-D + KT、KT和MS）處理表達(dá)分析，繪制熱圖可知（圖4-G），共表現(xiàn)出5種表達(dá)模式：經(jīng)過(guò)MS處理過(guò)的表達(dá)上調(diào)，2，4-D、2，4-D + KT以及KT處理過(guò)的表達(dá)下調(diào)（DlSMXL6）；經(jīng)KT處理過(guò)的表達(dá)上調(diào)，MS、2，4-D以及2，4-D + KT處理過(guò)的表達(dá)下調(diào)（DlSMXL4和DlSMXL9）；經(jīng)2，4-D處理過(guò)的表達(dá)上調(diào)，MS、2，4-D + KT以及KT處理過(guò)的表達(dá)下調(diào)（DlSMXL1）；經(jīng)2，4-D以及2，4-D + KT處理過(guò)的表達(dá)上調(diào)，KT以及MS處理過(guò)的表達(dá)下調(diào)（DlSMXL3和DlSMXL10）；經(jīng)2，4-D + KT處理過(guò)的表達(dá)上調(diào)，2，4-D、KT以及MS處理過(guò)的表達(dá)下調(diào)（DlSMXL2、DlSMXL5和DlSMXL8）。DlSMXL大多成員在2，4-D和2，4-D + KT處理時(shí)表達(dá)量上升顯著，推測(cè)這些成員在響應(yīng)生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素等激素中發(fā)揮重要的作用。

3 小結(jié)與討論

3.1 無(wú)患子科植物SMXL家族進(jìn)化特性及功能多樣性

SMXL基因?qū)Κ?dú)角金內(nèi)酯信號(hào)通路起重要的調(diào)控作用，本研究基于無(wú)患子科基因組數(shù)據(jù)分別鑒定出11個(gè)龍眼、11個(gè)紅毛丹、9個(gè)無(wú)患子和17個(gè)荔枝SMXL家族成員，與大豆的SMXL家族成員數(shù)量比較，龍眼、紅毛丹、無(wú)患子和荔枝單個(gè)物種家族成員數(shù)量較少［20］。依據(jù)擬南芥SMXL家族成員分成的4個(gè)亞族構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)［19］，4種無(wú)患子科植物SMXL家族成員在進(jìn)化樹(shù)中被分為5個(gè)亞族。本研究結(jié)果與擬南芥SMXL家族分組相比多一個(gè)亞族Ⅴ，并且亞族Ⅴ中成員數(shù)量最多，且包括單子植物甘蔗SMXL家族1個(gè)成員但不包含有擬南芥成員，再根據(jù)該亞族成員的基序種類較其他亞族成員多，推測(cè)該亞族進(jìn)化時(shí)間較早，發(fā)生了特異進(jìn)化，且出現(xiàn)功能分化并在無(wú)患子科植物中行使特殊功能。對(duì)4種無(wú)患子科植物SMXL家族成員的基因結(jié)構(gòu)及蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，位于相同亞族的SMXL家族成員具有相似的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)及蛋白保守結(jié)構(gòu)域，推測(cè)處于同一亞族的SMXL家族成員可能存在相似的生物學(xué)功能。

SMXL基因功能的多樣性已在擬南芥和豆科植物上被驗(yàn)證。通過(guò)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位，推測(cè)無(wú)患子科植物的SMXL家族成員主要在葉綠體（22個(gè)）cc上行使功能。已有研究表明，TOC和TIC是由多個(gè)蛋白亞基組成的膜蛋白復(fù)合體，可介導(dǎo)眾多不同葉綠體蛋白的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，其對(duì)于葉綠體的生成、光合作用復(fù)合體的組裝以及各種代謝途徑的運(yùn)轉(zhuǎn)起著關(guān)鍵作用［30］。通過(guò)蛋白互作可知，亞族Ⅴ的成員與蛋白TIC110、TOC159和TOC75-3產(chǎn)生互作。推測(cè)無(wú)患子科植物SMXL基因能夠參與TOC和TIC蛋白復(fù)合體的調(diào)控過(guò)程，改變?nèi)~綠體的數(shù)量、形態(tài)或功能，進(jìn)而影響植物的光合速率。

3.2 無(wú)患子科植物SMXL基因可能廣泛響應(yīng)非生物脅迫過(guò)程

目前已知SMXL家族抑制基因是karrikin和strigolactone信號(hào)通路的下游元件，在非生物脅迫下的植物生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控中起重要作用［31］。本實(shí)驗(yàn)基于龍眼轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)得知DlSMXL成員在非生物脅迫下表現(xiàn)出不同程度的表達(dá)，且4種無(wú)患子科植物啟動(dòng)子上游有大量與干旱及低溫等脅迫相關(guān)的元件，故推測(cè)SMXL家族可能廣泛參與無(wú)患子科植物非生物脅迫的調(diào)控。DlSMXL大部分成員在體胚發(fā)生早期經(jīng)PEG處理后，表達(dá)下調(diào)。已有研究表明，四季豆PvSMXL2在PEG誘導(dǎo)的干旱脅迫下表達(dá)下調(diào)，因其瞬時(shí)沉默增強(qiáng)了植物干旱脅迫的耐受性［32］；擬南芥smxl6/smxl7/smxl8突變體的耐旱性與野生型相比顯著增強(qiáng)，主要表現(xiàn)在在脫水過(guò)程中葉片氣孔指數(shù)、角質(zhì)層滲透性和水分流失降低，花青素生物合成增加，而且對(duì)ABA誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉和ABA響應(yīng)非常敏感，同時(shí)也證明了ABA和SLs信號(hào)通路在調(diào)節(jié)植物對(duì)干旱的反應(yīng)中存在交互作用［33］。從無(wú)患子科4種植物的順式作用元件中預(yù)測(cè)出較多的響應(yīng)ABA的元件（ABRE），推測(cè)SMXL基因在無(wú)患子科植物的ABA信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮重要并通過(guò)對(duì)SLs信號(hào)途徑的介導(dǎo)增強(qiáng)對(duì)干旱等脅迫環(huán)境的適應(yīng)性。DlSMXL家族較多成員經(jīng)35℃高溫處理時(shí)，表達(dá)量明顯上調(diào)，相反DlSMXL4在15℃低溫處理時(shí)表達(dá)上調(diào)顯著，推測(cè)SMXL基因在植物高溫或低溫脅迫下發(fā)揮重要的作用。

3.3 SMXL基因在龍眼體胚發(fā)生過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用

已有研究表明，SMXL基因通過(guò)調(diào)節(jié)SLs、類胡蘿卜素和IAA的合成水平來(lái)抑制植物早期胚胎發(fā)育［23］。龍眼體胚發(fā)生早期和不同處理下龍眼EC的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示，DlSMXL在龍眼體胚發(fā)生早期呈現(xiàn)出不同的表達(dá)模式，推測(cè)SMXL基因在龍眼的體胚發(fā)生早期也扮演著重要的角色。另外，DlSMXL8經(jīng)過(guò)5-氮胞苷處理后，表達(dá)量顯著上調(diào)，而適宜濃度的5-氮胞苷能抑制2，4-D的甲基化作用，降低龍眼胚性愈傷組織的DNA甲基化水平，促使龍眼球形胚提前發(fā)生［29］，故推測(cè)DlSMXL8可能參與加快龍眼體細(xì)胞胚胎發(fā)生進(jìn)程中的DNA甲基化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。植物的生長(zhǎng)是光形態(tài)建成的過(guò)程，光質(zhì)對(duì)植物組織培養(yǎng)的一些形態(tài)發(fā)生過(guò)程起重要的調(diào)節(jié)作用［34］。據(jù)報(bào)道，龍眼EC在黑暗、白光和綠光條件下，生長(zhǎng)狀態(tài)最佳；在藍(lán)光條件下，生長(zhǎng)狀態(tài)較好，但出現(xiàn)顏色輕微褐化［35］。DlSMXL大多數(shù)成員在黑暗和藍(lán)光處理下表達(dá)上調(diào)，推測(cè)在黑暗或者藍(lán)光照射的條件下，SMXL基因發(fā)揮功能促進(jìn)龍眼體胚的光形態(tài)建成。

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（責(zé)任編輯：賴瑞聯(lián)）