謝進(jìn)　戴艷嬌　鄭思鄉(xiāng)　周利　孫夢(mèng)姍　宋榮

摘要：為了探討卷丹百合根系對(duì)鎘脅迫的生理響應(yīng)，以卷丹百合為實(shí)驗(yàn)材料，設(shè)置不同濃度的水培試驗(yàn)，比較不同鎘濃度處理的卷丹百合生根期根部鎘吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)規(guī)律，并比較根系蛋白質(zhì)表達(dá)的差異。結(jié)果表明：在鎘脅迫下，卷丹百合鱗莖生根期沒有富集鎘的特性，而卷丹百合根在20 μmol/L及以上濃度情況下，富集系數(shù)大于1；轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)分析表明，卷丹百合生根期鱗莖對(duì)鎘的轉(zhuǎn)運(yùn)能力很弱，同時(shí)卷丹百合根系蛋白質(zhì)發(fā)生了差異表達(dá)，這些蛋白功能包括與氧化活性相關(guān)的過(guò)氧化物歧化酶、與異黃酮分解相關(guān)的異黃酮還原酶、多功能調(diào)節(jié)酶核苷二磷酸激酶b。

關(guān)鍵詞：卷丹百合；鎘；蛋白質(zhì)

中圖分類號(hào)：X53文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1006-060X（2024）05-0038-05

Preliminary Study on Law of Cadmium Absorption and Transport at Rooting Stage of

Lilium lancifolium

XIE Jin1，2，DAI Yan-jiao1，ZHENG Si-xiang1，2，ZHOU Li1，2，SUN Meng-shan1，2，SONG Rong1，2

（1. Hunan Institute of Agricultural Environment and Ecology， Changsha 410125， PRC; 2. Center for Research & Development of Medicinal Plants， Hunan Academy of Agricultural Sciences， Changsha 410125， PRC）

Abstract： In order to explore the physiological response of Lilium lancifolium roots to cadmium stress， Lilium lancifolium was used as the experimental material， and hydroponic experiments at different concentrations were set up to compare the cadmium absorption and transport laws of Lilium lancifolium roots treated with different cadmium concentrations at the rooting stage， and the protein expression differences in the roots were compared. The results show that under cadmium stress， the bulbs of Lilium lancifolium do not enrich cadmium at the rooting stage， while the enrichment coefficient of Lilium lancifolium roots is greater than 1 at 20 μmol/L and above. The transport coefficient analysis shows that the transport capacity of bulbs to cadmium is very weak at the rooting stage of Lilium lancifolium， and the protein in the root of Lilium lancifolium is differentially expressed. These proteins include superoxide dismutase related to oxidative activity， isoflavone reductase related to isoflavone decomposition， and multifunctional regulatory enzyme nucleoside diphosphate kinase b.

Key words：Lilium lancifolium; cadmium; protein

隨著“健康中國(guó)”戰(zhàn)略的提出，大健康產(chǎn)業(yè)已成為當(dāng)前擁有巨大潛力的朝陽(yáng)產(chǎn)業(yè)。在大健康產(chǎn)業(yè)背景下，藥食同源資源因其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)具有重要的研究意義[1]。中國(guó)是百合種質(zhì)資源最豐富的國(guó)家，在食用和藥用百合產(chǎn)品研發(fā)方面處于國(guó)際領(lǐng)先地位。百合種植區(qū)域分布廣泛，甘肅蘭州、湖南龍山、湖南隆回、江蘇宜興為全國(guó)主要食用百合產(chǎn)地，種植面積超過(guò)2萬(wàn)hm2[2]。百合作為國(guó)家衛(wèi)生部首批公布的藥食同源食品，富含膳食纖維、蛋白質(zhì)、脂肪、氨基酸、微量元素以及維生素類等，同時(shí)富含多種活性成分，有多糖類、生物堿類、甾體皂苷類、黃酮類以及酚類化合物等多種藥效活性成分[3]。在“健康中國(guó)”“藥食同源”“龍山百合”的加持下，百合的食品安全和藥用安全的問(wèn)題受到國(guó)內(nèi)外關(guān)注。

近年來(lái)，重金屬污染逐漸成為人們?cè)谌粘ｏ嬍秤盟幹械年P(guān)注重點(diǎn)，尤其是金屬鎘，它對(duì)人體有腎毒性和神經(jīng)毒性，可造成人體骨、心血管等多器官損傷，甚至有致癌危險(xiǎn)[4-6]。而對(duì)于植物，鎘降低了植物的光合能力，導(dǎo)致植物生長(zhǎng)遲緩，發(fā)生氧化應(yīng)激，并影響次生代謝[7]。

20世紀(jì)70年代，就有關(guān)于植物對(duì)鎘的吸收和分配規(guī)律、重金屬鎘在植物體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)途徑等報(bào)道，各種研究表明，植物根系中的Cd2+含量通常高于地上部分，且地上部分對(duì)鎘更加敏感，表明植物可能通過(guò)限制鎘進(jìn)入根中輸導(dǎo)組織，減少Cd2+向地上部分的轉(zhuǎn)運(yùn)[8]。大部分的鎘離子主要是從根部吸收的，鎘離子進(jìn)入根部表皮層主要有3種方式：（1）根部表皮細(xì)胞的質(zhì)膜處，存在由植物呼吸釋放出的CO2和H2O 生成的H2CO3解離而來(lái)的H+和HCO3-，H+迅速與Cd2+交換吸附，使Cd2+被吸附在植物根系表皮細(xì)胞表面，這種交換吸附不需要能量且速度很快，為Cd2+以質(zhì)外體途徑進(jìn)入表皮細(xì)胞做好準(zhǔn)備[9]；

（2）Cd2+是非必需元素，卻可以占用特異度低的必需元素如 Fe2+、Zn2+和 Ca2+的離子通道進(jìn)入植物細(xì)胞，Cd2+通過(guò)鋅鈣轉(zhuǎn)運(yùn)通道時(shí)與鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)和鈣轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)結(jié)合，以共質(zhì)體途徑進(jìn)入根表皮細(xì)胞，該轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程受到轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì) ZIP（zrt-，irt- like protein）家族中的IRT1轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)的控制[10]；（3）為使根際土壤溶液中離子利用率升高，植物根部會(huì)積極分泌麥根酸等小分子化合物，而麥根酸可以有效螯合Cd2+形成金屬配位體復(fù)合物，使Cd2+以螯合物的形式通過(guò)YSL（yellow- stripe 1- like）蛋白質(zhì)，最終進(jìn)入根細(xì)胞[11-13]。重金屬鎘進(jìn)入根細(xì)胞后通過(guò)共質(zhì)體途徑木質(zhì)部主要利用重金屬酶P1B-ATP，如AtHMA2和AtHMA4編碼轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[14]，也有可能和YSL蛋白質(zhì)結(jié)合進(jìn)入木質(zhì)部[15]。此外，擬南芥（Arabidopsis thaliana）AtPDR8基因編碼的三磷酸腺苷（ATP，denosine triphosphate）轉(zhuǎn)運(yùn)體已經(jīng)被證明能夠?qū)d2+從根毛和表皮細(xì)胞細(xì)胞膜上導(dǎo)出[16]。

目前，水稻鎘污染的研究比較深入，Cd從根到芽再到籽粒[17]，根吸收Cd后，通過(guò)木質(zhì)部轉(zhuǎn)移到嫩枝上，而木質(zhì)部介導(dǎo)的Cd從根到枝的轉(zhuǎn)運(yùn)是影響產(chǎn)量的主要因素。OsHMA2和OsHMA3在這一過(guò)程中起重要的作用[18]，OsHMA3在根細(xì)胞中Cd進(jìn)入液泡過(guò)程起關(guān)鍵作用；而OsHMA2參與Cd向發(fā)育組織傳遞[19]。同時(shí)作為自然抗性相關(guān)巨噬細(xì)胞蛋白（NRAMP，NRAMP，natural resistance-associated?macrophage protein）的一員，OsNRAMP5負(fù)責(zé)鐵、錳和鎘從外部運(yùn)輸?shù)礁?xì)胞[20-21]，而Tang等[22]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因OsNramp5，開發(fā)出低Cd積累、無(wú)轉(zhuǎn)基因的秈稻新品系。由此可見，植物吸收鎘主要是通過(guò)根，而后進(jìn)入植物體內(nèi)向植物地上部分運(yùn)輸，導(dǎo)致鎘在植物各個(gè)部位的積累，并且這些過(guò)程都是通過(guò)蛋白質(zhì)、酶完成的，尤其是轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，因此，研究植物根系吸收鎘的蛋白，并對(duì)其表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，對(duì)植物鎘吸收轉(zhuǎn)運(yùn)積累起到關(guān)鍵作用。

試驗(yàn)以卷丹百合為試驗(yàn)材料，采用水培試驗(yàn)，比較卷丹百合生根期鎘吸收轉(zhuǎn)運(yùn)規(guī)律，同時(shí)對(duì)其根系蛋白質(zhì)差異進(jìn)行初探，該研究結(jié)果將有助于了解卷丹百合吸收轉(zhuǎn)運(yùn)鎘的規(guī)律，為解決百合食用和藥用安全問(wèn)題提供數(shù)據(jù)支撐，對(duì)整個(gè)百合產(chǎn)業(yè)有重要的理論價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)試劑與儀器

試驗(yàn)試劑包括四水硝酸鈣、硝酸鉀、磷酸二氫銨、七水硫酸鎂、硼酸、四水硫酸錳、一水硫酸錳、七水硫酸鋅、五水硫酸銅、七鉬酸銨和乙二胺四乙酸鐵鈉。

試驗(yàn)儀器包括AB 5800 MALDI-TOF/TOF（AB SCIEX，美國(guó)），PROTEAN i12 IEF Cell（BIO-RAD，美國(guó)）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 卷丹百合鱗莖水培 將卷丹百合種球分割成小鱗莖，收集無(wú)病的小鱗莖，在1∶500的苯菌靈水溶液中浸泡30 min，栽種在水培體系中，在室溫下培養(yǎng)。水培使用容量20 L（45.5 cm×32 cm×14 cm）的18個(gè)水箱（12個(gè)小鱗莖/箱），外加通氣泵6個(gè)，以保證根系供氧。將小鱗莖固定在隔板上，僅將鱗莖底部接觸到水箱中的營(yíng)養(yǎng)液，營(yíng)養(yǎng)液10 d左右更換一次，防止滋生細(xì)菌。

1.2.2 卷丹百合鎘脅迫試驗(yàn) 試驗(yàn)分為8組，以Cd2+ 0 μmol/L為對(duì)照（CK），營(yíng)養(yǎng)液Cd2+濃度2、5、10、20、30、50和70 μmol/L為處理1～7組，對(duì)生根期卷丹百合進(jìn)行取樣。

1.3 鎘含量測(cè)定

將試驗(yàn)樣品按照根、鱗莖等分離，用自來(lái)水將百合各部位洗凈，再用去離子水淌洗3遍，晾干，待百合植株無(wú)明顯水珠后裝入信封，105℃殺青15 min，60℃恒溫烘干至恒重后稱重。將粉碎成粉末狀的百合各組織部位樣品分別稱取0.50 g裝入錐形瓶中，采用HNO3∶HClO4 =4∶1的混合酸消煮，原子吸收分光光度法測(cè)定，采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究所提供的植株標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)控。

1.4 卷丹百合根蛋白質(zhì)雙向電泳

1.4.1 等點(diǎn)聚焦 17 cm IPG膠條的上樣體積為600 μL，根據(jù)蛋白定量結(jié)果，使所有樣品蛋白上樣總量保持一致，不足的體積用水化液補(bǔ)齊，水化液與裂解液相同。水化板用超純水清洗干凈，自然晾干。將制好的樣品加入膠條槽中，取出IPG干膠條，膠面向下放置于樣品之上，使液體浸潤(rùn)整個(gè)膠條，加入覆蓋油，膠條水化16 h。將膠條從水化板中取出，膠面向上放入等電聚焦板中，添加覆蓋油，等電聚焦在20℃下自動(dòng)進(jìn)行，每根膠條的極限電流為50 μA/根。

1.4.2 膠條平衡 （1）平衡液配制：50 mmol/L Tris-HCl （pH值8.8） +6 mol/L Urea +20% （v/v） Glycerol +2% （w/v） SDS。配制好的平衡液分裝并保存在-20℃冰箱中。

（2）第一步平衡：等電聚焦結(jié)束后，取出IPG膠條，放入的含有1%（w/v）DTT的平衡液中，將平衡管置于搖床上平衡15 min。

（3）第二步平衡：第一步平衡結(jié)束后，將膠條放入含有2.5%碘乙酰胺（IAA）的平衡液中，將平衡管置于搖床上平衡15 min。

1.4.3 第二向SDS-PAGE垂直電泳 （1）配制15%的聚丙烯酰胺凝膠，將膠灌至距玻璃板上檐1 cm處，加入1 mL飽和正丁醇封膠液，室溫靜置3 h使凝膠完全聚合。倒出飽和正丁醇，用超純水清洗膠面，在用濾紙將膠上殘余水分吸干。

（2）將平衡好的膠條放置在SDS-PAGE膠面上，使膠條與膠面充分接觸（不要有氣泡），膠條的一端加入蛋白分子量Marker，覆蓋一層0.5%的低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液。

（3）將裝好膠條的玻璃板放入電泳槽中冰浴，以80 V/膠先電泳30 min，然后以100 V/膠繼續(xù)電泳，直到溴酚藍(lán)移至膠的下緣處，停止電泳。

采用blue silver染色方法進(jìn)行固定、平衡、染色和脫色，采用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)雙向電泳行圖像采集。

1.4.4 蛋白質(zhì)膠內(nèi)酶切 通過(guò)軟件分析，將得到的差異蛋白質(zhì)膠點(diǎn)切下，將切下來(lái)的不同蛋白的膠點(diǎn)轉(zhuǎn)移至離心管，用脫色液（50%乙腈/100 mmol/L碳酸氫銨）將膠粒的藍(lán)色脫去，每次30 min，重復(fù)數(shù)次，直至將藍(lán)色考馬斯全部洗滌掉，將膠粒凍干。取含50 ng胰蛋白酶（測(cè)序級(jí)）的50 mmol/L碳酸氫銨溶液10 μL與離心管中，靜置10 min，充分吸脹，補(bǔ)入50 mmol/L碳酸氫銨溶液，徹底浸沒膠粒，37℃孵育14～16 h。將提取液從上述離心管轉(zhuǎn)移到新的離心管中，再在膠粒離心管中加入10～20 μL含0.1%三氟乙酸的60%的乙腈溶液孵育30 min，得到的溶液與之前的溶液合并，冷凍離心干燥至2～5 μL，備用。

1.4.5 質(zhì)譜測(cè)定 采用AB 5800 MALDI-TOF/TOF超高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，紫外激光器以400 Hz的重復(fù)頻率操作，波長(zhǎng)為355 nm。加速電壓在20 kV下運(yùn)行，質(zhì)量分辨率為最大值為1 600 Da。用胰蛋白酶消化的肌紅蛋白用于使用內(nèi)部校準(zhǔn)模式校準(zhǔn)質(zhì)量?jī)x表，采用Protein Pilot TM 4.0軟件處理數(shù)據(jù)，采用NCBI，Uniprot庫(kù)對(duì)質(zhì)譜信息進(jìn)行檢索，得到相應(yīng)蛋白點(diǎn)信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 卷丹百合根和鱗莖鎘含量

將每組鎘濃度處理的水培苗隨機(jī)取樣，每組3個(gè)重復(fù)，將樣品處理后，對(duì)卷丹百合根、鱗莖進(jìn)行鎘含量測(cè)定，結(jié)果表明卷丹百合根和鱗莖的鎘含量隨著水培鎘濃度的增加而增加（圖1）。

同時(shí)對(duì)不同鎘處理的富集系數(shù)統(tǒng)計(jì)分析（表1），結(jié)果表明，卷丹百合根/土壤的富集系數(shù)變化范圍為0.74～3.33，卷丹百合鱗莖/土壤的富集系數(shù)變化范圍為 0.07～0.30，卷丹百合鱗莖富集系數(shù)均小于1，說(shuō)明卷丹百合鱗莖在生根期沒有富集鎘的特性，而卷丹百合根在20 μmol/L及以上濃度情況下，富集系數(shù)大于1，說(shuō)明卷丹百合根在生根期有富集特性；對(duì)于不同鎘處理的轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)分析表明，鱗莖/根的轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)范圍為0.02～0.31，說(shuō)明卷丹百合生根期鱗莖對(duì)鎘的轉(zhuǎn)運(yùn)能力很弱。

2.2 卷丹百合根的雙向電泳

在這些處理當(dāng)中，將處理7（營(yíng)養(yǎng)液中鎘含量為70 μmol/L）與對(duì)照組卷丹百合根系進(jìn)行蛋白質(zhì)提取分離，對(duì)差異蛋白進(jìn)行分析。

由圖2可見，對(duì)照組卷丹百合根與鎘處理卷丹百合根的蛋白質(zhì)發(fā)生了變化，選取了差異較明顯的7個(gè)蛋白點(diǎn)進(jìn)行分析鑒定，蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果如表2。

由表2可知，卷丹百合根系在鎘脅迫下，許多蛋白質(zhì)都發(fā)生了差異表達(dá)，其中有多功能調(diào)節(jié)酶核苷二磷酸激酶b及一些未知蛋白質(zhì)，與氧化活性相關(guān)的過(guò)氧化物歧化酶，其中3號(hào)蛋白點(diǎn)通過(guò)質(zhì)譜鑒定為Cu/Zn超氧化物歧化酶，在鎘處理組中的表達(dá)量遠(yuǎn)高于對(duì)照組。

3 結(jié)論與討論

在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)Cu/Zn超氧化物歧化酶在鎘處理卷丹百合根中的表達(dá)量遠(yuǎn)高于對(duì)照組卷丹百合根，鎘脅迫誘導(dǎo)植物細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸等大分子物質(zhì)受損，阻礙植物的正常代謝和生長(zhǎng)，甚至導(dǎo)致植物細(xì)胞死亡，而Cu/Zn超氧化物歧化酶量的增加了鎘處理卷丹百合根對(duì)超氧陰離子的歧化作用，將更多的超氧陰離子歧化為過(guò)氧化氫，從而使鎘處理卷丹百合根中的超氧陰離子水平低于對(duì)照組。后續(xù)試驗(yàn)可以對(duì)卷丹百合Cu/Zn超氧化物歧化酶的功能和作用機(jī)制進(jìn)行深入研究，該研究結(jié)果將有助于解決卷丹百合重金屬鎘超標(biāo)的問(wèn)題，對(duì)整個(gè)百合產(chǎn)業(yè)有重要的理論價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。

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（責(zé)任編輯：肖彥資）

收稿日期：2024-03-05

基金項(xiàng)目：湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新項(xiàng)目（2022CX99，2023CX108，2023CX109）；湖南省種業(yè)創(chuàng)新項(xiàng)目（2021NK1005）；湖南省重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目（2022NK2008，2023NK2014）

作者簡(jiǎn)介：謝進(jìn)（1984—），女，湖南株洲市人，助理研究員，主要從事藥用植物生物化學(xué)研究。

通信作者：宋榮