EIF4A3 shRNA 慢病毒載體的構(gòu)建及其穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的建立

［摘 要］ 目的：構(gòu)建真核細(xì)胞翻譯起始因子4A3（EIF4A3） -短發(fā)夾RNA（shRNA） 慢病毒載體，建立Neuro-2a-EIF4A3-shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。方法：通過(guò)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心 （NCBI） 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索EIF4A3 基因序列，設(shè)計(jì)并合成PCR 鑒定引物，并將其連接至經(jīng)EcoR Ⅰ和Age Ⅰ酶切的慢病毒GV493 載體， 構(gòu)建GV493-EIF4A3-shRNA 慢病毒質(zhì)粒， PCR 篩選陽(yáng)性克隆并測(cè)序鑒定。將GV493 空載質(zhì)粒和GV493-EIF4A3-shRNA 重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至HEK293T 細(xì)胞中，分別為GV493 對(duì)照慢病毒和GV493-EIF4A3-shRNA 慢病毒， 轉(zhuǎn)染48 h 后收集慢病毒進(jìn)行包裝并測(cè)定病毒滴度。將Neuro-2a 細(xì)胞分為空白組、GV493 對(duì)照組和GV493-EIF4A3 shRNA 組，空白組不作處理，GV493 對(duì)照組和GV493-EIF4A3 shRNA 組分別采用相應(yīng)慢病毒感染Neuro-2a 細(xì)胞， 慢病毒感染復(fù)數(shù)（MOI）為100，使用10 mg·L－1嘌呤霉素篩選成功感染慢病毒的Neuro-2a 細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察各組Neuro-2a細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)和綠色熒光表達(dá)情況；實(shí)時(shí)熒光定量PCR （RT-qPCR） 法和Western blotting 法檢測(cè)各組 Neuro-2a細(xì)胞中 EIF4A3 mRNA 及蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：PCR 測(cè)序結(jié)果顯示 GV493-EIF4A3-shRNA 重組質(zhì)?；蛐蛄信c設(shè)計(jì)合成的EIF4A3-shRNA 序列一致，成功構(gòu)建GV493-EIF4A3 慢病毒載體。熒光顯微鏡觀察可見(jiàn)HEK293T 細(xì)胞熒光表達(dá)強(qiáng)烈，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，慢病毒包裝成功。GV493-對(duì)照慢病毒和GV493-EIF4A3-shRNA 慢病毒的滴度均為2×108 TU·mL－1，GV493 對(duì)照組和GV493-EIF4A3 shRNA 組Neuro-2a 細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好且表達(dá)綠色熒光，表明慢病毒感染穩(wěn)定細(xì)胞系構(gòu)建成功。RT-qPCR 法， 與空白組和GV493 對(duì)照組比較， GV493-EIF4A3 shRNA 組Neuro-2a 細(xì)胞EIF4A3mRNA 表達(dá)水平明顯降低（Plt;0. 01）。Western blotting 法，各組在相對(duì)分子質(zhì)量49 000 處出現(xiàn)特異性條帶，提示Neuro-2a 細(xì)胞中EIF4A3 蛋白表達(dá)成功；與空白組和GV493 對(duì)照組比較，GV493-EIF4A3shRNA 組 Neuro-2a 細(xì)胞中 EIF4A3 蛋白表達(dá)水平明顯降低 （Plt;0. 01）。結(jié)論：成功構(gòu)建 GV493-EIF4A3-shRNA 慢病毒載體，建立了Neuro-2a-EIF4A3-shRNA 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，為EIF4A3 在顱內(nèi)動(dòng)脈粥樣硬化的作用機(jī)制研究提供了參考。

［關(guān)鍵詞］ 真核細(xì)胞翻譯起始因子4A3； 短發(fā)夾RNA； 慢病毒； 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系； Neuro-2a 細(xì)胞

［中圖分類(lèi)號(hào)］ R392 ［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

真核細(xì)胞翻譯起始因子4A （eukaryotictranslation initiation factor 4A，EIF4A） 3 蛋白屬于廣泛的DEAD box RNA 解旋酶家族， 其成員憑借其RNA 結(jié)合能力和三磷酸腺苷（adenosinetriphosphate，ATP） 酶活性參與RNA 代謝的多個(gè)方面。EIF4A 蛋白主要有3 個(gè)類(lèi)型， EIF4A1 和EIF4A2 主要在脊椎動(dòng)物細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)， 而EIF4A3 則主要定位于細(xì)胞核。盡管3 個(gè)類(lèi)型高度相似，但在mRNA 的生命周期中具有不同的作用，其特殊和多樣的功能常被相互作用的伴侶蛋白調(diào)節(jié)及支配［1］。EIF4A1 和EIF4A2 均參與翻譯的起始過(guò)程。EIF4A3 蛋白在RNA 代謝中起重要作用，包括mRNA 定位、導(dǎo)出及 mRNA 剪接和翻譯的偶聯(lián)［2-4］。EIF4A3 與EIF4A1 和EIF4A2 具有相同的ATP 酶活性，但EIF4A3 自身無(wú)解旋酶活性，也不參與翻譯的啟動(dòng)［5］。EIF4A3 在多種人類(lèi)惡性腫瘤中表達(dá)。研究［6］ 顯示：EIF4A3 刺激環(huán)狀二磷酸腺苷核糖基化因子鳥(niǎo)苷酸激酶1 （circ adenosinediphosphate ribosylation factor guanylate kinase 1，ASAP1） 表達(dá)， 通過(guò)細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK） 信號(hào)通路促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的發(fā)展。在肝細(xì)胞癌中，EIF4A3 沉默抑制細(xì)胞增殖、遷移和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition， EMT）［7-8］。研究［9］ 顯示：在上皮性卵巢癌細(xì)胞中，EIF4A3 結(jié)合癌易感性候選基因2（cancer susceptibility candidate 2，CASC2） 增強(qiáng)細(xì)胞活性和細(xì)胞凋亡、遷移及侵襲，EIF4A3 敲低會(huì)增加細(xì)胞凋亡。在宮頸癌中，人類(lèi)環(huán)狀RNA （human_circ RNA，hsa_circ）_0101119 可促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，并通過(guò)與EIF4A3 相互作用抑制宮頸癌的細(xì)胞凋亡，以抑制轉(zhuǎn)錄延伸因子A 樣蛋白6 （transcription elongation factor A like 6，TCEAL6） 表達(dá)［10-11］。在心血管疾病方面，EIF4A3誘導(dǎo)的環(huán)狀 B 淋巴細(xì)胞瘤2 （B-cell lymphoma-2，Bcl-2） /腺病毒 E1B 19 kDa 結(jié)合蛋白3 （Bcl-2/adenovirus E1B 19 kDa interacting protein 3，BNIP3），通過(guò)非編碼單鏈微小RNA （micro RNA，miR）-27a-3p/BNIP3 通路加劇低氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷［12］。研究［13］ 顯示： hsa_circ_0030042 通過(guò)抑制EIF4A3 與重組人自噬效應(yīng)蛋白1 （recombinanthuman autophagy-related protein， Beclin 1） 和人叉頭框蛋白O1 （human forkhead Box protein O1，F(xiàn)OXO1） 結(jié)合，加劇小鼠斑塊的不穩(wěn)定性。研究［14］證實(shí)：EIF4A3 誘導(dǎo)的環(huán)狀RNA （circ RNA，circ）_0086296 通過(guò)miR-576-3p/干擾素誘導(dǎo)蛋白與四肽重復(fù)1 （interferon induced protein with tetratricopeptiderepeats 1， IFIT1） /信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子1（signal transduction and activator of transcription 1，STAT1） 反饋回路增強(qiáng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells， hUVECs）的動(dòng)脈粥樣硬化病變表型。但目前EIF4A3 在顱內(nèi)動(dòng)脈粥樣硬化中的作用機(jī)制尚不明確。本研究構(gòu)建EIF4A3-短發(fā)夾RNA （short hairpin RNA，shRNA）慢病毒載體， 建立Neuro-2a-EIF4A3-shRNA 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，為探討 EIF4A3 在顱內(nèi)動(dòng)脈粥樣硬化中的作用機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1. 1 細(xì)胞、主要試劑和儀器

小鼠神經(jīng)瘤母細(xì)胞系（Neuro-2a） 購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司，人胚腎細(xì)胞（HEK293T） 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所。慢病毒載體質(zhì)粒GV493 （hU6-MCS-CBhgcGFP-IRES-puromycin）、輔助質(zhì)粒Helper1. 0 和輔助質(zhì)粒Helper2. 0 均由上海吉?jiǎng)P基因公司提供，大腸桿菌菌株DH5α 購(gòu)自北京Solarbio 公司， 限制性核酸內(nèi)切酶EcoR Ⅰ 和Age Ⅰ 購(gòu)自美國(guó)NEB 公司， Taq 聚合酶購(gòu)自北京SinoBio 公司， 一步法克隆試劑盒購(gòu)自美國(guó)Vazyme 公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自北京TaKaRa Bio 公司， Lipofectamine 2000 和TRIzol 購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司， 實(shí)時(shí)熒光定量PCR （real-time fluorescence quantitative PCR，RTqPCR）染料預(yù)混液購(gòu)自北京GenStar 公司， BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific 公司，DMEM、MEM 和Opti-MEN 培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司，膠回收試劑盒、50×TAE 和質(zhì)粒抽提試劑盒由北京TIANGEN 公司提供，胰蛋白胨、瓊脂糖粉、酵母提取物和氯化鈉購(gòu)自美國(guó)Vetec 公司，抗EIF4A3 抗體和抗GAPDH 抗體均購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司。倒置光學(xué)顯微鏡和倒置熒光顯微鏡購(gòu)自日本Olympus 公司， 熒光定量PCR 儀購(gòu)自瑞士Roche 公司， 電泳儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司， 化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀購(gòu)自美國(guó)Azure Biosystems 公司。

1. 2 細(xì) 胞 培 養(yǎng)

HEK293T 細(xì) 胞 常 規(guī) 培 養(yǎng) 于DMEM 培養(yǎng)基（含10% 胎牛血清和1% 青-鏈霉素）， Neuro-2a 細(xì)胞培養(yǎng)于MEM 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清和1% 青-鏈霉素）， 置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，隔2～3 d 即可傳代1 次，細(xì)胞狀態(tài)良好且密度大于90% 時(shí)用0. 25% 胰蛋白酶消化傳代。

1. 3 引物設(shè)計(jì)和合成

通過(guò)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center for BiotechnologyInformation， NCBI） 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索EIF4A3 （GeneID： 9775） 序列， 結(jié)合引物設(shè)計(jì)原則和載體GV493 閱讀框克隆位點(diǎn)， 設(shè)計(jì)引物。設(shè)計(jì)并合成EIF4A3 PCR 鑒定引物， 引物序列： 上游引物，5'-ATGGAAATTTGATACTCTATG-3'， 下游引物， 5'-CATAGAGTATCAAATTTCCAT-3'。設(shè)計(jì)并合成EIF4A3 RT-qPCR引物，引物序列：上游引物，5'-GACCAAAGTGGAGTTCGAGACG-3'，下游引物，5'-TGATAGCACGCTGCTGAATCGC-3'。引物均由生工生物工程（上海） 股份有限公司合成。

1. 4 EIF4A3慢病毒載體構(gòu)建及鑒定

合成的基因引物經(jīng)PCR 擴(kuò)增，獲得DNA 片段。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系（50 μL）： 上下游引物（10 μmol·L－ 1） 各1 μL，DNA 模板1 μL，2. 5 mmol·L－1 dNTP 4 μL，5×Buffer 10 μL， Prime STAR HS DNApolymerase 0. 5 μL， ddH2O 50 μL。 擴(kuò)增程序：98 ℃，5 min；98 ℃，10 s；55 ℃，10 s；72 ℃，90 s，共30 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸8 min，4 ℃保存。

采用EcoR Ⅰ和Age Ⅰ限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)GV493進(jìn)行酶切。酶切體系（50 μL） 為10×酶緩沖液 5 μL，GV493 DNA 2 μL， EcoR Ⅰ 1 μL， Age Ⅰ 1 μL，ddH2O 加入總體積50 μL， 吹打、混勻和離心后，在37 ℃下反應(yīng)3 h 后過(guò)夜。采用酶切回收試劑盒初膠回收GV493 載體質(zhì)粒。

采用一步法克隆試劑盒將PCR 擴(kuò)增的EIF4A3引物連接至攜gcGFP/Puromycin 的慢病毒GV493載體，重組后載體見(jiàn)圖1。反應(yīng)體系（10 μL）：5×酶緩沖液 2 μL，酶切GV493 DNA 2. 5 μL，純化的擴(kuò)增產(chǎn)物片段1 μL，外切酶Ⅱ 1 μL，總體積10 μL加入ddH2O；吹打離心后，在37 ℃下反應(yīng)30 min，冰浴冷卻5 min。

將10 μL GV493 空質(zhì)粒和GV493-EIF4A3shRNA 重組質(zhì)粒分別加入100 μL 感受態(tài)細(xì)胞DH5α中， 混合均勻； 冰上反應(yīng)30 min， 42 ℃ 熱激1. 5 min， 冰浴2 min； 37 ℃ 搖床培養(yǎng)60 min， 含500 μL LB 液。取培養(yǎng)后的菌液適量，均勻涂布于含100 mg·L－1 氨芐西林的LB 培養(yǎng)板上，倒置培養(yǎng)板37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h；次日，在平板上培養(yǎng)菌落，在含有100 mg·L－1 氨芐西林的3 mL LB 培養(yǎng)基搖床上取適量的細(xì)菌， 37 ℃搖床過(guò)夜， 吸附適量的細(xì)菌溶液， 并用甘油保菌， 其余的細(xì)菌溶液經(jīng)PCR 和酶切鑒定。鑒定體系（20 μL）： 2×Taq 聚合酶10 μL，擴(kuò)增鑒定上游引物（10 μmo·l L－1） 0. 4 μL，擴(kuò)增鑒定下游引物（10 μmol·L－1） 0. 4 μL， 適量甘油菌液，加入ddH2O 至總體積為20 μL，反應(yīng)程序： 94 ℃ 變性3 min， 94 ℃ 、30 s， 55 ℃ 、30 s，72 ℃、30 s， 共22 個(gè)循環(huán)， 72 ℃延伸5 min， 4 ℃保存。如在基因片段57 bp 附近出現(xiàn)條帶，則表明該重組菌是攜帶重組GV493-EIF4A3 shRNA 的陽(yáng)性菌。對(duì)鑒定出的陽(yáng)性菌進(jìn)行克隆，送生工生物工程（上海） 股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序成功，則可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1. 5 EIF4A3慢病毒包裝及滴度測(cè)定

轉(zhuǎn)染前1 d，將生長(zhǎng)狀況良好的HEK293T 細(xì)胞接種于100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，37 ℃、5% CO2 孵箱培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80% 時(shí)，采用EIF4A3 慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染體系分為Mixture A 和Mixture B。Mixture A：10 μg GV493 空載質(zhì)粒或GV493-EIF4A3-shRNA重組質(zhì)粒+5 μg 輔助質(zhì)粒Helper 1. 0 型+5 μg 輔助質(zhì)粒Helper 2. 0 型+750 μL Opti-MEM；Mixture B：15 μL Lipofactamine 2000+750 μL Opti-MEM。Mixture A 和Mixture B 體系各自混勻，室溫避光放置5 min，后2 個(gè)體系相互混勻，室溫孵育20 min。將Mixture A 和Mixture B 的混合物加入 3 mLOpti-MEM 至100 mm 培養(yǎng)皿中， 輕輕搖動(dòng)混合，在37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。待轉(zhuǎn)染結(jié)束后，將100 mm 培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液更換為正常生長(zhǎng)的培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h。在熒光顯微鏡下，當(dāng)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率約90% 時(shí)， 收集培養(yǎng)皿上清液， 采用0. 45 μm濾膜過(guò)濾，低溫超高速離心法去除上清液，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline， PBS） 溶解沉淀。GV493 空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后收集的慢病毒為GV493 對(duì)照慢病毒， GV493-EIF4A3 shRNA 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后收集的慢病毒為GV493-EIF4A3shRNA 慢病毒，將收集的病毒溶液進(jìn)行滴度測(cè)定。

慢病毒滴度測(cè)定前1 d，將HEK293T 細(xì)胞鋪入96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔4×104個(gè)細(xì)胞。分別在3 個(gè)EP 管中采用90 μL 無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)病毒， 分別標(biāo)記為1E+1 μL 組（含10 μL 病毒溶液）、1E+0 μL 組（1E-1 μL 組病毒溶液10 倍稀釋?zhuān)?和1E-1 μL 組（1E+0 μL 組病毒溶液10 倍稀釋?zhuān)?。熒光顯微鏡下觀察病毒轉(zhuǎn)染后HEK293T 細(xì)胞熒光表達(dá)情況。

1. 6 EIF4A3 shRNA慢病毒感染 Neuro-2a細(xì)胞及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系構(gòu)建

將 Neuro-2a細(xì)胞鋪于 12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞密度達(dá)到70%～80% 時(shí)，按最佳慢病毒感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）為100， 取相應(yīng)病毒量進(jìn)行慢病毒感染實(shí)驗(yàn)。將Neuro-2a 細(xì)胞分為空白組、GV493 對(duì)照組和GV493-EIF4A3 shRNA 組?？瞻捉M不做處理，GV493 對(duì)照組和GV493-EIF4A3 shRNA 組分別采用GV493 對(duì)照慢病毒和GV493-EIF4A3 shRNA 慢病毒感染Neuro-2a 細(xì)胞，慢病毒感染24 h 后換液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h， 加入嘌呤霉素（10 mg·L－1） 進(jìn)行篩選，1 d后換液，之后維持嘌呤霉素濃度在5 mg·L－1，培養(yǎng)2 周。在熒光顯微鏡下觀察Neuro-2a 細(xì)胞，若細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好且表達(dá)綠色熒光，則提示慢病毒感染穩(wěn)定細(xì)胞系構(gòu)建成功。

1. 7 RT-qPCR 法 檢 測(cè) 各 組 Neuro-2a 細(xì) 胞 中EIF4A3 mRNA表達(dá)水平

采用TRIzol法提取各組RNA，測(cè)純度和濃度后，取1 000 ng RNA 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用2×增強(qiáng)型染料RT-qPCR 預(yù)混液進(jìn)行RT-qPCR 法檢測(cè)， EIF4A3 PCR 引物： 上游引物，5'-GACCAAAGTGGAGTTCGAGACG-3'；下游引物，5'-TGATAGCACGCTGCTGAATCGC-3'。反應(yīng)體系（10 μL）： 染料預(yù)混液5 μL， PCR 引物（10 μmol·L－1） 0. 2 μL， cDNA 1 μL， 加ddH2O 至10 μL。擴(kuò)增條件： 95 ℃ 、10 s， 55 ℃ 、20 s，72 ℃、15 s，共40 個(gè)循環(huán)。溶解條件：65 ℃、60 s，95 ℃、1 s。以GAPDH 為內(nèi)參，采用2—△△Ct法計(jì)算各組Neuro-2a 細(xì)胞中EIF4A3 mRNA 表達(dá)水平。

1. 8 Western blotting法檢測(cè)各組Neuro-2a細(xì)胞中EIF4A3 蛋白表達(dá)水平

收集各組 Neuro-2a細(xì)胞，采用BCA 法進(jìn)行蛋白定量， 恒壓60 V、30 min，恒壓100 V、90 min 電泳。采用濕法轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜條件為恒壓100 V 、90 min。快速封閉液封閉膜30 min， 用TBST 溶液清洗膜3 次， 每次10 min。加入一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，第2 天回收一抗，洗膜3 次， 二抗室溫孵育60 min， 洗膜3 次， 采用化學(xué)發(fā)光試劑顯影。于相對(duì)分子質(zhì)量49 000 處出現(xiàn)一條特異性條帶，表明EIF4A3 蛋白在Neuro-2a 細(xì)胞中成功表達(dá)。采用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，以β-actin 為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/β-actin 蛋白條帶灰度值。

1. 9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用 Graphpad Prism 6. 0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組細(xì)胞中EIF4A3 mRNA和蛋白表達(dá)水平符合正態(tài)分布， 以-x±s 表示， 多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間樣本均數(shù)兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。以Plt;0. 05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2. 1 EIF4A3 shRNA 慢病毒載體的構(gòu)建

將測(cè)序成功的DNA 序列與設(shè)計(jì)的EIF4A3 序列比較， 二者DNA 序列完全匹配， 表明EIF4A3 序列成功連接至GV493 載體中， 測(cè)序結(jié)果提示成功構(gòu)建GV493-EIF4A3 慢病毒載體。見(jiàn)圖2。

2. 2 EIF4A3 shRNA慢病毒感染 Neuro-2a細(xì)胞并建 立 穩(wěn) 定 轉(zhuǎn) 染 細(xì) 胞 系

將 GV493 空 載 質(zhì) 粒 和GV493-EIF4A3 shRNA 重組質(zhì)粒分別與輔助質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染HEK293T 細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察可見(jiàn)HEK293T 細(xì)胞熒光表達(dá)強(qiáng)烈，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，慢病毒包裝成功。見(jiàn)圖3 和4。GV493 對(duì)照慢病毒和GV493-EIF4A3-shRNA慢病毒滴度均為2×108 TU·mL－1。熒光顯微鏡下觀察可見(jiàn)GV493 對(duì)照組和GV493-EIF4A3 shRNA組Neuro-2a 細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好且表達(dá)綠色熒光，表明慢病毒感染穩(wěn)定細(xì)胞系構(gòu)建成功。見(jiàn)圖5。

2. 3 各組 Neuro-2a細(xì)胞中 EIF4A3 mRNA表達(dá)水平

與空白組（1. 00±0. 09） 和GV493 對(duì)照組（0. 78±0. 08） 比 較， GV493-EIF4A3 shRNA 組Neuro-2a 細(xì)胞中EIF4A3 mRNA 表達(dá)水平（0. 49±0. 10） 明顯降低（Plt;0. 01）。

2. 4 各組 Neuro-2a 細(xì)胞中 EIF4A3 蛋白表達(dá)水平

Western blotting 法檢測(cè)結(jié)果顯示：各組在相對(duì)分子質(zhì)量49 000處均出現(xiàn)特異性條帶，提示Neuro-2a細(xì)胞中EIF4A3 蛋白表達(dá)成功。與空白組（1. 05±0. 11） 和 GV493 對(duì)照組 （0. 78±0. 07） 比 較，GV493-EIF4A3 shRNA 組Neuro-2a 細(xì)胞中EIF4A3蛋白表達(dá)水平（0. 35±0. 09） 明顯降低（Plt;0. 01）。見(jiàn)圖6。

3 討 論

顱內(nèi)動(dòng)脈粥樣硬化是全身動(dòng)脈粥樣硬化的一部分，可引起暫時(shí)性腦缺血發(fā)作、腦卒中和血管性癡呆等腦血管疾病。盡管不同部位的動(dòng)脈粥樣硬化病變程度并不平行，但晚期顱內(nèi)動(dòng)脈粥樣硬化的病變程度與顱外動(dòng)脈粥樣硬化的病變程度相似［15］。顱內(nèi)動(dòng)脈粥樣硬化是一種終生全身性和進(jìn)行性疾病，是全世界缺血性卒中發(fā)生的主要原因。顱內(nèi)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展涉及內(nèi)皮功能障礙、炎癥、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡等多種機(jī)制［16］。

研究［17-18］ 顯示：EIF4A3 與動(dòng)脈粥樣硬化疾病的發(fā)生發(fā)展密切關(guān)聯(lián)。hsa_circ_0030042 通過(guò)靶向EIF4A3 調(diào)節(jié)異常自噬并保護(hù)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性［13］。環(huán)狀泛素特異性肽酶9×-連鎖基因（circubiquitinspecific peptidase 9×-linked gene， circ-USP9×） 可與細(xì)胞質(zhì)中的EIF4A3 蛋白結(jié)合， 并與其相互作用。此外， EIF4A3 的過(guò)表達(dá)消除了circ-USP9× 敲低誘導(dǎo)的氧化修飾低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein， ox-LDL） 處理的hUVECs 焦亡。研究［17］ 顯示：circ-USP9×通過(guò)海綿作用抑制EIF4A3 的功能從而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞焦亡。細(xì)胞焦亡是一種炎癥性細(xì)胞死亡。與細(xì)胞凋亡和壞死不同，細(xì)胞焦亡的特征是細(xì)胞膜破裂，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物釋放，從而激活炎癥反應(yīng)。內(nèi)皮焦亡也是動(dòng)脈粥樣硬化的重要病理機(jī)制［18］。研究［15］ 證實(shí)： EIF4A3 蛋白誘導(dǎo)的circ_0086296 通過(guò)miR-576-3p/IFIT1/STAT1 通路反饋回路加重了hUVECs 的動(dòng)脈粥樣硬化病變表型。因此，EIF4A3 可能是動(dòng)脈粥樣硬化治療的靶標(biāo)。提示EIF4A3 可能在顱內(nèi)動(dòng)脈粥樣硬化形成和發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

Neuro-2a 細(xì)胞具有神經(jīng)細(xì)胞特性，生長(zhǎng)繁殖速度快，被廣泛用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面的研究［19-20］。但目前尚未見(jiàn)EIF4A3 蛋白在Neuro-2a 細(xì)胞系中構(gòu)建缺血缺氧疾病模型的報(bào)道， 因此本研究選用Neuro-2a 細(xì)胞作為病毒感染和觀察的研究對(duì)象。本研究結(jié)果顯示：GV493-EIF4A3 慢病毒表達(dá)載體成功構(gòu)建，并成功感染Neuro-2a 細(xì)胞，Neuro-2a 細(xì)胞中EIF4A3 mRNA 和蛋白成功表達(dá)。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建GV493-EIF4A3 慢病毒表達(dá)載體， 建立了穩(wěn)定感染shRNA GV493-EIF4A3 慢病毒的Neuro-2a 細(xì)胞系， 為EIF4A3 在顱內(nèi)動(dòng)脈粥樣硬化中的作用機(jī)制研究提供了參考。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：何嘉文參與論文設(shè)計(jì)、撰寫(xiě)和修改，廖科棋參與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的獲取和分析，李友和李勝男參與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

[參考文獻(xiàn)]

［1］ MCMAHON J J， MILLER E E， SILVER D L. Theexon junction complex in neural development andneurodevelopmental disease［J］. Int J Dev Neurosci，2016， 55： 117-123.

［2］ MAZLOOMIAN A， ARAKI S， OHORI M， et al.Pharmacological systems analysis defines EIF4A3functions in cell-cycle and RNA stress granuleformation［J］. Commun Biol， 2019， 2： 165.

［3］ FERRAIUOLO M A ， LEE C S ， LER L W ， et al.A nuclear translation-like factor eIF4A Ⅲ is recruited tothe mRNA during splicing and functions in nonsensemediateddecay［J］. Proc Natl Acad Sci U S A， 2004，101（12）： 4118-4123.

［4］ FUKAO A， MISHIMA Y， TAKIZAWA N， et al.MicroRNAs trigger dissociation of eIF4AⅠ and eIF4AⅡfrom target mRNAs in humans［J］. Mol Cell， 2014，56（1）： 79-89.

［5］ GALICIA-VáZQUEZ G， CHU J， PELLETIER J.eIF4A Ⅱ is dispensable for miRNA-mediated genesilencing［J］. RNA， 2015， 21（10）： 1826-1833.

［6］ WEI Y T， LU C F， ZHOU P， et al. EIF4A3-inducedcircular RNA ASAP1 promotes tumorigenesis andtemozolomide resistance of glioblastoma via NRAS/MEK1/ERK1-2 signaling［J］. Neuro Oncol， 2021，23（4）： 611-624.

［7］ YANG C J， HAWKINS K E， DORé S， et al.Neuroinflammatory mechanisms of blood-brain barrierdamage in ischemic stroke ［J］. Am J Physiol CellPhysiol， 2019， 316（2）： C135-C153.

［8］ LIU Y C， SONG J， ZHANG H W， et al. EIF4A3-induced circTOLLIP promotes the progression ofhepatocellular carcinoma via the miR-516a-5p/PBX3/EMT pathway［J］. J Exp Clin Cancer Res， 2022，41（1）： 164.

［9］ ZHANG S X， LENG T Y， ZHANG Q， et al.Sanguinarine inhibits epithelial ovarian cancerdevelopment via regulating long non-coding RNACASC2-EIF4A3 axis and/or inhibiting NF- κB signalingor PI3K/AKT/mTOR pathway ［J］. BiomedPharmacother， 2018， 102： 302-308.

［10］SUI X Z， WANG Y C， LIU H. hsa_circ_0101119facilitates the progression of cervical cancer via aninteraction with EIF4A3 to inhibit TCEAL6expression［J］. Mol Med Rep， 2021， 24（3）： 654.

［11］LAFFONT I， TAKAHASHI M， SHIBUKAWA Y，et al. Apolipoprotein E activates Akt pathway in neuro-2ain an isoform-specific manner［J］. Biochem Biophys ResCommun， 2002， 292（1）： 83-87.

［12］LI Y S， REN S H， XIA J W， et al. EIF4A3-inducedcirc-BNIP3 aggravated hypoxia-induced injury of H9c2cells by targeting miR-27a-3p/BNIP3［J］. Mol TherNucleic Acids， 2020， 19： 533-545.

［13］YU F P， ZHANG Y， WANG Z Z， et al. Hsa_circ_0030042 regulates abnormal autophagy and protectsatherosclerotic plaque stability by targeting eIF4A3［J］.Theranostics， 2021， 11（11）： 5404-5417.

［14］ZHANG M， ZHU Y Q， ZHU J， et al. circ_0086296induced atherosclerotic lesions via the IFIT1/STAT1feedback loop by sponging miR-576-3p［J］. Cell MolBiol Lett， 2022， 27（1）： 80.

［15］RITZ K， DENSWIL N P， STAM O C G， et al. Causeand mechanisms of intracranial atherosclerosis ［J］.Circulation， 2014， 130（16）： 1407-1414.

［16］WANG Y， MENG R， LIU G， et al. Intracranialatherosclerotic disease［J］. Neurobiol Dis， 2019， 124：118-132.

［17］XU S K， GE Y S， WANG X B， et al. Circ-USP9Xinteracts with EIF4A3 to promote endothelial cellpyroptosis by regulating GSDMD stability inatherosclerosis［J］. Clin Exp Hypertens， 2023， 45（1）：2186319.

［18］YANG H Z， YANG W C， DAI W Q， et al.LINC00667 promotes the proliferation， migration， andpathological angiogenesis in non-small cell lung cancerthrough stabilizing VEGFA by EIF4A3［J］. Cell BiolInt， 2020， 44（8）： 1671-1680.

［19］LAM M， SANOSAKA T， LUNDIN A， et al. Singlecellstudy of neural stem cells derived from human iPSCsreveals distinct progenitor populations with neurogenicand gliogenic potential［J］. Genes Cells， 2019， 24（12）：836-847.

［20］MATSUI T K， TSURU Y， HASEGAWA K， et al.Vascularization of human brain organoids ［J］. StemCells， 2021， 39（8）： 1017-1024.

[基金項(xiàng)目] 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81571157）；廣東省衛(wèi)生廳醫(yī)學(xué)科研基金項(xiàng)目（A2022139，A2023193）；湛江市科學(xué)技術(shù)局科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（2021B01370）