慢性避水應激法建立大鼠腸易激綜合征模型及其評價

［摘 要］ 目的：探討慢性避水應激 （WAS） 法建立腸易激綜合征 （IBS） 大鼠模型的方法，并評價其可行性。方法：30只雄性清潔型Wistar大鼠，隨機分為對照組 （n=10） 和模型組 （n=20），模型組大鼠每日采用WAS 法誘導1 h，連續(xù)干預造模10 d；對照組大鼠不進行任何干預。造模結束后，觀察并記錄2 組大鼠一般情況和體質(zhì)量，采用高架十字迷宮（EPM） 實驗檢測2 組大鼠進入開放臂次數(shù)（OE） 百分率和進入開放臂時間（OT） 百分率，腹壁撤回反射（AWR） 實驗檢測2 組大鼠內(nèi)臟敏感性，心電圖檢查2 組大鼠心率變異性（HRV），腹外斜肌肌電圖（EMG） 檢測2 組大鼠結直腸痛敏閾值，多通道生理信號記錄儀檢測2組大鼠結腸慢波頻率。結果：2組大鼠在整個造模期間均無死亡情況，造模結束后，模型組大鼠均伴有精神狀態(tài)欠佳、自主活動減少、少動、皮毛散亂且無光澤、易激惹和肛門口不凈等情況；對照組大鼠精神狀態(tài)、自主活動、皮毛和肛周無明顯變化。與對照組比較，模型組大鼠體質(zhì)量明顯降低（Plt;0. 05）。EPM 實驗，與對照組比較，模型組大鼠OE 百分率和OT 百分率均明顯降低（Plt;0. 01）。AWR 實驗，模型組中AWR 半定量評分≥3 分大鼠共12 只，內(nèi)臟痛大鼠模型造模成功率為60%。與對照組比較，模型組大鼠低頻信號（LF） 和LF/高頻信號（HF） 比值均明顯升高（Plt;0. 01），HF 明顯降低（Plt;0. 05）。EMG 法，與對照組比較，模型組大鼠結腸痛敏閾值明顯降低 （Plt;0. 01），結腸慢波頻率明顯升高 （Plt;0. 01）。結論：采用WAS法建立IBS大鼠模型，大鼠行為及精神情緒改變、內(nèi)臟敏感性升高、結腸慢波頻率加快和自主神經(jīng)系統(tǒng)平衡性紊亂，WAS 法可作為一種有效的造模方式，用于觀察和評價IBS 治療的相關藥物及干預方法。

［關鍵詞］ 腸易激綜合征； 行為學； 內(nèi)臟高敏感性； 結腸功能； 自主神經(jīng)系統(tǒng)平衡性

［中圖分類號］ R574.4 ［文獻標志碼］ A

腸易激綜合征（irritable bowel syndrome，IBS） 是臨床常見慢性胃腸道功能紊亂疾病，發(fā)病原因可能與腸動力異常、內(nèi)臟感知異常和精神心理刺激等有關。臨床主要表現(xiàn)為腹痛、大便性狀和排便習慣改變等腸道癥狀，并伴有心悸、頭痛、抑郁和焦慮等腸外表現(xiàn)及精神癥狀［1-2］。IBS 的發(fā)病機制尚未完全闡明，但越來越多的證據(jù)［3-5］ 表明IBS是一種生物-心理-社會障礙， 與抑郁或焦慮共病。IBS 病因和病理過程較為復雜，且臨床治療無特效藥物，近年來開展了大量基礎性研究，而基礎研究的實驗結果在較大程度上取決于動物病理模型的復制。IBS 是生物學、心理學和社會學等多因素及多學科之間復雜的相互作用所致，目前IBS 動物模型的建立多采用2 種或多種因素聯(lián)合制備，多因素的造模方法能夠更多地模擬IBS 的臨床表現(xiàn)及其他發(fā)病因素［6-7］， 但IBS 動物模型建立過程中模擬刺激致病因素的數(shù)量有待進一步實驗驗證。應激反應分為急性和慢性應激，急性應激由于僅對結腸動力和感覺等部分癥狀進行描述，無法模擬IBS 臨床患者癥狀表現(xiàn)的慢性過程，因此應用較少［8-9］。慢性避水應激（water avoidance stress， WAS） 造模方法為自然致病因素誘導，重復性較好且簡單易行。本研究模擬IBS 患者臨床癥狀建立大鼠IBS 模型，闡明IBS 的發(fā)病機制，為IBS 干預治療的藥物和方法研究提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 實驗動物、主要試劑和儀器

雄性清潔級Wistar 大鼠30 只， 體質(zhì)量（200±20） g， 購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司， 動物生產(chǎn)許可證號：SCXK （魯） 2019-0003。于清潔級實驗室中飼養(yǎng)，保持室內(nèi)安靜，室內(nèi)溫度為（22±2） ℃，室內(nèi)相對濕度為 35%～40%，12 h/12 h 晝夜節(jié)律循環(huán)，黑夜時間水和食物均可自由攝取。實驗開始前，大鼠于標準實驗環(huán)境中適應性飼養(yǎng)7 d，不予任何刺激。本實驗獲得實驗動物福利倫理審查委員會批準（批準號：SDUTCM20200620001）。戊巴比妥鈉購自合肥巴斯夫生物科技有限公司，液體石蠟購自生工生物工程（上海） 股份有限公司，甘油購自上海北諾生物科技有限公司，75% 乙醇購自山東利爾康醫(yī)療科技股份有限公司，生理鹽水購自山東魯抗辰欣藥業(yè)有限公司。高架十字迷宮（elevated plus maze，EPM） 購自上海欣軟信息科技有限公司，華佗牌針灸針購自蘇州醫(yī)療用品廠有限公司，1. 5 mL 針頭購自北京天厚醫(yī)療器械有限公司，Powerlab 實驗數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)購自澳大利亞AD Instruments 公司。

1. 2 實驗動物分組和造模

實驗按照隨機化分組原則， 將大鼠分為對照組（n=10） 和模型組（n=20）。模型組大鼠采用WAS 法［10］， 實驗設備由透明收納箱（50 cm×35 cm×30 cm）和自制鐵盒平臺（18 cm×10 cm×7 cm） 組成，鐵盒放置于收納箱中間底部， 向透明收納箱注入室溫水（22 ℃±2 ℃）， 注入水的高度距離鐵盒平臺1 cm， 將大鼠放置于鐵盒平臺上避水應激1 h，連續(xù)干預造模10 d，干預造模時間為每日上午8：00～9：00；對照組大鼠置于無水觀察箱內(nèi)，不做任何干預。見圖1。

1. 3 檢測2組大鼠一般情況和體質(zhì)量

WAS法造模過程中，每日觀察大鼠的精神和自主活動、皮毛色情況及大鼠應對外界刺激的反應等一般情況。每日上午7：00 檢測所有大鼠體質(zhì)量并記錄。

1. 4 EPM 實驗檢測 2 組大鼠進入開放臂次數(shù)（open arm entry，OE）百分率和進入開放臂時間（open arm time，OT）百分率

造模前和造模結束后，對每只大鼠進行EPM 實驗。實驗開始前，需撫摸大鼠2～3 min，減少抓握帶來的應激。實驗開始時，需手持大鼠，使其背對實驗人員，將其放置在開臂和閉臂的結合處中心區(qū)域，使大鼠面對開放臂，且同一實驗所有大鼠需要面對同一開放臂。放置好大鼠后，實驗人員迅速遠離，大鼠進入EPM的同時，另一名實驗人員觀察視頻，記錄5 min 內(nèi)大鼠在EPM 內(nèi)的活動情況。檢測指標： ① OE；② OT； ③ 進入閉臂次數(shù)（close arm entry， CE）；④ 進入閉臂時間（close arm time， CT）。 計算OE 百分率和OT 百分率。OE=OE/（OE+CE）×100%；OT=OT/ （OT+CT） ×100%。

1. 5 腹壁撤回反射（abdominal withdrawal reflex，AWR）實驗檢測2組大鼠內(nèi)臟敏感性

大鼠行為學實驗結束后第2 天，對模型組大鼠進行AWR 半定量評分［11］。實驗開始前，為了減少大鼠糞便形成，大鼠禁食不禁水12 h，用自制的球囊在石蠟潤滑后經(jīng)導管緩慢置入直腸，深度為6～7 cm。大鼠置于透明并內(nèi)部空間相對狹窄的觀察箱，導管另一端使用三通管分別連接血壓計和注射器，待大鼠在透明箱內(nèi)適應并平靜后，通過注射器緩慢向氣囊注入空氣， 給予大鼠直腸恒壓40 mmHg （1 mmHg=0. 133 kPa） 刺激， 觀察大鼠行為反應情況， 間隔5 min 后給予下一次刺激；每次刺激強度重復3 次，取平均值計算AWR 評分。AWR 評分≥3 分判定大鼠內(nèi)臟痛模型制備成功。

按照參考文獻［11］ 中AWR 評分標準：對結腸擴張刺激無行為反應，評為0 分；給予刺激后大鼠有動作停頓并見短暫的頭部運動行為， 評為1 分；刺激期間大鼠有腹部肌肉的收縮，評為2 分；刺激期間大鼠有腹部抬起行為，評為3 分；刺激期間大鼠身體拱起，并抬起盆腔和陰囊者，評為4 分。

1. 6 心電圖檢查 2 組大鼠心率變異性（heart ratevariability，HRV）

AWR 評分后次日對2 組大鼠進行心電圖檢查。大鼠腹腔注射1% 戊巴比妥鈉進行輕度麻醉，待大鼠麻醉后將其取仰臥位，將大鼠固定在手術臺上，采用1 寸針灸針分別插入雙下肢和右上肢皮下，再將心電圖電極連接對應針灸針，待心電圖波形穩(wěn)定后， 采用Powerlab 系統(tǒng)記錄大鼠標準Ⅱ?qū)?lián)的心電圖， 并分析2 組大鼠HRV 中低頻信號（low frequency， LF） 和高頻信號（highfrequency，HF） 特征。

1. 7 腹外斜肌肌電圖（electromyography，EMG）檢測 2組大鼠結直腸痛敏閾值

心電圖檢查完成后，沿大鼠腹正中線與髂前上棘連線處進行常規(guī)消毒，剪刀行縱向切口剪開皮膚并剝離開皮下脂肪，完全暴露腹直肌。將2 根電極絲植入到距腹正中線1. 5 cm 處。再將氣囊經(jīng)大鼠肛門插入6～7 cm 處，固定大鼠尾部和導管。向氣囊緩慢注氣后，通過置于腹直肌的2 根電極引出肌電信號， 通過放大器和AD 信號轉(zhuǎn)換器連接電腦Powerlab 數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)，觀察并記錄2 組大鼠結直腸痛敏閾值。腹直肌結直腸擴張刺激時腹直肌放電明顯增加，大鼠腹部肌肉收縮，標記此時結直腸擴張壓力值即為結直腸痛敏閾值（mmHg）。

1. 8 多通道生理信號記錄儀檢驗 2組大鼠結腸慢波頻率

EMG法檢測結束后，大鼠深度麻醉，剪開腹部肌肉，暴露盲腸部，在距大鼠盲腸1～2 cm 處，即近端結腸植入一對平行電極， 使結腸段的2 根電極相距 3～5 mm， 2 根電極絲連接多通道生理信號記錄儀， 結腸慢波波形穩(wěn)定 30 min 后， 連續(xù)記錄 2 h。 采用 Powerlab 數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)， 每3 min 為一個時間段，分析 2 組大鼠結腸慢波頻率（次·min－1）。

1. 9 統(tǒng)計學分析

采用 GraphPad Prism 9. 0軟件進行統(tǒng)計學分析并繪制圖像。2 組大鼠OT 百分率、結腸慢波頻率和HRV 中LF 均符合正態(tài)分布且方差齊，以-x±s 表示，2 組間樣本均數(shù)比較采用兩獨立樣本t 檢驗；2 組大鼠OE 百分率、結腸痛敏閾值、HRV 中HF 和LF/HF 比值符合正態(tài)分布但方差不齊，以中位數(shù)（四分位數(shù)）［M （P25，P75）］ 表示，2 組間比較采用非參數(shù)檢驗。以Plt;0. 05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2. 1 2組大鼠一般情況和體質(zhì)量

2組大鼠在整個造模期間均無死亡情況，造模前2 組大鼠精神狀態(tài)良好，自主活動較好，毛色光亮，口眼爪甲和肛周較為清潔。造模結束后，模型組大鼠均伴有精神狀態(tài)欠佳、自主活動減少、少動、皮毛散亂且無光澤、易激惹和肛門口不凈等情況；對照組大鼠精神狀態(tài)、自主活動、皮毛和肛周無明顯變化。造模結束后，與對照組（253. 3 g±6. 47 g） 比較，模型組大鼠體質(zhì)量（243. 8 g±6. 91 g） 明顯降低（Plt;0. 05）。

2. 2 2組大鼠OE百分率和OT百分率

與對照組（46. 18%±3. 49% 和43. 28%±5. 56%） 比較， 模型組大鼠OE 百分率（19. 41%±10. 90%） 和OT 百分率（18. 03%±3. 58%） 均明顯降低（Plt;0. 01）。見圖2。

2. 3 2組大鼠內(nèi)臟敏感性和HRV

模型組中AWR半定量評分≥3 分大鼠共12 只，內(nèi)臟痛大鼠模型造模成功率為60%。與對照組比較， 模型組大鼠HRV 中LF 和LF/HF 比值均明顯升高（Plt;0. 01），HF 明顯降低（Plt;0. 05）。見表1。

2. 4 2 組 大 鼠 結 直 腸 痛 敏 閾 值

與 對 照 組（114. 70 mmHg±15. 68 mmHg） 比較， 模型組大鼠結腸痛敏閾值（63. 00 mmHg±5. 60 mmHg） 明顯降低（Plt;0. 01）。見圖3。

2. 5 2組大鼠結腸慢波頻率

與對照組［（8. 34±1. 86） min－1］ 比較， 模型組大鼠結腸節(jié)律發(fā)生紊亂，結腸慢波頻率［（12. 02±1. 06） min－1］ 明顯升高（Plt;0. 01）。

3 討 論

IBS 動物模型是分別以中樞（社會和心理因素） 和外周（感染和腸道炎癥） 為靶點制備的動物模型，包括結直腸擴張刺激模型、慢性束縛應激模型、母嬰分離刺激模型、理化刺激模型、食物過敏模型、多因素精神刺激模型和轉(zhuǎn)基因模型等［12-13］。在多種造模方法中，單因素或多因素聯(lián)合制備均存在優(yōu)勢和不足，與IBS 患者真實的臨床過程和結腸的病理特征存在一定差異［14］。有研究［15-16］ 采用WAS 法制備IBS 動物模型，僅從神經(jīng)生物學角度分析IBS 動物模型結腸運動和感覺異常的原因。何蘇月等［17］ 研究發(fā)現(xiàn)： WAS 誘導 IBS 大鼠模型，大鼠結腸組織中機械門控Piezo1 離子通道被激活，導致IBS 模型大鼠結腸運動和感覺異常。余光等［18］研究發(fā)現(xiàn)：WAS 法誘導大鼠 10 d 后，IBS 模型大鼠血清P 物質(zhì)（substance P，SP） 水平和結腸肌層結腸神經(jīng)激肽/速激肽1 受體（neurokinin 1receptor，NK1R） 表達均存在異常，引起結腸動力的改變。

IBS 患者臨床癥狀包括內(nèi)臟敏感性和腸道功能異常，同時也伴有精神心理的異常，三者之間存在復雜的病理生理學關系［19-20］。IBS 的形成過程中，長期心理應激狀態(tài)與IBS 的發(fā)生發(fā)展密切相關。EPM 可用于評估動物內(nèi)在心理、外在情緒和行為，多數(shù)研究［21-22］ 采用OT 百分率和OE 百分率作為焦慮動物模型是否制備成功的評價指標。本研究結果顯示： WAS 實驗后， IBS 模型大鼠OT 百分率和OE 百分率明顯降低，活躍程度降低，情緒心理行為發(fā)生改變，與IBS 臨床中患者伴有情緒異常的癥狀相似。

本研究采用結直腸擴張刺激時的AWR 半定量評分及結腸痛敏閾值作為對建立的IBS 大鼠模型內(nèi)臟敏感性評價的核心指標。結直腸擴張刺激有助于評估內(nèi)臟敏感性，在基礎實驗中被廣泛應用［23-24］。但由于AWR 半定量評分具有主觀性， 因此采用EMG 法檢測大鼠結腸痛敏閾值，可以更加客觀地評估大鼠內(nèi)臟敏感性［25］。本研究結果顯示： 模型組大鼠結腸痛敏閾值明顯降低，表明WAS 法可以誘導IBS 大鼠模型內(nèi)臟敏感性升高，即痛覺過敏，符合IBS 患者臨床伴有腹部疼痛或腹部不適等癥狀。

研究［26］ 顯示：胃腸道動力紊亂與慢波電脈沖異常有關。慢波是相對比較規(guī)律的一種周期性電活動， 可作為一項電生理客觀指標反映結腸功能異常［27］。本研究結果顯示： 模型組大鼠結腸收縮頻率發(fā)生異常，平均周期慢波頻率明顯升高，表明造模后的大鼠結腸慢波存在節(jié)律紊亂或者腸道收縮不協(xié)調(diào)，符合臨床上IBS 患者腸道功能異常的癥狀。

HRV 是臨床上評價自主神經(jīng)功能的重要指標，其中LF 主要反映交感神經(jīng)的興奮性， HF 反映迷走神經(jīng)的活性， LF/HF 比值反映自主神經(jīng)之間的平衡性［28-29］。本研究結果顯示：與對照組比較，模型組大鼠HRV 中LF 和LF/HF 比值均明顯升高，HF 明顯降低， 表明WAS 法可使大鼠的自主神經(jīng)系統(tǒng)平衡性受到破壞，符合臨床IBS 患者伴有自主神經(jīng)紊亂癥狀。

本研究探討WAS 誘導IBS 模型的評價方法，從IBS 模型大鼠行為學、內(nèi)臟痛敏、結腸運動功能和心率頻域的角度進行評估。提示W(wǎng)AS 誘導大鼠伴有心理情緒異常、內(nèi)臟敏感增加、結腸慢波頻率升高和自主神經(jīng)功能紊亂等情況，與現(xiàn)代醫(yī)學臨床中IBS 患者的發(fā)病因素及部分癥狀的表現(xiàn)相似。目前現(xiàn)代醫(yī)學基礎研究關于動物造模的方法中，WAS 法造模的致病因素更接近于臨床上IBS 患者的自然致病因素，造模成功率較高，并且具有造模方法操作簡單、節(jié)約時間、較高擬合度和模型安全性好等特點，適用于現(xiàn)代醫(yī)學基礎研究中動物模型的建立，可用于觀察和評價相關藥物的作用。該造模方法存在不足之處：一方面未能與已有單純評價同類型模型的研究進行比較；另一方面IBS 動物模型無法完全符合中醫(yī)實驗研究中病癥結合動物模型的條件。目前國內(nèi)研究［30-31］ 表明：病癥結合動物模型的建立更應該強調(diào)整體影響因素和注重疾病證型形成的自然狀態(tài)，而非簡單地將現(xiàn)代醫(yī)學病理與傳統(tǒng)醫(yī)學病因模型相結合。因此，建立相對成熟和穩(wěn)定性好的病癥結合動物模型且具有規(guī)范的中醫(yī)辨證標準的動物模型評價體系，不僅有助于傳統(tǒng)醫(yī)學對IBS 在生物細胞及分子水平機制的深入研究，同時又能真正地為傳統(tǒng)醫(yī)學研究和臨床應用提供真實可靠的實驗依據(jù)［32］。

綜上所述， 采用WAS 法建立IBS 大鼠模型，大鼠行為及精神情緒改變、內(nèi)臟敏感性升高、結腸慢波頻率加快和自主神經(jīng)系統(tǒng)平衡性紊亂，WAS 法可作為一種有效的造模方式，用于觀察和評價IBS治療的相關藥物及干預方法。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：劉婷婷和張擎宇參與實驗設計及實施、數(shù)據(jù)收集和統(tǒng)計分析及論文撰寫和審校，趙香順、石運來和于燕南參與實驗實施， 陳少宗參與實驗設計、論文撰寫指導和審校，王正文、馮楚文和楊添淞參與論文撰寫指導。

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[基金項目] 國家重點研發(fā)計劃項目（2019YFC1712100）；國家自然科學基金面上項目（82074539）