摘 要：廣西柑橘園酸性土壤分布廣泛、氮轉(zhuǎn)化具有特殊性，生物炭常用于該區(qū)土壤改良，然而生物炭輸入對該土壤固氮微生物群落的影響尚不清楚。該研究以廣西臍橙園酸性土壤固氮細(xì)菌群落為研究對象，通過高通量測序及生信分析發(fā)現(xiàn)該土壤中的固氮菌群落覆蓋8門15綱28目39科50屬的微生物。變形菌門在生物炭處理后相對豐度增加，OTU數(shù)目、Ace指數(shù)、Chao指數(shù)在生物炭輸入量5%的組最高，但各組間差異不顯著。PcoA分析顯示生物炭輸入顯著改變土壤固氮細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，且變化程度與生物炭輸入量有關(guān)。土壤pH、NH4+-N含量、礦化率是影響臍橙園酸性土壤固氮細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主要環(huán)境因子，固氮細(xì)菌不同種群對環(huán)境因子的響應(yīng)并不一致。

關(guān)鍵詞：臍橙；生物炭；nifH；固氮菌群落；多樣性

中圖分類號：S666 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2096-9902（2024）19-0018-04

Abstract： Biochar is commonly used for soil amendment in citrus orchards across Guangxi， where acidic soils are prevalent and nitrogen transformation is characterized by its specificity. However， the impact of biochar application on the microbial communities involved in nitrogen fixation remains unclear. This study focused on the microbial communities of nitrogen-fixing bacteria in the acidic soils of navel orange orchards in Guangxi. Through high-throughput sequencing and bioinformatics analysis， it was found that the nitrogen-fixing microbial community in these soils encompasses 50 genera within 39 families， 28 orders， 15 classes， and 8 phyla. The relative abundance of Proteobacteria increased following biochar treatment， and the highest OTU numbers， Ace index， and Chao index were observed in the group with a 5% biochar input， although differences in diversity indices among groups were not significant. PcoA and NMDS analyses demonstrated that biochar application significantly altered the structure of the soil nitrogen-fixing bacterial community， with the degree of change being related to the amount of biochar added. Soil pH， NH4+-N content， and mineralization rate were identified as the main environmental factors influencing the structure of the nitrogen-fixing bacterial community in the acidic soils of navel orange orchards， with different populations of nitrogen-fixing bacteria responding differently to environmental factors.

Keywords： navel orange; biochar; nifH; nitrogen-fixing microbial community; diversity

臍橙在我國種植面積大，存在氮肥用量大和土壤酸化問題。生物炭可以通過改變參與氮轉(zhuǎn)化過程的土壤微生物的數(shù)量和結(jié)構(gòu)來改變土壤氮循環(huán)[1]。在酸性土壤中，生物炭能提升土壤肥力、臍橙產(chǎn)量和品質(zhì)[2]。固氮菌是可以將空氣中的氮?dú)猓∟2）轉(zhuǎn)化為活性氮的土壤微生物，其固氮作用是土壤氮循環(huán)的重要組成部分，有助于土壤中植物有效氮的積累，最大程度地減少農(nóng)業(yè)無機(jī)氮肥的使用[3]。然而，生物炭輸入對臍橙園土壤微生物固氮過程的影響目前仍不清楚。本研究以廣西臍橙園酸性土壤為研究對象，系統(tǒng)研究不同量生物炭輸入條件下土壤固氮菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的差異特征及與環(huán)境因子的關(guān)系。為臍橙園酸化土壤改良及驅(qū)動機(jī)制提供參考，為深入了解和調(diào)控臍橙園酸性土壤固氮菌群落提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 土壤與生物炭準(zhǔn)備

試驗(yàn)用土壤采集于廣西壯族自治區(qū)賀州市富川縣。在臍橙樹滴水線4個方向分別采集0～20 cm 土壤并混勻。去除樹根和石頭后過2 mm土壤篩，用于土壤培育。生物炭購自河南弘之源凈水材料有限公司。該生物炭為黑色粉末狀，pH約8.35，有機(jī)碳771.90 g·kg-1，全氮1.50 g·kg-1。

1.2 土壤培育試驗(yàn)

土壤培育設(shè)5個處理，生物炭添加量分別為0（CK），1%（B1），2%（B2），5%（B3），10%（B4）。各處理3次重復(fù)。稱取相當(dāng)于25 g干土的土壤/土壤-生物炭混合物置于培養(yǎng)瓶中，用去離子水調(diào)整培養(yǎng)土含水量為80%WHC。每瓶用帶6針孔封口膜封口靜置，于27 ℃生化培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)28 d，每2 d稱重法補(bǔ)充水分。

1.3 測定方法

1.3.1 土壤參數(shù)的測定

在0、7、14、28 d取土樣置于-80 ℃保存，用于測定土壤理化參數(shù)及nifH基因多樣性。其中，土壤和生物炭的pH、有機(jī)碳、全氮、銨態(tài)氮（NH4+-N）和硝態(tài)氮（NO3--N）委托廣西西大檢測有限公司測定。通過 DNeasy Power Soil 土壤DNA提取試劑盒（QIAGEN，美國）、提取土壤DNA。氣相色譜儀（Agilent7890B，美國）測定培養(yǎng)瓶中N2O的濃度計算N2O排放速率。

1.3.2 nifH基因高通量測序

土壤微生物總DNA提取后，使用nifH基因引物（nifH-F：5′-AAAGGYGGWATCGGYAARTCCACCAC-3′和nifH-R：5′-TTGTTSGCSGCRTACATSGCCATCAT-3′）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit建庫，MiseqPE300平臺測序。測序得到的PE reads首先根據(jù)overlap關(guān)系進(jìn)行拼接，同時對序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控和過濾，區(qū)分樣本后進(jìn)行OTU聚類分析和物種分類學(xué)注釋，在各個分類水平上采用Shannon、Chao、Coverage和Ace指數(shù)對固氮菌群落結(jié)構(gòu)多樣性進(jìn)行分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

高通量測序結(jié)果通過上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司生信云平臺提供的軟件完成。

2 結(jié)果

2.1 生物炭輸入對固氮菌群落組成的影響

nifH基因高通量測序所得有效序列按最小樣本序列抽平后共劃分OTU 2 425條，注釋結(jié)果顯示該臍橙園酸性土壤含有nifH基因的固氮菌群落共有8門15綱28目39科50屬（圖1）。在門水平上，norank_d__Bacteria在生物炭輸入組中高于對照組，unclassified_d__Unclassified和Firmicutes在生物炭輸入量為1%、2%、5%的組中高于對照組。屬水平TOP5的優(yōu)勢屬包括細(xì)菌門未分類屬（unclassified_k__norank_d__Bacteria）、α-變形菌綱未分類屬（unclassified_c__Alphaproteobacteria）、根瘤菌目未分類屬（unclassified_o__Rhizobiales）、變形菌門未分類屬（unclassified_p__Proteobacteria）和γ-變形菌綱未分類屬（unclassified_c__Gammaproteobacteria）。其中，unclassified_p__Proteobacteria和unclassified_c__Gammaproteobacteria隨著生物炭輸入量增加呈雙峰增長趨勢，生物炭輸入量為5%時相對豐度最低，各組間差異顯著。

2.2 生物炭輸入對固氮菌群落α多樣性的影響

生物炭輸入土壤并培育28 d后，對照組（afterCK）土壤固氮細(xì)菌OTU數(shù)量最低，生物炭輸入量為2%（afterB2）時OTU數(shù)量最高。生物炭處理前后共有固氮細(xì)菌OUT數(shù)量為277條，生物炭輸入不同處理組特有的固氮細(xì)菌OTU數(shù)量由多到少排序?yàn)锽2（207）、B4（167）、B1（157）、B3（153）、CK（101）。生物炭輸入后引起了不同種類土壤固氮細(xì)菌相對豐度的變化。生物炭輸入不同處理組間土壤固氮細(xì)菌α多樣性指數(shù)反應(yīng)了各組間OTU的豐富度和均勻度（圖2）。培育后輸入量為2%的afterB2組固氮細(xì)菌OTU豐富度和均勻度都較高，α多樣性最大，但組間差異不顯著。

2.3 生物炭輸入對固氮細(xì)菌群落β多樣性的影響

主坐標(biāo)分析（PCoA）表明生物炭輸入量超過5%后，固氮細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化較大，土壤培育前后固氮細(xì)菌群落發(fā)生了一定的變化，組間差異均極顯著，表明生物炭輸入改變了臍橙園酸性土壤固氮細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，且變化程度與生物炭輸入量有關(guān)（圖3（a））。

2.4 固氮細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子的關(guān)系

固氮細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與土壤環(huán)境因子的冗余分析（RDA）結(jié)果（圖3（b））表明，RDA1和RDA2分別解釋固氮菌群落變異的49.58%和11.18%，共解釋總變異的60.76%。土壤pH、NH4+-N含量、礦化率與土壤固氮菌群落排列正相關(guān)，NO3--N含量、N2O排放速率、硝化率與土壤固氮菌群落結(jié)構(gòu)負(fù)相關(guān)。其中，pH是影響臍橙園酸性土壤固氮細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的最主要環(huán)境因子（pH=0.016）。固氮細(xì)菌不同種群對環(huán)境因子的響應(yīng)并不一致，具有各自的生態(tài)位。

3 討論

變形菌門的相對豐度在一定程度上反映土壤有機(jī)質(zhì)等養(yǎng)分含量的多少，且在pH較高的土壤中生長較好[4]。本研究中變形菌門相對豐度以生物炭輸入量為5%的處理最高，可能與土壤有機(jī)碳含量及pH較高有關(guān)。固氮細(xì)菌不同分類水平對環(huán)境因子的響應(yīng)并不一致，同門不同屬細(xì)菌具有各自的生態(tài)位。本研究發(fā)現(xiàn)2%生物炭處理時，土壤培育后固氮細(xì)菌的OTU數(shù)量和多樣性指數(shù)最高。這可能表明存在一個最優(yōu)的生物炭輸入量，能夠最大化促進(jìn)固氮細(xì)菌的多樣性。本結(jié)果表明冗余分析能夠有效地解釋臍橙園酸性土壤固氮細(xì)菌群落大部分的變異（60.76%），揭示了土壤環(huán)境因子對固氮菌群落結(jié)構(gòu)的影響，并發(fā)現(xiàn)土壤pH是影響固氮細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的最主要環(huán)境因子之一，是微生物活性和多樣性的關(guān)鍵調(diào)控因素。生物炭輸入提高了臍橙園酸性土壤pH，增加了屬水平根瘤菌、α-變形菌、慢生根瘤菌相對豐度。

氮素形態(tài)也是影響固氮細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的重要因素，研究發(fā)現(xiàn)NH4+-N與固氮細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)正相關(guān)，而NO3--N與之負(fù)相關(guān)，這種情況可能是因?yàn)楦邼舛鹊腘O3--N對某些固氮細(xì)菌具有毒性，或者是因?yàn)橄趸^程增加了土壤中的氧氣濃度，從而抑制了厭氧或微氧環(huán)境中某些固氮細(xì)菌的活性。

總之，生物炭輸入顯著改變了臍橙園酸性土壤固氮細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，且變化程度與生物炭輸入量有關(guān)。土壤固氮細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)和功能受到多種土壤環(huán)境因子的綜合影響，不同種群對環(huán)境因子的響應(yīng)各不相同[5]。這種多樣性和復(fù)雜性是固氮細(xì)菌群落適應(yīng)環(huán)境變化、維持生態(tài)系統(tǒng)功能的關(guān)鍵因素。了解這種復(fù)雜的相互作用對于預(yù)測和調(diào)控環(huán)境變化對固氮過程的影響、制定有效的土壤管理策略以促進(jìn)固氮和提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力至關(guān)重要。

4 結(jié)論

該土壤中的固氮菌群落覆蓋了8門15綱28目39科50屬的微生物。變形菌門在生物炭處理后相對豐度增加，但各組間差異不顯著。生物炭輸入顯著改變了土壤固氮細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，土壤pH、NH4+-N含量、礦化率是影響臍橙園酸性土壤固氮細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主要環(huán)境因子。

參考文獻(xiàn)：

[1] XIAO Z， RASMANN S， YUE L， et al. The effect of biochar amendment on N-cycling genes in soils： A meta-analysis[J].The Science of the total environment，2019（696）：133984.

[2] 蔣惠，郭雁君，張小鳳，等.生物炭對砂糖桔葉果和土壤理化性狀的影響[J].生態(tài)環(huán)境學(xué)報，2017，26（12）：2057-2063.

[3] 謝祖彬，張燕輝，王慧.稻田生物固氮研究進(jìn)展及方向[J].土壤學(xué)報，2020，57（3）：540-546.

[4] ZHANG Y， CONG J， LU H， et al. An integrated study to analyze soil microbial community structure and metabolic potential in two forest types[J]. PloS one，2014，9（4）：e93773.

[5] SEPP S K， VASAR M， DAVISON J， et al. Global diversity and distribution of nitrogen-fixing bacteria in the soil[J]. Frontiers in plant science，2023（14）：1100235.