〔摘要〕 目的 采用總量統(tǒng)計矩法分析補(bǔ)陽還五湯復(fù)方與單味藥（中藥飲片）揮發(fā)油指紋圖譜，研究補(bǔ)陽還五湯中單味藥-復(fù)方提取過程中質(zhì)量的傳遞性和穩(wěn)定性。方法 分別采用水蒸氣蒸餾法獲取補(bǔ)陽還五湯復(fù)方及組方藥材揮發(fā)油，建立氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）指紋圖譜，計算分析復(fù)方與單味藥總量統(tǒng)計矩各參數(shù)的傳遞規(guī)律，并分析復(fù)方和單味藥揮發(fā)性成分的變化。結(jié)果 建立補(bǔ)陽還五湯GC-MS測定方法，獲得組方藥材和復(fù)方指紋圖譜總量統(tǒng)計矩參數(shù)。復(fù)方揮發(fā)油圖譜得到65個成分，其中45個化合物來自組方藥材揮發(fā)油。藥材至復(fù)方總體揮發(fā)性成分的傳遞性為88.74%，說明藥材及復(fù)方在成分和含量上遵循Hard－Weinberg平衡，也驗(yàn)證了指紋圖譜總量統(tǒng)計矩的加合性。結(jié)論 該方法為補(bǔ)陽還五湯質(zhì)量控制提供了方法支撐，統(tǒng)計矩的加合性能闡述藥材-復(fù)方的傳遞性，旨為經(jīng)典名方質(zhì)量控制方面提供一種新思路。

〔關(guān)鍵詞〕 補(bǔ)陽還五湯；指紋圖譜；揮發(fā)油；總量統(tǒng)計矩；傳遞性

〔中圖分類號〕R284.1 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０24.09.008

On the transferability of volatile components from single to compound medicinal materials of Buyang Huanwu Decoction

LI Wenjiao1，2，3， TANG Yu1，2，3， HE Fuyuan1，2，3*， PAN Xue1，2，3*

1. College of Pharmacy， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China;

2. Hunan Key Laboratory of Pharmaceutics and Preparation of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China;

3. Supramolecular Mechanism and Mathematical Characterization Laboratory of Chinese Medicine， Hunan University of

Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To analyze the fingerprint of the volatile oil of compound and single medicinal materials in Buyang Huanwu Decoction （BYHWD） （decoction pieces） by total statistical moment method， and to study the transferability and stability of single and compound medicinal materials in BYHWD extraction process. Methods The volatile oils of BYHWD and its components were obtained by steam distillation， and the gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS） fingerprints were established. The transferring rules of the parameters of the total statistical moment of the compound and single medicinal materials were calculated and analyzed， and the changes in the volatile components of the compound and single medicinal materials were analyzed. Results The GC-MS determination method of BYHWD was established， and the statistical moment parameters of the total amount of the fingerprint of the single and the compound medicinal materials were obtained. Sixty five components were obtained from the volatile oil of the compound， of which 45 compounds were from the volatile oil of the compound medicinal materials. The transferability of the total volatile components from single medicinal materials to the compound medicinal materials was 88.74 %， indicating that the single medicinal materials and the compound medicinal materials followed the Hard-Weinberg equilibrium in terms of composition and content， and verified the additivity of the total statistical moment of the fingerprint. Conclusion The research has provided methodological support to the quality control of BYHWD. The additive performance of statistical moment has expounded the transitivity of single medicinal materials to compound medicinal materials， aiming to offer a new idea for the quality control of classical renowned formulas.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 Buyang Huanwu Decoction; fingerprint; volatile oil; total statistical moment; transferability

中藥經(jīng)典名方的特點(diǎn)是復(fù)方配伍入藥，而中藥本身是多成分體系，其成分和含量隨藥材的基源、種植、炮制、制劑技術(shù)等因素的變化而變化。在提取過程中藥復(fù)方的化學(xué)成分不等于單味藥化學(xué)成分簡單相加，化學(xué)成分結(jié)構(gòu)會發(fā)生一些變化。目前，對中藥或復(fù)方的質(zhì)量控制方法主要是選定一種或幾種質(zhì)量標(biāo)志物，開展指紋成分-工藝過程可重現(xiàn)性、中藥功效-作用機(jī)制關(guān)聯(lián)性、質(zhì)量物質(zhì)可測性、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)穩(wěn)定性研究[1]，這種方法可以追蹤目標(biāo)成分，但存在不能全面表征單味藥-復(fù)方制劑過程中成分傳遞的不足。故如何闡述中藥飲片-制劑質(zhì)量屬性傳遞規(guī)律，確保經(jīng)典名方制劑產(chǎn)品的均一性、穩(wěn)定性和傳遞性，是目前經(jīng)典名方研發(fā)亟須解決的問題[2-3]。

補(bǔ)陽還五湯是清代名醫(yī)王清任創(chuàng)制的經(jīng)典名方，由黃芪、川芎、赤芍、當(dāng)歸、紅花、桃仁、地龍7味藥材組成，有以補(bǔ)為通、以通輔補(bǔ)、補(bǔ)通兼施以益氣活血的特點(diǎn)。該方主治腦梗死、冠心病、心絞痛等心腦血管疾病，具有改善血液流變學(xué)、抗血栓形成、抗動脈粥樣硬化、神經(jīng)保護(hù)、抗腦缺血及再灌注損傷等作用[4-5]。近年來，該方在腎病、骨傷、關(guān)節(jié)炎、糖尿病視網(wǎng)膜病變等方面也有應(yīng)用[6-8]。目前，復(fù)方的藥效成分研究主要集中在水提液，但揮發(fā)油也是不可忽視的有效部位，補(bǔ)陽還五湯中的6味植物藥材中均含揮發(fā)油，其中川芎、當(dāng)歸和桃仁含量較高[9]，揮發(fā)油多數(shù)味辛主散，能散、能行，主發(fā)散、行氣、行血，與補(bǔ)陽還五湯藥理作用相符，在臨床應(yīng)用中可起到協(xié)同作用。揮發(fā)油主要由萜類、芳香族化合物、小分子脂肪族化合物等物質(zhì)組成，藥理活性廣泛，具有消炎止痛、祛風(fēng)除濕、止咳化痰、行氣健胃、行氣破血、鎮(zhèn)靜安神等功效[10-11]。

本文運(yùn)用總量統(tǒng)計矩加合性原理對經(jīng)典名方補(bǔ)陽還五湯單味藥與復(fù)方的揮發(fā)油指紋圖譜參數(shù)進(jìn)行計算和分析，填補(bǔ)了揮發(fā)性成分傳遞性研究的空白，全面闡述飲片-復(fù)方提取過程中的成分差異變化和質(zhì)量傳遞性，旨在為中藥復(fù)方制劑的質(zhì)量控制提供一種新方法。

1 基本原理

中藥指紋圖譜是從中藥物質(zhì)基礎(chǔ)出發(fā)，運(yùn)用現(xiàn)代分析檢測技術(shù)，整體、系統(tǒng)、專屬地表征中藥的內(nèi)在特征，可用于中藥材、中藥制劑以及半成品質(zhì)量的真實(shí)性、優(yōu)良性和穩(wěn)定性評價[12]?？偭拷y(tǒng)計矩是將指紋圖譜正態(tài)分布曲線化，綜合所有指紋圖譜峰，用統(tǒng)計學(xué)方法分析它的內(nèi)在特征，既能體現(xiàn)指紋圖譜的宏觀性，又能兼顧指紋圖譜的模糊性，可用于任何多成分變量的中心和離散性分析，是研究中藥多成分體系動態(tài)量變、效應(yīng)變化的有力的數(shù)學(xué)工具[13-14]。

前期已建立統(tǒng)計矩計算數(shù)學(xué)模型及參數(shù)體系：（1）總量零階矩AUCT為曲線下的總面積；（2）總響應(yīng)率AUCPWT：單位質(zhì)量的總量零階矩的大小；（3）總量一階矩為圖譜總色譜峰保留時間的均值，用■表示；（4）總量二階矩VCRTT為各色譜峰平均保留時間的方差，用■表示。其中，AUCT可對中藥組分進(jìn)行定量分析，AUCPWT、MCRTT、VCRTT可對指紋圖譜進(jìn)行定性分析?？偭拷y(tǒng)計矩具有偶聯(lián)性、加合性、統(tǒng)計性與抗干擾性，本研究主要利用其加合性，即總量統(tǒng)計矩參數(shù)可由單個成分統(tǒng)計矩參數(shù)之和構(gòu)成，總量零階矩等于各單個零階矩之和；總量零階矩與總一階矩之積等于各單個零階矩與單個一階矩的乘積之和；總量零階矩乘以總量二階矩與總量一階矩平方的和等于單個零階矩乘以單個二階矩與單個一階矩平方之和的和[15-16]。

公式如下：

■ （1）

■ （2）

■（3）

Ai表示第i峰的峰面積，λi表示第i峰的保留時間，σi表示第i峰的保留時間標(biāo)準(zhǔn)差。

2 儀器與試藥

高效液相色譜儀（1260型，美國Agilent公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52AA型，上海雅榮生物設(shè)備儀器有限公司）；超純水制水機(jī)（PINE-TREE型，北京湘順源科技有限公司）；調(diào)溫電熱套（DZTW型，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）；揮發(fā)油萃取器（蜀牛玻璃器械有限公司）。環(huán)己烷為分析純。

補(bǔ)陽還五湯組方與劑量如下：黃芪60 g，川芎6 g，當(dāng)歸9 g，紅花9 g，桃仁9 g，赤芍9 g，地龍9 g（批號分別為NG17112903、1803192、CK18061402、TK18011104、1803280142、1803280142、18052205），以上中藥飲片均購于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房。

3 方法

3.1 供試品溶液的制備

參照2020年版《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）揮發(fā)油測定甲法進(jìn)行總揮發(fā)油提取和測定。組方藥材：黃芪120 g，川芎、當(dāng)歸、紅花、桃仁、赤芍、地龍各60 g，適度打粉。補(bǔ)陽還五湯復(fù)方藥材：黃芪60 g，川芎6 g，當(dāng)歸9 g，紅花9 g，桃仁9 g，赤芍9 g，地龍9 g，打成粗粉。分別用8倍量純水浸泡4 h，植物藥材用水蒸氣蒸餾法連續(xù)提取揮發(fā)油6 h，冷卻后收集揮發(fā)油。各樣品揮發(fā)油得率分別為黃芪0.058%、赤芍0.13%、紅花0.60%、桃仁0.33%、當(dāng)歸0.82%、川芎0.78%。補(bǔ)陽還五湯0.31%。所得揮發(fā)油用正己烷稀釋，無水硫酸鈉干燥，過 0.22 μm微孔濾膜后，于2～4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

3.2 檢測條件

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用：Agilent DB-5（60 m×0.250 mm×0.25 μm）毛細(xì)管柱，初始溫度70 ℃（保留1 min），以4 ℃·min-1升溫至120 ℃，再以3 ℃·min-1升溫至280 ℃，保留10 min；流速為1 mL·min-1，氣化溫度為280 ℃，離子源溫度為230 ℃，界面溫度為280 ℃，離子源電離能70 ev，溶劑延遲時間為8 min，質(zhì)量范圍m/z為35～500，進(jìn)樣量為1 μL。

3.3 方法學(xué)考察

3.3.1 精密度試驗(yàn) 取桃仁揮發(fā)油樣品在上述 GC-MS條件下重復(fù)進(jìn)樣5次，計算圖譜中主峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值，分別為2.83%和3.32%，說明氣質(zhì)儀器精密度良好。

3.3.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次桃仁藥材，平行制備5份供試品，連續(xù)進(jìn)樣，計算圖譜中主峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值，分別為2.11%、2.02%，說明方法重復(fù)性良好。

3.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取補(bǔ)陽還五湯揮發(fā)油樣品，分別在時間點(diǎn)0、2、4、8、12、24 h時進(jìn)樣，計算圖譜中主峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值，分別為3.31%和3.89%，可見在低溫保存條件下，試藥穩(wěn)定性良好。

3.4 指紋圖譜的建立

取上述制備的揮發(fā)油樣品，在“3.2”色譜條件下進(jìn)樣測定，將圖譜全部導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”軟件，結(jié)果見圖1。

4 結(jié)果

4.1 總量統(tǒng)計矩參數(shù)計算

根據(jù)指紋圖譜信息和總量統(tǒng)計矩計算原理計算單味藥與復(fù)方的相關(guān)參數(shù)AUCT、■、■，再對各組方單味藥指紋圖譜進(jìn)行疊加，計算指紋圖譜加和總量統(tǒng)計矩參數(shù)，結(jié)果見表1。需要注意的是，由于各組方藥材在復(fù)方中所占比例及各自揮發(fā)油含量有差異，故在計算零階矩時需分別乘以各藥材在復(fù)方中的比重及各藥材揮發(fā)油得油率進(jìn)行校正。

4.2 GC-MS成分分析

揮發(fā)油的指紋圖譜中各峰分布均勻，用面積歸一化法計算各組分的百分含量，經(jīng)計算機(jī)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫（NIST）檢索，將相似度大于85%的成分計入統(tǒng)計。補(bǔ)陽還五湯復(fù)方、黃芪、紅花、當(dāng)歸、赤芍、桃仁、川芎成分?jǐn)?shù)分別為65、72、50、82、38、28、36、49。與6味組方藥材揮發(fā)油成分對比，補(bǔ)陽還五湯復(fù)方45個成分可找到來源，結(jié)果見表2。其中來源最多的是川芎，為27個，其次是當(dāng)歸，為23個。川芎和當(dāng)歸的揮發(fā)油主要成分包括藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯、雪松烯、油酸、蒎烯等脂肪酸、小分子烷烴類、內(nèi)酯類、萜類化合物。綜合藥理研究報道，兩者揮發(fā)油具有抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)、擴(kuò)張外周血管、增強(qiáng)免疫、抗凝活性等功效[17-18]。且川芎揮發(fā)油在一定程度上能促進(jìn)紅花中活性成分羥基紅花黃A的口服吸收[19]。較少的是桃仁與赤芍，分別為3、7個，來自紅花和黃芪同為12個，部分成分有多個來源。其中苯甲醛、苯甲醇所占比例最大，來源為桃仁，其余主要成分為有機(jī)酸如月桂酸，烷類如二十一烷，及醛酮類。其余20個沒有來源，主要為醛酮類，極可能為提取過程中產(chǎn)生的新化合物，如表3所示。

4.3 揮發(fā)性成分指紋圖譜總量統(tǒng)計矩分析

復(fù)方揮發(fā)油總量統(tǒng)計矩參數(shù)AUCT、■、■分別為7.83×108、56.16、214.88，疊加計算組方藥材總量統(tǒng)計矩參數(shù)AUCT、■、■分別為8.45×108、47.76、227.70。與校正后的單味藥疊加參數(shù)相比，二者零階AUCT、二階參數(shù)相差較小，而一階矩參數(shù)相差較大，說明復(fù)方揮發(fā)油在提取過程中揮發(fā)油總含量變化不大，種類變化較大，即發(fā)生了較多化學(xué)變化。這與GC-MS解譜結(jié)果基本相符，復(fù)方揮發(fā)油成分為65個，其中新成分有20個，占比30.77%。成分的變化推測可能有兩種，一是與復(fù)方中加入的地龍所含丁二酸、棕櫚油酸等有機(jī)酸有關(guān)；二是由于揮發(fā)性成分多為小分子，化學(xué)性質(zhì)相對活潑，更容易發(fā)生化學(xué)變化。揮發(fā)油的零階矩（AUCT）、總量零階矩與總一階矩之積（∑λj·Aj）、總量零階矩乘以總量二階矩與總量一階矩平方的和（∑λj2·Aj）3個總量統(tǒng)計矩參數(shù)的平均加性為88.74%，說明原藥材料對復(fù)方揮發(fā)性成分的總傳遞性為88.74%。由總量統(tǒng)計矩零階、一階、二階參數(shù)以及加和性分析可知各單味藥揮發(fā)性在高溫合煎中發(fā)生化學(xué)變化，傳遞到復(fù)方過程中略有質(zhì)量損失，在整體上的性質(zhì)即一階矩上發(fā)生了較大變化，這點(diǎn)GC-MS解譜結(jié)果一致。由此可見總量統(tǒng)計矩參數(shù)的變化確實(shí)能夠反映藥材在成分和含量上的變化，適用于多成分中藥復(fù)方研究。

5 討論

中醫(yī)藥是我國文化智慧寶藏，發(fā)展至今的方劑達(dá)15萬余首之多，具有療效好、安全性高的特點(diǎn)。經(jīng)典名方作為中醫(yī)理論的載體，事關(guān)中醫(yī)的理法方藥體系、臨床應(yīng)用、產(chǎn)業(yè)振興發(fā)展，是中醫(yī)藥傳承發(fā)展的突破口之一，基于經(jīng)典名方的高品質(zhì)中藥制劑研發(fā)，是新時期中藥產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展的重要舉措。然而由于中藥成分本身的復(fù)雜，組方的靈活多變，經(jīng)過配伍煎煮后，制成的各種復(fù)方制劑成分更為復(fù)雜，現(xiàn)有的方法難以準(zhǔn)確、全面反映炮制、提取、制劑過程中質(zhì)量屬性和明確其傳遞規(guī)律并評價其質(zhì)量的穩(wěn)定性。國家中醫(yī)藥管理局指出經(jīng)典名方物質(zhì)基準(zhǔn)的動態(tài)性規(guī)律包括均一性和穩(wěn)定性，需制定出合適的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，生產(chǎn)出符合均一、穩(wěn)定和可溯源性要求的中藥物質(zhì)基準(zhǔn)和制劑產(chǎn)品。目前，常用的中藥指紋圖譜的峰數(shù)、峰高受進(jìn)樣量、儀器種類、操作方法影響較大，穩(wěn)定性與溯源性較差，因而建立一種具加合性、抗干擾性、具統(tǒng)計性，易表征峰值量變傳遞關(guān)系的指紋圖譜分析方法是質(zhì)量評價的關(guān)鍵。

以指紋圖譜總量統(tǒng)計矩定性定量分析為核心的中藥復(fù)方物質(zhì)基準(zhǔn)及制劑制備和質(zhì)量評價體系，可實(shí)現(xiàn)了制劑質(zhì)量均性、穩(wěn)定和可溯源的目標(biāo)，這將對古代經(jīng)典名方及中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究起到重要的推動作用?？偭拷y(tǒng)計矩集定性定量分析于一身，可全面、動態(tài)監(jiān)控以指紋圖譜表達(dá)的多成分體系的濃度——效應(yīng)響應(yīng)值，可與中藥譜學(xué)分析靈活銜接?？偭拷y(tǒng)計矩法的偶聯(lián)性、加合性、統(tǒng)計性與抗干擾性，適用于中藥質(zhì)量均一、穩(wěn)定與可溯源控制。通過對各單味藥指紋圖譜總量統(tǒng)計矩參數(shù)的疊加就能推知中藥復(fù)方指紋圖譜的總量統(tǒng)計矩參數(shù)大小，若兩者相等，則由單個藥材（飲片）制成的中藥復(fù)方制劑的化學(xué)成分特征峰能按原質(zhì)量屬性進(jìn)行傳遞，整體保留了單味藥的質(zhì)量屬性。若不等，則是在復(fù)方制劑制成過程中發(fā)生了變化，原質(zhì)量屬性的消散、新特殊的質(zhì)量屬性的生成，這一質(zhì)量屬性的變化也可以用段帶總量統(tǒng)計矩逐段分析得出[20-22]。它的加合性使得中藥復(fù)方在有效部位、拆方組方等研究中獨(dú)具優(yōu)勢，化繁為簡，逐個擊破，可為經(jīng)典名方等復(fù)方研究提供參考方法。因此，總量統(tǒng)計矩分析法是研究中藥成藥傳遞性規(guī)律的適宜方法，目前已經(jīng)在中藥質(zhì)量控制中廣泛使用。

本實(shí)驗(yàn)用總量統(tǒng)計矩法研究了補(bǔ)陽還五湯復(fù)方與單味藥揮發(fā)油指紋圖譜，彌補(bǔ)了傳遞性研究中少有揮發(fā)性成分的不足，補(bǔ)陽還五湯單味藥到復(fù)方揮發(fā)性成分平均加合性為88.74%，說明雖然單味藥合煎后其成分及其含量發(fā)生變化，但大部分會穩(wěn)定傳遞至復(fù)方，復(fù)方制劑的信息源由單個信息源穩(wěn)定構(gòu)成。產(chǎn)生小部分新成分可能也是重要的藥效成分，可為補(bǔ)陽還五湯質(zhì)量及藥理研究奠定基礎(chǔ)。

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本文引用： 李文姣， 唐 昱， 賀福元， 潘 雪. 補(bǔ)陽還五湯單味藥-復(fù)方提取過程中揮發(fā)性成分傳遞性研究[J]. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報， 2024， 44（9）： 1608-1613.

〔收稿日期〕2023-12-07

〔基金項(xiàng)目〕國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81874507）；湖南省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（2022JJ30453）；湖南中醫(yī)藥大學(xué)校級科研項(xiàng)目（2022XJZKC006）。

〔通信作者〕*潘 雪，女，博士，講師，E-mail：405465029@qq.com；賀福元，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：pharmsharking@163.com。