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      健脾益智法調(diào)控CXCL1/CXCR2通路介導(dǎo)中性粒細(xì)胞局部浸潤(rùn)促進(jìn)MCAO大鼠軸突再生機(jī)制研究

      2024-10-31 00:00:00游雪娟紀(jì)立金張子恒吳佳琪馮珂*

      【摘要】目的:研究健脾益智法對(duì)MCAO大鼠大腦皮質(zhì)層和海馬區(qū)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)情況、腦組織中CXCL1、CXCR2表達(dá)水平及軸突再生情況,探討脾腦相關(guān)理論的微觀機(jī)制。方法:將20只SD大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、中藥組,除正常組外,其余兩組參照國(guó)外學(xué)者Zea Longa的線栓法建立MCAO大鼠模型,造模成功后中藥組給予健脾益智湯連續(xù)灌胃,各組分別于術(shù)后7 d、14 d采用醋酸AS-D萘酚酯酶組織化學(xué)染色檢測(cè)大鼠大腦皮質(zhì)及海馬中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)情況,免疫熒光進(jìn)行腦組織中CXCL1、CXCR2表達(dá)水平及軸突再生情況檢測(cè)。結(jié)果:中藥組術(shù)后7d、術(shù)后14d大鼠大腦皮質(zhì)層和海馬區(qū)中性粒細(xì)胞數(shù)量與同期模型組、正常組比較顯著減少,中藥組術(shù)后7 d、14d、CXCL1和CXCR2表達(dá)量均較模型組明顯增高。與模型組比較,中藥組術(shù)后7 d、14 d軸突再生明顯,術(shù)后14 d尤甚。結(jié)論:健脾益智法可能激活CXCL1/CXCR2通路,促進(jìn)軸突再生,從而修復(fù)受損的神經(jīng)。

      【關(guān)鍵詞】健脾益智法;中性粒細(xì)胞;CXC趨化因子受體2(CXCR2);CXC趨化因子配體1(CXCL1);CXCL1/CXCR2;軸突再生

      【中圖分類號(hào)】R285.5

      【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517(2024)18-0016-06

      DOI:10.3969/j.issn.1007-8517.2024.18.zgmzmjyyzz202418005

      Abstract:Objective To study the neutrophil infiltration in the cerebral cortex,CXCL1and CXCR2 expression levels and axonal regeneration in MCAO rats,and to investigate the microscopic mechanism of spleen and brain.Methods 20 SD rats are divided into normal group,model group,Chinese medicine group,except normal group,the rest two groups by foreign scholars Zea Longa MCAO rat model,mold after successful traditional Chinese medicine group give spleen puzzle soup continuous gastric,each group in 7 days,14 days respectively using acetate AS-D naphthol esterase histochemical staining to detect the infiltration of rat cerebral cortex and hippocampus,immunofluorescence for CXCL1,CXCR 2 expression level and axonal regeneration.Results The number of neutrophils in the cerebral cortex and hippocampus of 7 and 14 days were significantly decreased compared with the concurrent model group; CXCL 1 and CXCR 2 at 7 and 14 days were significantly higher compared with the model group.Compared with the model group,axon regeneration was obvious in 7 days and 14 days after surgery,especially in 14 days after surgery.Conclusion The method may activate CXCL1/CXCR 2 pathway and promote axon regeneration to repair the damaged nerves.

      Key words:Spleen Puzzle Method;Neutrophile Granulocyte;CXCR2;CXCL1;CXCL1/CXCR2;Axon Regeneration

      缺血性腦卒中(ischemic stroke,IS)是一種具有高死亡率、高致殘率、高復(fù)發(fā)率的高危性急性腦血管疾病,其預(yù)后與神經(jīng)功能缺損程度相關(guān)[1-4]。中樞神經(jīng)損傷后軸突再生失敗將會(huì)致使永久性殘疾,因而軸突再生對(duì)神經(jīng)功能恢復(fù)有著重要作用[5]。促進(jìn)神經(jīng)再生,改善神經(jīng)功能是治療IS的關(guān)鍵。近年來,有研究[6]報(bào)道腸道菌群可能通過免疫介導(dǎo)機(jī)制影響中風(fēng)結(jié)局,有望成為治療IS的新靶點(diǎn)。有研究[7]發(fā)現(xiàn)趨化因子及其受體結(jié)合可以廣泛作用于組織炎癥、損傷修復(fù)等方面,其中趨化因子CXCL1(C-X-C motif Chemokine Ligand 1)/CXCR2(C-X-C Motif Chemokine Receptor 2)在軸突形態(tài)發(fā)生及神經(jīng)系統(tǒng)中有著重要作用。最新研究[8]表明間歇禁食可促進(jìn)坐骨神經(jīng)擠壓損傷的神經(jīng)軸突再生,其主要機(jī)制是間歇禁食后,腸道革蘭氏梭菌產(chǎn)生的代謝物吲哚-3-丙酸(indolepropionic acid,IPA)增加,上調(diào)了Cd177(中性粒細(xì)胞配體)和CXCL1(內(nèi)皮中性粒細(xì)胞趨化因子配體1)的表達(dá),并通過CXCR2介導(dǎo)的機(jī)制促進(jìn)中性粒細(xì)胞趨化,從而起到促進(jìn)軸突再生的作用。中醫(yī)藥對(duì)治療神經(jīng)功能缺損疾病具有較好療效。本課題組前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究[9-13]結(jié)果表明健脾益智法可通過誘導(dǎo)軸突再生改善腦缺血狀態(tài),但其機(jī)制未明?;诖?,本實(shí)驗(yàn)建立大腦中動(dòng)脈栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)大鼠模型,觀察健脾益智膠囊對(duì)MCAO模型大鼠大腦CXCL1、CXCR2、中性粒細(xì)胞表達(dá)的影響及軸突再生情況,探討其對(duì)腦缺血后神經(jīng)再生機(jī)制,從微觀層面豐富脾腦相關(guān)理論,為臨床治療IS提供新的治療靶點(diǎn)及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

      1材料與方法

      1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組選取SPF級(jí)健康SD雄性大鼠20只,13周齡,體重280~300 g,由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(滬)2017-0005。所有大鼠均飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)旗山校區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障內(nèi)環(huán)境,溫度20~26 ℃,濕度40%~70%,自由飲食水。適應(yīng)性喂養(yǎng)6 d后,隨機(jī)分為正常組(即空白對(duì)照組)、模型組、中藥組。剩下每組MCAO術(shù)后按存活時(shí)間分為以下各亞組:術(shù)后7 d、術(shù)后14 d。每亞組各3只。死亡、造模不達(dá)標(biāo)者隨機(jī)補(bǔ)足。所有研究均按照福建中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(批準(zhǔn)號(hào):2021055)的方案和指南進(jìn)行。

      1.2主要試劑與儀器大鼠線栓(廣州佳靈生物科技有限公司,批號(hào):l3800);CXCL1(武漢三鷹,批號(hào)12335-1-AP);CXCR2(北京博奧森生物技術(shù)有限公司,批號(hào)bs-1629R);TAU(武漢三鷹,批號(hào)10274-1-AP);封閉液——濃縮型正常山羊血清(批號(hào)AR1009),抗原修復(fù)液——EDTA抗原修復(fù)液(10X)(批號(hào)AR0023),抗體稀釋液(批號(hào)AR1016),PBS漂洗液(批號(hào)AR0030),熒光(DyLight 488)標(biāo)記羊抗小鼠IgG(批號(hào)BA1126),DAPI染色液(批號(hào)AR1176),抗熒光淬滅封片劑(批號(hào)AR1109),均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司;α-乙酸萘酚酯酶染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,批號(hào):G2400);10%水合氯醛;HM315R石蠟切片機(jī)、STP-120全自動(dòng)生物組織脫水機(jī)、EC-350生物組織包埋機(jī)、攤片機(jī)、烤片機(jī)均為德國(guó)MICROM;BX51T-PHD-J1三目顯微鏡 [奧林巴斯(中國(guó))有限公司]。

      1.3藥物健脾益智湯由黃芪20 g、制何首烏15 g、人參10 g、白術(shù)10 g、遠(yuǎn)志6 g、菖蒲6 g、水蛭3 g組成。中藥飲片均購(gòu)自福建中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)醫(yī)堂。加入適量蒸餾水按照浸泡1 h-煎煮2次-混合藥液-過濾-濃縮的方式加工,最終制備成1 mL藥液含原生藥1 g的健脾益智湯。采用灌胃給藥方式,劑量均按臨床成人劑量的6倍計(jì)算收集標(biāo)本,為7.0 g/(kg·d)。

      1.4MCAO模型復(fù)制與給藥大鼠術(shù)前12 h禁食禁水,參照國(guó)外學(xué)者Zea Longa的方法復(fù)制模型,用10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠,并將其固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上,頸部常規(guī)備皮消毒,在頸部正中切口依次剪開皮膚、肌肉、筋膜,向深部游離直至暴露左側(cè)胸鎖乳突肌和頸前部肌群,從左側(cè)胸鎖乳突肌與頸前部肌群向深部分離即可達(dá)到頸總動(dòng)脈,游離左側(cè)頸總動(dòng)脈(common carotid artery,CCA)、頸內(nèi)動(dòng)脈(internal carotid artery,ICA)、頸外動(dòng)脈(external carotid artery,ECA)。結(jié)扎CCA近心端及ECA,在CCA近分叉處用眼科剪剪一小口,將線栓(佳靈:L3800)從頸總動(dòng)脈主干切口緩慢向頸內(nèi)動(dòng)脈入顱方向推進(jìn),以CCA分叉處為標(biāo)記,推進(jìn)18~20 mm左右感到輕微阻力時(shí)停止,扎緊并固定尼龍線,縫合皮膚。正常組不予任何處理。

      術(shù)后2 h,依據(jù)Longa神經(jīng)功能評(píng)分結(jié)果進(jìn)行模型評(píng)價(jià),2分以上的大鼠納入研究,死亡不足者隨機(jī)補(bǔ)充。中藥組予健脾益智湯(7.0 g·kg-1·d-1)灌胃。正常組不予處理,正常飼養(yǎng)。此后分別于術(shù)后7 d、14 d進(jìn)行處死取材。

      1.5組織標(biāo)本制備大鼠予10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉,并將其固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上,進(jìn)行心臟灌注與固定后將大鼠斷頭,并迅速取出全腦放置于4%多聚甲醛固定液中,后期進(jìn)行包埋、切片。

      1.6大鼠大腦皮質(zhì)及海馬中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)情況檢測(cè)采用醋酸萘酚AS-D酯酶染色試劑盒檢測(cè)大鼠大腦皮質(zhì)及海馬中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)情況。操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行操作。每只大鼠隨機(jī)選取3張不連續(xù)圖,在放大600倍下,每張切片在皮質(zhì)及海馬區(qū)選取3個(gè)不同視野。采用圖像分析系統(tǒng)(image J)進(jìn)行陽性細(xì)胞數(shù)分析計(jì)算。

      1.7腦組織中CXCL1和CXCR2蛋白表達(dá)情況檢測(cè)將切片常5777109aff102f7fa912ff45e731b093規(guī)脫蠟至水,置于 EDTA 抗原修復(fù)液,微波爐中高火加熱8 min至沸騰,室溫冷卻 8 min后,再中高火加熱8 min,再自然冷卻至室溫。滴加山羊血清封閉液(原液用 PBS 按1∶[KG-*3/5]9稀釋),37 ℃孵育30 min。甩去多余液體,不洗。做好的實(shí)驗(yàn)片重滴加適當(dāng)稀釋的一抗,4 ℃過夜。取出后 37 ℃復(fù)溫 30 min,PBS(pH 7.2~7.6)洗5 min×3次。滴加 DyLight 555 熒光素標(biāo)記羊抗小鼠IgG 二抗(稀釋比例是 1∶[KG-*3/5]1000), 37 ℃ 孵育45 min。PBS(pH 7.2~7.6)洗5 min×3 次。進(jìn)行復(fù)染,滴加 DAPI 染色液, 室溫孵育 3 min。PBS(pH 7.2~7.6)清洗。最后進(jìn)行封片,用抗熒光淬滅封片劑封片。熒光顯微鏡觀察結(jié)果及拍照。每只大鼠隨機(jī)選取3張不連續(xù)圖,在放大200倍下,每張切片選取3個(gè)不同視野。采用圖像分析系統(tǒng)(image J)進(jìn)行陽性細(xì)胞數(shù)分析計(jì)算。

      1.8軸突再生情況檢測(cè)除所滴加二抗為DyLight 488熒光素標(biāo)記羊抗小鼠IgG(稀釋比例是 1∶[KG-*3/5]1000)外,其余步驟均同1.7所述。使用共聚焦顯微鏡采集圖像,觀察大鼠缺血側(cè)大腦神經(jīng)元軸突再生情況,每只大鼠隨機(jī)選取3張不連續(xù)圖,在油鏡下放大63倍,每張切片選取3個(gè)不同視野。采用圖像分析系統(tǒng)(image J)進(jìn)行陽性細(xì)胞數(shù)分析計(jì)算。

      1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22軟件統(tǒng)計(jì)分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用(x±s)表示,兩組間比較用和t檢驗(yàn),多組間比較作單因素方差分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

      2結(jié)果

      2.1健脾益智湯對(duì)大腦皮質(zhì)中性粒細(xì)胞陽性細(xì)胞數(shù)的影響如圖1和表1,α-NAE染色顯示:大腦皮質(zhì)層中性粒細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)呈棕黑色,細(xì)胞核呈綠色。與正常組比較,模型組7 d和14 d陽性細(xì)胞數(shù)顯著增多,以模型7 d組尤甚,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01);與模型7 d和14 d組比較,治療7 d和14 d的陽性細(xì)胞數(shù)顯著減少,以治療14 d組尤為明顯,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。

      2.2健脾益智湯對(duì)大腦海馬中性粒細(xì)胞陽性細(xì)胞數(shù)的影響如圖2和表2,α-NAE染色顯示:大腦海馬區(qū)中性粒細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)呈棕黑色,細(xì)胞核呈綠色。與正常組比較,模型組7 d和14 d陽性細(xì)胞數(shù)顯著增多,以模型7 d組尤甚,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01);與模型7 d和14 d組比較,治療7 d和14 d的陽性細(xì)胞數(shù)顯著減少,以治療14 d組尤為明顯,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。

      2.3健脾益智湯對(duì)大腦組織CXCL1蛋白的的影響如圖3,與正常組比較,模型組7 dCXCL1蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與模型7 d組比較,治療7 d和14 dCXCL1蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng),以治療14 d組尤為明顯,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與模型14 d比較,治療7 d和14 dCXCL1蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng),以治療14 d組尤為明顯,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

      2.4健脾益智湯對(duì)大腦組織CXCR2蛋白的的影響如圖4。與正常組比較,模型7 d組CXCR2蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與模型7 d組比較,治療7 d和14 dCXCR2蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng),以治療14 d組尤為明顯,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與模型14 d比較,治療7 d和14 dCXCR2蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng),以治療14 d組尤為明顯,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

      2.5健脾益智湯對(duì)軸突再生的影響如圖5。與正常組比較,模型組7 d組軸突增生明顯,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與模型7 d組比較,治療7 d和14 d軸突顯著增生,以治療14 d組尤為明顯,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

      3討論

      目前缺血性腦卒中仍無較為有效治療手段,卒中后大部分患者有著不同程度的神經(jīng)功能缺損,遺留的后遺癥給不少家庭帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。改善神經(jīng)功能,促進(jìn)神經(jīng)再生是現(xiàn)下所被認(rèn)可的有效治療方法。調(diào)節(jié)腸道菌群對(duì)于改善缺血性腦卒中有一定的幫助,并且可以通過免疫介導(dǎo)機(jī)制影響中風(fēng)結(jié)局,是治療缺血性腦卒中的新靶點(diǎn)。間歇禁食可以促進(jìn)神經(jīng)軸突再生,主要機(jī)制正是與腸道菌群有關(guān)。間歇禁食可以促進(jìn)坐骨神經(jīng)擠壓損傷的神經(jīng)軸突再生,其主要機(jī)制是間歇禁食后,增加了腸道革蘭氏梭菌產(chǎn)生的代謝物吲哚-3-丙酸(IPA),從而上調(diào)了Cd177(中性粒細(xì)胞配體)和CXCL1(內(nèi)皮中性粒細(xì)胞趨化因子配體1)的表達(dá),并通過CXCR2介導(dǎo)的機(jī)制促進(jìn)中性粒細(xì)胞趨化,進(jìn)而起到促進(jìn)軸突再生的作用。

      CXCL1(C-X-C motif chemokine ligand 1)屬于CXC趨化因子家族,CXC受體2(CXC receptor 2,CXCR2)屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族,CXCL1/CXCR2通路可趨化中性粒細(xì)胞到達(dá)損傷或感染的部位,在機(jī)體炎癥反應(yīng)期表達(dá)增加,既可促進(jìn)炎癥過程,又可參與傷口愈合,其對(duì)于軸突形態(tài)與神經(jīng)系統(tǒng)有著重要作用[7]。

      中醫(yī)藥對(duì)于改善缺血性腦卒中療效明確,健脾益智法是基于“脾腦相關(guān)”理論所提出的治法,經(jīng)臨床及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證對(duì)治療缺血性腦卒中明確有效。在本研究中,中藥組術(shù)后7d、術(shù)后14d大鼠大腦皮質(zhì)層和海馬區(qū)中性粒細(xì)胞數(shù)量與同期模型組比較顯著減少,考慮中性粒細(xì)胞經(jīng)趨化到達(dá)缺血灶參與損傷修復(fù),由此損耗一部分中性粒細(xì)胞,且中藥具有抗炎作用,也會(huì)損耗一定數(shù)量中性粒細(xì)胞。中藥組術(shù)后7 d、14 d CXCL1和CXCR2表達(dá)量均較模型組明顯增高。與模型組比較,中藥組術(shù)后7 d、14 d軸突再生明顯,術(shù)后14 d尤甚。由此推測(cè)經(jīng)健脾益智法治療后很有可能激活CXCL1/CXCR2通路,促進(jìn)軸突再生,從而修復(fù)受損的神經(jīng)。本研究?jī)H檢測(cè)了MCAO大鼠大腦皮質(zhì)層及海馬區(qū)中性粒細(xì)胞數(shù)量,腦組織中CXCL1、CXCR2表達(dá)量及軸突再生情況,初步證明健脾益智法可能通過調(diào)控CXCL1/CXCR2通路促進(jìn)軸突再生,從而修復(fù)受損神經(jīng),尚不能完全闡明健脾益智法治療缺血性腦卒中的機(jī)制,下一步課題組將進(jìn)一步研究檢測(cè)IPA表達(dá)情況,并積極尋找CXCL1/CXCR2的下游信號(hào)通路變化情況以明確健脾益智湯作用于缺血性腦卒中的機(jī)制。

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      [13]馮珂,紀(jì)立金.健脾益智膠囊對(duì)大腦中動(dòng)脈栓塞大鼠海馬BDNF、EGFabpleapJM35FyMkJlNfa4Q==、bFGF表達(dá)的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志,2017,32(6):2686-2688.

      (收稿日期:2024-01-19編輯:劉斌)

      基金項(xiàng)目:

      國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(No.81373528);福建省自然基金面上項(xiàng)目(No.2020J01737,No.2020J01739,No.2022J01873);福建中醫(yī)藥大學(xué)校管課題(X2021001-重點(diǎn))。

      作者簡(jiǎn)介:游雪娟(1993—),女,漢族,碩士,主治醫(yī)師,研究方向?yàn)橹嗅t(yī)脾胃方向。E-mail:2582007124@qq.com

      通信作者:馮珂(1983—),女,漢族,博士,副教授,研究方向?yàn)橹嗅t(yī)藏象(脾胃)研究。E-mail:905765465@qq.com

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