摘 要 為研究觀賞禽類中分離的奇異變形桿菌（Proteus mirabilis）對第三代頭孢菌素的耐藥機制，于2019年從河南省某動物園禽類養(yǎng)殖區(qū)綠孔雀（Pavo muticus）、紅綠金剛鸚鵡（Ara chloroptera）、火雞（Meleagris gallopavo）、帽子雞（polish chicken）和非洲鴕鳥（Struthio camelus）5 種觀賞禽類中分離17 株奇異變形桿菌，經(jīng)藥物敏感性試驗、blaCTX-M基因檢測、全基因組測序、PFGE和RT-qPCR等探明受試菌對第三代頭孢菌素的耐藥機制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：共有6株受試菌對第三代頭孢菌素耐藥，除1株（6D）攜帶超廣譜β-內(nèi)酰胺酶blaCTX-M-14和1株（106A）攜帶AmpC酶blaACT-16外，其余4株經(jīng)PFGE檢測證實為同一克隆型，且細菌體內(nèi)雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)CpxAR、BaeSR和EnvZ/OmpR的表達量顯著高于敏感菌，主要通過抑制耐藥菌細胞膜上OmpC和OmpF的表達減少藥物吸收，同時促進OmpW表達加速藥物外排，從而減少菌體內(nèi)藥物濃度，進而導(dǎo)致其對第三代頭孢菌素類耐藥。研究表明，動物園禽類養(yǎng)殖區(qū)的奇異變形桿菌對第三代頭孢菌素的耐藥機制復(fù)雜多樣，散播機制主要為染色體介導(dǎo)的克隆傳播，應(yīng)引起重視。

關(guān)鍵詞：禽源奇異變形桿菌；頭孢菌素類；耐藥基因；膜孔蛋白；雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)

中圖分類號：S852. 61

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：2310 - 1490（2024）- 04 - 0811 - 08

DOI：10.12375/ysdwxb.20240414

變形桿菌屬（Proteus）細菌在自然界中廣泛存在，在人體內(nèi)生存和繁殖的能力較強，臨床上可引起腹瀉、膿毒癥、呼吸系統(tǒng)問題和尿路感染等疾??；奇異變形桿菌（P. mirabilis，PM）是公認(rèn)的導(dǎo)致人類和動物感染的主要病原體之一［1］。近年來，人源和動物源奇異變形桿菌的臨床分離率日趨增多，且臨床分離菌株多呈現(xiàn)明顯耐藥［2］。β-內(nèi)酰胺類為人醫(yī)和獸醫(yī)臨床常用抗生素，但是，隨著近年來第三代頭孢菌素類藥物在臨床中的廣泛應(yīng)用，耐藥菌也逐漸增多，尤其是質(zhì)粒介導(dǎo)的超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（extendedspectrum β-lactamases，ESBLs）和AmpC酶的出現(xiàn)［3］，給臨床有效防控耐藥菌感染造成極大困難。細菌中的雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)（two-component signal trans?duction system，TCS）可調(diào)控多種基因（如細菌細胞膜上的膜孔蛋白或外排泵相關(guān)基因）的表達，從而參與細菌耐藥性的形成［4］。

隨著“One Health”理念的推廣及普及，耐藥菌在人與動物間的水平傳播越來越受到人們的關(guān)注和重視。動物園是人與動物密切接觸和互動的一個重要場所。游客與動物互動（如接觸或喂食）在教育和娛樂方面有一定價值，同時也可能增加病原菌或耐藥菌的散播，但是，截至目前相關(guān)研究較少。課題組曾在某動物園禽類散養(yǎng)場分離獲得1株染色體介導(dǎo)的替加環(huán)素耐藥不動桿菌（Acinetobacter indicus），其可通過同源重組的方式進行水平散播［5］。本研究從河南省某動物園禽類養(yǎng)殖區(qū)分離獲得17株禽源奇異變形桿菌，經(jīng)藥物敏感性試驗、耐藥基因檢測、全基因組測序、PFGE和RT-qPCR，研究受試菌對第三代頭孢菌素的耐藥機制和散播機制，為臨床控制第三代頭孢菌素耐藥菌的傳播提供參考依據(jù)，并為評估動物園禽類散養(yǎng)場中人獸共患耐藥菌在人與動物間的水平傳播風(fēng)險提供理論支撐。

1 材料與方法

1. 1 菌株來源

2019年7月，在河南省某動物園禽類養(yǎng)殖區(qū)，采集綠孔雀（Pavo muticus）、紅綠金剛鸚鵡（Ara chlorop?tera）、火雞（Meleagris gallopavo）、帽子雞（polishchicken）和非洲鴕鳥（Struthio camelus）5種觀賞禽類糞便或肛拭子樣品，對于死體采集其肝臟或心臟組織樣本，一只動物僅收集保存1份有效樣品。細菌經(jīng)常規(guī)分離、純化及全自動細菌鑒定儀鑒定，共獲得17株禽源奇異變形桿菌，詳細分離動物及菌株命名見表1。

1. 2 主要藥品

除頭孢噻肟和頭孢噻呋購自上海源葉生物科技有限公司外，其他藥物，包括阿米卡星、多西環(huán)素、氟苯尼考和恩諾沙星，均購自河南牧翔動物藥業(yè)有限公司。藥品使用時均在有效期內(nèi)。

1. 3 藥物敏感性試驗

采用微量肉湯稀釋法檢測頭孢噻肟、頭孢噻呋、阿米卡星、多西環(huán)素、氟苯尼考和恩諾沙星對17株禽源奇異變形桿菌的最小抑菌濃度（minimum inhibi?tory concentration，MIC），藥敏結(jié)果按照美國臨床試驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（CLSI）判讀［6］。試驗重復(fù)3 次，以Escherichia coli ATCC? 25922為質(zhì)控菌。

1. 4 blaCTX-M基因的檢測

根據(jù)藥敏結(jié)果，對頭孢噻肟耐藥卻不攜帶耐藥基因的臨床菌株用煮沸法提取DNA，由北京擎科生物科技有限公司合成blaCTX-MU、blaCTX-M-1 和blaCTX-M-9 的引物序列［7］，PCR 檢測blaCTX-M 相關(guān)基因。PCR 產(chǎn)物送至北京擎科生物技術(shù)有限公司測序，結(jié)果經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫序列比對后確定基因亞型。

1. 5 PFGE 檢測

根據(jù)前期試驗結(jié)果，參照PFGE 標(biāo)準(zhǔn)程序說明書對耐頭孢噻肟但不攜帶blaCTX-M基因的奇異變形桿菌進行PFGE分型。用DNA限制性內(nèi)切酶XbaⅠ對受試菌進行酶切，沙門氏菌H9812作為參考菌株。

1. 6 全基因組測序

根據(jù)PFGE 分型結(jié)果，利用天根（TIANGEN）細菌全基因組提取試劑盒提取代表性受試菌的總基因組DNA（gDNA）。通過Illumina 高通量測序儀進行測序，將獲得的序列數(shù)據(jù)經(jīng)SOAP、SPAdes和ABySS進行序列拼接、組裝和比對。使用CISA軟件整合拼接結(jié)果，并對整合后的結(jié)果進行最終的優(yōu)化處理，確?；蚪M序列的質(zhì)量和準(zhǔn)確性。使用ResFinder 4. 1在線分析工具（https：//www. genomicepidemiology.org/services/）對得到的基因組序列進行耐藥基因的查找。

1. 7 RT-qPCR 檢測

為進一步確認(rèn)耐頭孢噻肟卻不攜帶耐藥基因的奇異變形桿菌耐藥機制，以敏感菌株作為對照菌，RT-qPCR檢測耐藥菌株的膜孔蛋白及相關(guān)調(diào)控蛋白的相對表達量。使用異硫氰酸胍-酚法抽提待測菌株的總RNA，測定其濃度及純度后，按照HiScript?Ⅲ RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）反轉(zhuǎn)錄試劑盒（諾唯贊，中國）的說明進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板，16S rRNA為內(nèi)參基因，通過RT-qPCR對樣品中待測基因的mRNA相對表達水平進行定量檢測，反應(yīng)條件為：95 ℃，30 s；（95 ℃，10 s；60 ℃，30 s）40個循環(huán)；95 ℃，15 s；60 ℃，60 s；95 ℃，15 s。結(jié)果采用2?ΔΔCt法計算，每個樣品重復(fù)3次。

1. 8 數(shù)據(jù)分析

利用GraphPad Prisim 8. 0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計和顯著性分析，組內(nèi)采用t 檢驗，*為P lt; 0. 05為有統(tǒng)計學(xué)差異；**為P lt; 0. 01為差異顯著；***和****分別為P lt; 0. 001和P lt; 0. 000 1，均為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2. 1 藥敏試驗結(jié)果

17株奇異變形桿菌對5種受試抗菌藥的敏感性結(jié)果見表1。由表1可知，受試菌對多西環(huán)素和恩諾沙星的耐藥率高達88. 2%（15/17），僅有2株菌（39B和106A）對其敏感；對頭孢噻肟和頭孢噻呋的耐藥率為35. 3%（6/17）、對氟苯尼考的耐藥率為23. 5%（4/17）；對阿米卡星耐藥率較低，僅1株（22B）呈現(xiàn)耐藥。有9株菌為多重耐藥菌株，占52. 9%，其中菌株6D除對阿米卡星敏感外，對頭孢噻肟、頭孢噻呋、多西環(huán)素、氟苯尼考和恩諾沙星均高度耐藥。同時，發(fā)現(xiàn)9株多重耐藥菌均分離自健康禽類，說明游客在動物園與健康動物間的互動也存在耐藥菌的水平散播風(fēng)險。

2. 2 blaCTX-M基因檢測結(jié)果

用PCR檢測6株對第三代頭孢菌素耐藥的禽源奇異變形桿菌是否攜帶blaCTX-M基因（圖1），經(jīng)測序和序列比對發(fā)現(xiàn)，6 株耐藥菌株中僅有1 株（6D）為blaCTX-M陽性，其亞型為blaCTX-M-14，說明該動物園禽類散養(yǎng)場中禽源奇異變形桿菌對第三代頭孢菌素耐藥的原因復(fù)雜多樣，需進一步研究。

2. 3 PFGE 結(jié)果

根據(jù)前期試驗結(jié)果，對5株耐第三代頭孢菌素但不攜帶blaCTX-M 基因的禽源奇異變形桿菌進行PFGE 分型。如圖2 所示，菌株17B、21A、25B 和29B2具有完全相同的譜型，表明為同一克隆型，且這4株菌分別來自不同禽類樣本，說明該動物園禽類散養(yǎng)場內(nèi)對第三代頭孢菌素耐藥的禽源奇異變形桿菌存在明顯的克隆散播。

2. 4 全基因組測序結(jié)果

為進一步研究不攜帶blaCTX-M但對第三代頭孢菌素耐藥的禽源奇異變形桿菌的耐藥機制，選取17B和106A進行全基因組測序，將獲得的序列數(shù)據(jù)經(jīng)拼接、組裝和比對后發(fā)現(xiàn)耐藥菌106A除攜帶β-內(nèi)酰胺類耐藥基因blaACT-16外，還同時攜帶多個耐藥基因，包括sul1、dfrA14、dfrA27、aph（3'）-Ia、aph（6）-Id、aph（3″）-Ib、aac（3）-IId、aadA16、mph（A）、qnrB6、qnrB91、aac（6'）-Ib-cr、tet（J）、tet（A）、cat 和floR，其中，blaACT-16屬于AmpC酶。AmpC酶能水解除第四代頭孢菌素和碳青霉烯類之外的多數(shù)β-內(nèi)酰胺類藥物的β-內(nèi)酰胺環(huán)而導(dǎo)致菌株耐藥［8］，說明菌株106A對第三代頭孢菌素耐藥的原因是其產(chǎn)生了AmpC型blaACT-16 酶。耐藥菌株17B雖然對頭孢噻肟耐藥，但未檢測到對第三代頭孢菌素耐藥的相關(guān)已知基因，暗示其可能通過其他機制，如外排泵、膜通透性改變等對第三代頭孢菌素耐藥，其耐藥機制仍需進一步研究。

2. 5 RT-qPCR 結(jié)果

2. 5. 1 膜孔蛋白相關(guān)基因的mRNA相對表達量

任選1株對頭孢噻肟敏感的禽源奇異變形桿菌12B 作為對照株，采用RT-qPCR 檢測耐藥菌株17B的染色體編碼膜孔蛋白相關(guān)基因的表達量，引物見表2，通過2-ΔΔCt法計算其膜孔蛋白基因ompA、ompC、ompF 和ompW 的相對表達水平。結(jié)果顯示，菌株17B 的ompC 和ompF 的相對表達量極顯著降低，其中ompC 的相對表達量較對照菌12B 下降了約93. 4%；而ompA 和ompW 的相對表達量極顯著升高（圖3）。

2. 5. 2 雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)相關(guān)基因的mRNA相對表達量

為探究引起外膜蛋白表達量變化的原因，以敏感菌株12B為對照菌，采用RT-qPCR檢測耐藥菌株17B 的相關(guān)雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)相關(guān)基因（cpxA、cpxR、baeS、baeR、envZ 和ompR）的相對表達水平。圖4結(jié)果顯示，與對照菌12B相比，耐藥菌17B的cpxA和cpxR 的相對表達量分別增加5倍和4倍，而baeS、baeR 和envZ、ompR 的相對表達量均增加2倍左右。有文獻［9］證明，CpxAR雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)對ompF和ompC 的表達具有負向調(diào)節(jié)作用，BaeSR雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)對ompW 為正調(diào)控、對ompC 和ompF 均為負調(diào)控，而EnvZ/OmpR雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)對ompC正調(diào)控作用。本試驗結(jié)果表明，耐藥菌17B的雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)CpxAR、BaeSR 和EnvZ/OmpR 的表達量顯著高于敏感對照菌，其抑制OmpC和OmpF表達而減少藥物吸收，促進OmpW表達而加速藥物外排，減少耐藥菌體內(nèi)的藥物濃度，進而對第三代頭孢菌素類藥物產(chǎn)生耐藥。

3 討論

目前國內(nèi)的一些動物園為吸引游客，會增設(shè)觸摸或者喂食等游客與動物互動的活動。雖然這些活動在教育和娛樂方面具有一定的價值，但這些行為也增加了人獸共患病病原體的傳播風(fēng)險，具有嚴(yán)重的公共衛(wèi)生安全隱患［10?11］。本研究結(jié)果表明，河南省某動物園禽源奇異變形桿菌對頭孢噻肟和頭孢噻呋的耐藥率均為35. 3%（6/17），其中2株分離自腹瀉禽類糞便樣品，1株分離自死亡禽類的新鮮組織樣品，其余均來自于健康禽類肛門拭子。由此可見，除患病禽類外，健康禽類機體也會攜帶耐藥菌，這給臨床治療帶來了困難，需要引起重視。因此，動物園應(yīng)加強動物的管理和監(jiān)測，以保障人類和動物健康。其次，游客也應(yīng)提高自我防護意識，在動物園與動物直接或間接接觸后需做好消毒措施，以減少病原微生物的感染概率。此外，政府和相關(guān)部門也應(yīng)該加強對動物園的監(jiān)管和管理，確保其嚴(yán)格遵守公共衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)。

奇異變形桿菌是臨床感染中常見的陰性菌，其耐藥性近年來隨著廣譜抗生素的廣泛應(yīng)用逐漸升高，甚至出現(xiàn)多重耐藥現(xiàn)象［12］。頭孢噻肟屬于第三代頭孢菌素類藥物，是至關(guān)重要的人獸共用抗菌藥物。然而，blaCTX-M基因的出現(xiàn)導(dǎo)致奇異變形桿菌對第三代頭孢菌素產(chǎn)生耐藥性［13］。早在2013年潘玉善等［14］已發(fā)現(xiàn)禽源奇異變形桿菌中存在blaCTX-M-65基因，且CTX-M型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因在禽源奇異變形桿菌中的存在已經(jīng)比較普遍。AmpC酶是β-內(nèi)酰胺酶的一個重要分支，由染色體或質(zhì)粒介導(dǎo)，呈現(xiàn)出多樣化的基因型趨勢［15］。AmpC酶的產(chǎn)生使細菌能夠水解頭孢菌素類藥物，進而失去抗菌活性，也是奇異變形桿菌對第三代頭孢耐藥的重要原因之一［12］。葛強等［16］對分離得到的21株豬源奇異變形桿菌進行耐藥基因擴增發(fā)現(xiàn)，豬源奇異變形桿菌中攜帶ESBLs或AmpC的菌株比例較高，分別為57. 1%和14. 3%，同時攜帶ESBLs 和AmpC 的菌株占14. 3%，其中ESBLs菌株為blaTEM型、blaCTX-M型或blaTEM型和blaCTX-M 型。本研究測序結(jié)果顯示，1株（6D）攜帶耐藥基因blaCTX-M-14，1 株（106A）攜帶耐藥基因blaACT-16，與耐藥表型一致。

本研究中4 株同一克隆型頭孢噻肟耐藥菌（17B、21A、25B 和29B2）RT-qPCR 結(jié)果表明，3個雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)共同調(diào)節(jié)膜孔蛋白基因（ompA、ompC、ompF 和ompW）的表達，結(jié)果導(dǎo)致禽源奇異變形桿菌對頭孢噻肟的抗性。OmpC和OmpF為革蘭陰性菌細胞膜上的主要孔道蛋白，在抗菌藥透過細胞膜進入菌體的過程中發(fā)揮重要作用［17］，其表達量下降時會導(dǎo)致抗菌藥的吸收減少，從而降低菌體內(nèi)藥物濃度而導(dǎo)致耐藥。OmpA常與β-內(nèi)酰胺酶或多藥外排泵一起作為非特異性慢孔外排蛋白而促進菌體內(nèi)藥物的外排，Tsai et al.［18］證明ompA 缺失株使厄他培南、亞胺培南、美羅培南、多尼培南、萘啶酸、阿米卡星和黏菌素的敏感性增加2 ～ 3倍。OmpW 屬于小的外膜孔蛋白家族，可作為一種動態(tài)變化的孔通道參與某些外排蛋白的外排功能，如與小多重耐藥蛋白EmrE 共同作用促進特異性底物的泵出［9］。雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)是菌體內(nèi)常見的調(diào)控元件，通過調(diào)控膜孔蛋白的表達來影響藥物的流入與排出，進而產(chǎn)生耐藥［4，9］。Masi et al.［19］研究表明，CpxA分別調(diào)節(jié)OmpF孔蛋白和AcrD外排泵的表達，以CpxR依賴性方式賦予菌株對β-內(nèi)酰胺類和氨基糖苷類藥物的抗性，證明CpxAR雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)對ompF的負向調(diào)節(jié)作用。Hu et al.［20］通過回補baeR 基因發(fā)現(xiàn)OmpW在抗性菌株R200中的表達恢復(fù)正常水平，并且還完全恢復(fù)了對頭孢曲松的耐藥性，證明BaeSR雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)正向調(diào)控OmpW表達。Adler et al. ［21］發(fā)現(xiàn)envZ 突變降低OmpF 的豐度，但OmpC 的表達水平增加，證明EnvZ/OmpR 雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)能負調(diào)控ompC 的表達。

ESBLs的表達是導(dǎo)致第三代頭孢菌素耐藥的主要機制，在ESBLs中，CTX-M酶因其廣泛流行和高效耐藥特性而備受關(guān)注，其既可通過接合型質(zhì)粒、插入序列、轉(zhuǎn)座子等進行水平散播，也可以通過克隆進行垂直傳播［22］，其中ST131型大腸桿菌攜帶blaCTX-M-15在全球不同國家和地區(qū)的克隆傳播和大流行，對公共衛(wèi)生構(gòu)成了嚴(yán)重威脅［23］。本研究發(fā)現(xiàn)，分離自不同品種禽類樣本的第三代頭孢菌素耐藥菌（17B、21A、25B和29B2）具有相同的譜型，表明該動物園禽類散養(yǎng)場對第三代頭孢菌素耐藥的奇異變形桿菌存在著克隆傳播，為控制該克隆傳播，禽類散養(yǎng)場應(yīng)在加強飼養(yǎng)管理的同時，嚴(yán)格消毒。盡管本研究檢出的克隆傳播菌株未攜帶CTX-M酶，但其仍對第三代頭孢菌素耐藥，如不能嚴(yán)格消毒，阻斷耐藥菌的克隆傳播，不僅會造成在禽類散養(yǎng)場區(qū)域內(nèi)流行散播，而且可能通過與游客的互動等直接或間接的接觸造成更大范圍的流行散播，故應(yīng)引起人們的足夠重視。

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基金項目：河南省高校科技創(chuàng)新團隊支持計劃項目（23IRTSTHN021）；河南省自然科學(xué)基金重點項目（232300421111）