轉(zhuǎn)GbHCT13、GbHCT15基因棉花的篩選鑒定及農(nóng)藝性狀、產(chǎn)量性狀和纖維品質(zhì)分析

摘要：對(duì)轉(zhuǎn)GbHCT基因棉花葉片進(jìn)行草銨膦除草劑濃度梯度篩選，通過(guò)對(duì)農(nóng)藝性狀、產(chǎn)量性狀和纖維品質(zhì)進(jìn)行分析，探討目的基因GbHCT在棉花纖維發(fā)育中的作用。通過(guò)60、70、80 μL/L濃度的除草劑初步篩選抗性植株，測(cè)量經(jīng)標(biāo)記基因PCR鑒定為陽(yáng)性的植株的農(nóng)藝性狀、產(chǎn)量性狀和纖維品質(zhì)，并進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果得出：（1）當(dāng)草銨膦除草劑濃度為80 μL/L時(shí)篩選效果最佳，噴施除草劑9 d后轉(zhuǎn)GbHCT13品系存活率為0.85%，其中60%存活植株能擴(kuò)增出標(biāo)記基因片段；轉(zhuǎn)GbHCT15品系存活率為0.90%，其中80%存活植株能擴(kuò)增出標(biāo)記基因片段。（2）與受體Y1169相比，2個(gè)轉(zhuǎn)基因品系的農(nóng)藝性狀存在顯著差異，單鈴重均有所下降，產(chǎn)量性狀顯著增加。（3）與對(duì)照相比，2個(gè)轉(zhuǎn)基因品系經(jīng)目的基因?qū)牒罄w維品質(zhì)指標(biāo)均有所變化，其中轉(zhuǎn)GbHCT13品系的斷裂伸長(zhǎng)率、成熟度和短纖維指數(shù)均上升，其他纖維指標(biāo)均下降，而轉(zhuǎn)GbHCT15品系的馬克隆值、光透亮和短纖維指數(shù)有所下降，成熟度變化不大，其余纖維指標(biāo)均上升；對(duì)比2個(gè)轉(zhuǎn)基因品系的纖維指標(biāo)得出，轉(zhuǎn)GbHCT15品系的纖維伸長(zhǎng)更為明顯。經(jīng)除草劑篩選、PCR鑒定及室內(nèi)加代篩選得出，GbHCT基因可以在后代中穩(wěn)定遺傳，該基因?qū)胧荏w后，2個(gè)轉(zhuǎn)基因品系的農(nóng)藝性狀、產(chǎn)量性狀和纖維品質(zhì)均有所變化，其中轉(zhuǎn)GbHCT15品系變化更為明顯。

關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因棉花；HCT基因；農(nóng)藝性狀；纖維品質(zhì)

中圖分類號(hào)：S512.103""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2024）22-0069-09

新疆是我國(guó)的主要產(chǎn)棉區(qū)，其種植的海島棉具有優(yōu)良的纖維品質(zhì)，而纖維品質(zhì)是衡量棉花品質(zhì)的關(guān)鍵，不斷挖掘棉纖維發(fā)育相關(guān)基因功能不僅對(duì)探究棉花優(yōu)異的纖維品質(zhì)有著重大作用，而且對(duì)篩選優(yōu)異的棉花品種具有現(xiàn)實(shí)意義。20世紀(jì)末，世界成功研究出首例轉(zhuǎn)基因作物——含抗生素抗性的轉(zhuǎn)基因煙草^［1］。隨后相繼開展轉(zhuǎn)基因抗蟲、抗除草劑的創(chuàng)新型作物研究，這為作物抗病以及纖維品質(zhì)提高、纖維發(fā)育調(diào)控等方面的轉(zhuǎn)基因研究提供了思路^［2-5］。目前關(guān)于外源基因能否穩(wěn)定遺傳給后代仍存在一些爭(zhēng)論。一些研究表明，外源基因一旦導(dǎo)入到受體植株的基因組中，完整外源基因即可穩(wěn)定傳遞給后代^［6］。陳淼平在研究轉(zhuǎn)crylAb基因水稻時(shí)發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)入的目的基因在子代中能夠表達(dá)抗蟲效應(yīng)，且該基因穩(wěn)定遺傳給后代^［7］。也有研究認(rèn)為，一些外源基因受拷貝數(shù)與受體不同、轉(zhuǎn)化方法不成熟以及外界不可控環(huán)境因素的影響，不能穩(wěn)定遺傳^［8-11］。轉(zhuǎn)基因植株中的外源基因會(huì)發(fā)生基因漂移，因而需通過(guò)擴(kuò)大群體，不斷地雜交后代并進(jìn)行鑒定，以篩選出穩(wěn)定遺傳給后代的轉(zhuǎn)基因植株^［12］。羥基肉桂?；D(zhuǎn)移酶（hydroxycinnamoyl transferase，HCT）是一種木質(zhì)素合成酶，在木質(zhì)素單體合成中起著上下游調(diào)節(jié)作用。21世紀(jì)初，Hoffmann等從煙草莖中分離提取出一種蛋白質(zhì)，這種蛋白質(zhì)不僅能夠酰基化多種底物，還具有莽草酸/奎尼酸酯?；D(zhuǎn)移酶的雙重活性，因此將其命名為羥基肉桂?；D(zhuǎn)移酶^［13］。通過(guò)調(diào)控HCT基因的表達(dá)量，可調(diào)節(jié)植物中的木質(zhì)素含量，由此可以證實(shí)，HCT可以促進(jìn)纖維發(fā)育^［14］。因此，通過(guò)對(duì)HCT基因的調(diào)控可實(shí)現(xiàn)纖維品質(zhì)的改變。將目的基因?qū)胧荏w材料中，轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株可以通過(guò)表型抗性進(jìn)行篩選，再經(jīng)分子水平鑒定，結(jié)合目標(biāo)性狀可確定導(dǎo)入的目的基因在轉(zhuǎn)基因植株后代中是否得到穩(wěn)定遺傳和表達(dá)^［15］。為進(jìn)一步研究調(diào)控纖維的HCT基因?qū)胧荏w后對(duì)受體纖維品質(zhì)產(chǎn)生的影響，通過(guò)不同濃度的除草劑對(duì)轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株進(jìn)行初步篩選，再經(jīng)PCR對(duì)轉(zhuǎn)基因陸地棉進(jìn)行鑒定，分析目的基因GbHCT轉(zhuǎn)入受體后，植株各性狀發(fā)生的變化及轉(zhuǎn)基因在植株體內(nèi)的表達(dá)情況，最后對(duì)在試驗(yàn)田種植的轉(zhuǎn)GbHCT基因棉花的農(nóng)藝性狀、產(chǎn)量性狀和纖維品質(zhì)進(jìn)行相關(guān)性分析，探討目的基因GbHCT在棉花纖維發(fā)育中的作用。

1"材料與方法

1.1"材料

轉(zhuǎn)基因材料是新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將目的基因GbHCT13、GbHCT15導(dǎo)入到陸地棉Y1169中獲得的，其中目的基因GbHCT來(lái)自海島棉新海21。試驗(yàn)于2021年在新疆塔城地區(qū)沙灣市新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)棉花育種基地（43°20′～45°20′N，84°45′～86°40′E）進(jìn)行，對(duì)照材料Y1169與轉(zhuǎn)基因材料均采用人工點(diǎn)播方式、覆膜種植，每條膜行長(zhǎng) 5 m，對(duì)照組材料株距為10 cm，每條膜種植3行；轉(zhuǎn)基因材料種植密度較大，共種植9行，每3行1個(gè)重復(fù)，每條膜約5 000棵，轉(zhuǎn)基因棉花用地與對(duì)照組用地肥力基本一致，因需噴灑除草劑，田間管理與其他試驗(yàn)用地分開。

1.2"試驗(yàn)方法

1.2.1"除草劑篩選

設(shè)置60、70、80 μL/L 3個(gè)草銨膦除草劑Basta濃度梯度（表1），在長(zhǎng)出第4～5張葉片時(shí)分別噴施試驗(yàn)材料，在噴施后3、6、9 d觀察并記錄棉花子葉的反應(yīng)，統(tǒng)計(jì)噴施后轉(zhuǎn)基因材料的存活株數(shù)。收集T2代種子在室內(nèi)種植，通過(guò)涂抹除草劑進(jìn)行加代篩選。

1.2.2"PCR鑒定

取噴施高濃度除草劑后未發(fā)生變色的植株頂端幼嫩葉片，采用改良的CTAB法^［16］提取棉花基因組DNA，用篩選標(biāo)記基因bar引物（表2）進(jìn)行PCR鑒定。

1.2.3"轉(zhuǎn)GbHCT基因?qū)﹃懙孛轞1169農(nóng)藝性狀、產(chǎn)量及纖維品質(zhì)的影響

2021年試驗(yàn)地天氣狀況良好，灌溉及時(shí)，棉花生長(zhǎng)狀況良好。8月底開始對(duì)棉花進(jìn)行打頂，同時(shí)開始打脫葉劑；9月棉花生長(zhǎng)進(jìn)入吐絮期，此時(shí)測(cè)量轉(zhuǎn)基因棉花的農(nóng)藝性狀；10月棉花進(jìn)入收獲期，收取棉花正常吐絮鈴，用棉花軋花機(jī)分離皮棉與籽棉，并用天平測(cè)定重量，取其中15 g左右皮棉，送至新疆農(nóng)墾科學(xué)院進(jìn)行纖維品質(zhì)測(cè)定。對(duì)測(cè)得的農(nóng)藝性狀、產(chǎn)量性狀和纖維品質(zhì)進(jìn)行相關(guān)性分析。

2"結(jié)果與分析

2.1"轉(zhuǎn)基因材料篩選

通過(guò)圖1可以看出，噴施除草劑后，A組葉片沒(méi)有發(fā)生任何變化，B組葉片出現(xiàn)黃色斑點(diǎn)，C組葉片有較明顯黃化特征，由于除草劑產(chǎn)生藥害約需3 d時(shí)間，當(dāng)棉花長(zhǎng)出子葉后，用80 μL/L草銨膦除草劑噴施棉花真葉，轉(zhuǎn)基因棉花葉片沒(méi)有發(fā)生反應(yīng)，生長(zhǎng)點(diǎn)也未產(chǎn)生枯死反應(yīng)，而非轉(zhuǎn)基因棉花葉片出現(xiàn)枯死斑點(diǎn)，莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)干枯。每隔3 d噴施1次 80 μL/L 草銨膦除草劑，9 d后對(duì)噴施草銨膦除草劑的葉片進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)未轉(zhuǎn)GbHCT基因植株的涂抹部位出現(xiàn)枯死斑點(diǎn)，而轉(zhuǎn)GbHCT基因植株葉色正常。

本試驗(yàn)中，大田共種植轉(zhuǎn)GbHCT13基因棉花 4 730株、轉(zhuǎn)GbHCT15棉花3 870株（表3），經(jīng)高濃度除草劑篩選后，對(duì)存活的40株轉(zhuǎn)GbHCT13、35株轉(zhuǎn)GbHCT15棉花進(jìn)行取樣，并進(jìn)行室內(nèi)PCR鑒定。

2.2"PCR檢測(cè)結(jié)果分析

為進(jìn)一步驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株，對(duì)草銨膦除草劑涂抹部位的葉片沒(méi)有出現(xiàn)反應(yīng)的植株進(jìn)行PCR驗(yàn)證。結(jié)果表明，87%以上的抗除草劑轉(zhuǎn)基因棉花的新生葉片能擴(kuò)增出大小為475 bp的標(biāo)記基因片段，而對(duì)除草劑敏感的植株未擴(kuò)增出標(biāo)記基因產(chǎn)物。利用除草劑篩選和PCR檢測(cè)相結(jié)合的方法對(duì)試驗(yàn)田中用于測(cè)定農(nóng)藝性狀的T2代轉(zhuǎn)基因棉花進(jìn)行鑒定。

PCR鑒定結(jié)果見圖2。轉(zhuǎn)GbHCT13品系的陽(yáng)性率為60.0%，陽(yáng)性植株共24株，轉(zhuǎn)GbHCT15品系的陽(yáng)性率為80.0%，陽(yáng)性植株共28株。

2.3"室內(nèi)加代檢測(cè)

通過(guò)大田試驗(yàn)觀察最終的子葉受害程度發(fā)現(xiàn)，當(dāng)除草劑濃度為60 μL/L時(shí)，葉色基本無(wú)變化；當(dāng)除草劑濃度為70 μL/L時(shí)，葉片有少量反應(yīng)；當(dāng)除草劑濃度為80 μL/L時(shí)，葉片反應(yīng)明顯，與周圍正常葉色相比表現(xiàn)出明顯差異，且噴施過(guò)后大部分棉花植株死亡。60、70 μL/L的草銨膦噴灑至葉片后，葉片反應(yīng)不能排除棉花自身對(duì)除草劑產(chǎn)生抗性所造成的假陽(yáng)性，因此在使用時(shí)可以排除這2個(gè)濃度，而 80 μL/L 的除草劑噴灑至葉片后，葉片反應(yīng)可基本消除是由棉花自身對(duì)除草劑產(chǎn)生的抗性所造成的，并且對(duì)棉花植物的正常生長(zhǎng)產(chǎn)生影響，因此可以作為除草劑篩選轉(zhuǎn)基因棉花與否的標(biāo)準(zhǔn)。在室內(nèi)加代篩選中，直接選取80 μL/L的除草劑進(jìn)行篩選。

收集在田間試驗(yàn)中被鑒定為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因棉花種子，取少量種植于室內(nèi)進(jìn)行加代鑒定，待長(zhǎng)出 2～3張真葉時(shí)，涂抹濃度為80 μL/L的除草劑至葉片上，每隔3 d涂抹1次，取少量涂抹后無(wú)反應(yīng)的葉片（圖3），提取植株總DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)。部分轉(zhuǎn)基因植株對(duì)濃度為80 μL/L的除草劑有葉片反應(yīng)，對(duì)未對(duì)除草劑產(chǎn)生葉片反應(yīng)的植株進(jìn)行標(biāo)記基因鑒定。

取鮮嫩葉片提取棉花DNA，以陸地棉Y1169為陰性對(duì)照，含有標(biāo)記基因的質(zhì)粒載體為陽(yáng)性對(duì)照，對(duì)標(biāo)記基因進(jìn)行PCR鑒定。由標(biāo)記基因鑒定結(jié)果（圖4）可知，在8個(gè)樣品中有6個(gè)樣品含標(biāo)記基因，片段大小均為475 bp， 表明目的基因成功導(dǎo)入到這6條含有特異性條帶的植株中。確定T3代轉(zhuǎn)GbHCT13品系棉花的陽(yáng)性率為83.0%，轉(zhuǎn)GbHCT15品系棉花的陽(yáng)性率為82.1%（表4）。

2.4"農(nóng)藝性狀的比較分析

2.4.1"轉(zhuǎn)GbHCT基因品系與對(duì)照棉花農(nóng)藝性狀比較分析

采用SPSS軟件對(duì)所測(cè)得的農(nóng)藝性狀進(jìn)行單因素方差分析與顯著性差異分析，結(jié)果（表5）顯示，不同品系在果枝數(shù)、有效果枝數(shù)、鈴數(shù)和有效鈴數(shù)上存在顯著差異。對(duì)農(nóng)藝性狀進(jìn)行進(jìn)一步多重比較分析可得，轉(zhuǎn)GbHCT13品系的株高與對(duì)照Y1169相比顯著增加，而轉(zhuǎn)GbHCT15品系的株高與對(duì)照Y1169相比略有增加；轉(zhuǎn)GbHCT15品系的果枝數(shù)、有效果枝數(shù)與對(duì)照Y1169相比顯著增加，而轉(zhuǎn)GbHCT13品系與對(duì)照組相比略有升高；在鈴數(shù)方面，轉(zhuǎn)GbHCT15品系的掛鈴數(shù)更多，轉(zhuǎn)GbHCT13品系和轉(zhuǎn)GbHCT15品系的鈴數(shù)、有效鈴數(shù)與對(duì)照組相比顯著或極顯著增加。由以上結(jié)果可以得出，目的基因?qū)氲绞荏w后，農(nóng)藝性狀發(fā)生顯著變化，各項(xiàng)農(nóng)藝性狀指標(biāo)均有升高；綜合來(lái)看，轉(zhuǎn)GbHCT15品系和轉(zhuǎn)GbHCT13品系與對(duì)照相比，果枝數(shù)、有效果枝數(shù)、鈴數(shù)和有效鈴數(shù)存在顯著差異。

2個(gè)轉(zhuǎn)基因品系與Y1169相比，差異見圖5。在鈴數(shù)、有效鈴數(shù)、果枝數(shù)、有效果枝數(shù)中轉(zhuǎn)GBHCT13最大值低于轉(zhuǎn)GBHCT15；轉(zhuǎn)GBHCT13、轉(zhuǎn)GBHCT15在農(nóng)藝性狀方面最大值均高于Y1169。轉(zhuǎn)GBHCT13、轉(zhuǎn)GBHCT15材料的中位數(shù)均高于Y1169，即轉(zhuǎn)基因材料農(nóng)藝性狀優(yōu)于Y1169。

2.4.2"產(chǎn)量性狀的比較分析

采用Excel與SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)GbHCT基因的2個(gè)品系的產(chǎn)量性狀與對(duì)照Y1169相比差異明顯，轉(zhuǎn)基因品系單鈴重較對(duì)照組有所減少。

對(duì)10月收獲的棉花進(jìn)行單獨(dú)計(jì)數(shù)，測(cè)平均單鈴重、衣分、籽棉產(chǎn)量和皮棉產(chǎn)量等指標(biāo)，結(jié)果（表6）顯示，與對(duì)照Y1169相比，2個(gè)轉(zhuǎn)基因品系的棉花單鈴重均有所降低，其中轉(zhuǎn)GbHCT13品系的單鈴重與對(duì)照組相比降低了10.9%，平均為4.1 g，而轉(zhuǎn)GbHCT15品系的平均單鈴重為4.2 g，與對(duì)照組相比降低8.7%。

2個(gè)轉(zhuǎn)基因品系間的衣分含量與對(duì)照組Y1169相比，轉(zhuǎn)GbHCT13品系的衣分增長(zhǎng)不顯著，增長(zhǎng)率為4.9%，而轉(zhuǎn)GbHCT15品系衣分顯著增長(zhǎng)，增長(zhǎng)率為7.3%。此外，通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因棉花的皮棉產(chǎn)量與籽棉產(chǎn)量較對(duì)照組有所增加，其中轉(zhuǎn)GbHCT13品系的籽棉產(chǎn)量平均增加16.4%，轉(zhuǎn)GbHCT15品系的籽棉產(chǎn)量顯著增加44.0%，轉(zhuǎn)GbHCT13品系的皮棉產(chǎn)量平均增加21.0%，轉(zhuǎn)GbHCT15品系的皮棉產(chǎn)量顯著增加41.1%。

2.4.3"轉(zhuǎn)基因品系農(nóng)藝性狀與產(chǎn)量性狀相關(guān)分析

由表7可知：（1）轉(zhuǎn)基因品系的株高與單株產(chǎn)量、有效果枝數(shù)和有效鈴數(shù)等極顯著相關(guān)，但是與單鈴重、衣分不顯著相關(guān)，可見增加株高不會(huì)引起單鈴重與衣分的改變；（2）將果枝數(shù)與單株產(chǎn)量、有效果枝數(shù)和有效鈴數(shù)等進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析， 可以得出果枝數(shù)

與這些農(nóng)藝性狀呈極顯著正相關(guān)，可見果枝數(shù)的增加會(huì)引起有效果枝數(shù)、鈴數(shù)、有效鈴數(shù)、單株產(chǎn)量的增加；（3）有效果枝數(shù)與鈴數(shù)、有效鈴數(shù)和單株產(chǎn)量呈極顯著正相關(guān)，與單鈴重、衣分沒(méi)有顯著相關(guān)關(guān)系；（4）鈴數(shù)與有效鈴數(shù)、單株產(chǎn)量呈極顯著正相關(guān)，說(shuō)明增加單株棉花的鈴數(shù)，可大大提高棉花的產(chǎn)量；而與單鈴重呈負(fù)相關(guān)，這與前人的研究相符，棉花鈴數(shù)多而單鈴重下降；（5）有效鈴數(shù)與單株產(chǎn)量呈極顯著正相關(guān)，與單鈴重呈顯著負(fù)相關(guān)，說(shuō)明增加有效鈴數(shù)會(huì)提高單株產(chǎn)量，但會(huì)降低單鈴重，與衣分呈不顯著相關(guān)，由此猜測(cè)，棉花的衣分改變不會(huì)引起棉花鈴數(shù)和有效鈴數(shù)的改變；（6）單鈴重與單株產(chǎn)量呈極顯著正相關(guān)，說(shuō)明單鈴重的增加可提高棉花的產(chǎn)量。

綜上得出，轉(zhuǎn)基因棉花的衣分指標(biāo)與單株產(chǎn)量沒(méi)有顯著相關(guān)關(guān)系，改變其他的農(nóng)藝性狀均不會(huì)引起衣分的增加，而單株產(chǎn)量與株高、鈴數(shù)和果枝數(shù)均呈極顯著相關(guān)關(guān)系，可見增加這些農(nóng)藝性狀均能增加棉花的產(chǎn)量。但是有效鈴數(shù)的增加會(huì)導(dǎo)致單鈴重的降低，因此，需要在棉花單鈴重與有效鈴數(shù)的動(dòng)態(tài)變化中找到平衡，充分實(shí)現(xiàn)棉花高產(chǎn)。

2.4.4"纖維品質(zhì)的比較分析

由表8、圖6得出：（1）轉(zhuǎn)GbHCT13品系的上半部平均長(zhǎng)度顯著低于對(duì)照Y1169，而轉(zhuǎn)GbHCT15品系的上半部平均長(zhǎng)度顯著高于對(duì)照Y1169；（2）轉(zhuǎn)GbHCT13品系的平均長(zhǎng)度顯著低于對(duì)照Y1169，轉(zhuǎn)GbHCT15品系的平均長(zhǎng)度卻顯著高于對(duì)照Y1169；（3）轉(zhuǎn)GbHCT13品系的長(zhǎng)度整齊度顯著低于對(duì)照Y1169，轉(zhuǎn)GbHCT15品系的長(zhǎng)度整齊度與對(duì)照Y1169差異不顯著；（4）在馬克隆值這項(xiàng)纖維品質(zhì)指標(biāo)上，轉(zhuǎn)GbHCT13品系和轉(zhuǎn)GbHCT15品系均顯著低于對(duì)照Y1169，其中轉(zhuǎn)GbHCT15品系的馬克隆值最低；（5）轉(zhuǎn)GbHCT13品系的斷裂比強(qiáng)度值顯著低于對(duì)照Y1169，轉(zhuǎn)GbHCT15品系的斷裂比強(qiáng)度值顯著高于對(duì)照Y1169；（6）轉(zhuǎn)GbHCT15品系的斷裂伸長(zhǎng)率顯著高于對(duì)照Y1169，轉(zhuǎn)GbHCT13品系的斷裂伸長(zhǎng)率也高于對(duì)照，但差異不顯著；（7）在光透亮這項(xiàng)指標(biāo)中，對(duì)照組最高，2個(gè)轉(zhuǎn)基因品系的光透亮均顯著低于對(duì)照；（8）轉(zhuǎn)GbHCT13品系的成熟度高于對(duì)照Y1169，但并不顯著，轉(zhuǎn)GbHCT15品系的成熟度與對(duì)照Y1169無(wú)明顯差異；（9）轉(zhuǎn)GbHCT15品系的短纖維指數(shù)顯著低于對(duì)照Y1169，而轉(zhuǎn)GbHCT13品系的短纖維指數(shù)顯著高于對(duì)照。

3"討論

3.1"除草劑初步篩選轉(zhuǎn)基因棉花

草銨膦屬于有機(jī)磷類非傳導(dǎo)性滅生除草劑，其作用主要是抑制植物合成酶的催化作用，使植株不能進(jìn)行正常代謝，致使細(xì)胞質(zhì)葉綠體解體，使植物無(wú)法進(jìn)行光合作用，同時(shí)使植物葉片及芽尖枯死，最終導(dǎo)致植株死亡^［17-18］。草銨膦的抗性基因bar來(lái)自土壤吸水鏈霉菌，可使草銨膦不能抑制谷氨酰胺合成酶的活性^［19］，從而使植株具有耐除草劑性。因此采用濃度為60、70、80 μL/L的草銨膦除草劑對(duì)轉(zhuǎn)基因棉花進(jìn)行初步篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，80 μL/L的草銨膦可使未轉(zhuǎn)入GbHCT基因的棉花葉片枯死、莖尖死亡，確定該濃度為適合的噴施濃度；而葉片無(wú)反應(yīng)的植株可以初步證明為GbHCT基因成功已導(dǎo)入。為進(jìn)一步確定棉花轉(zhuǎn)基因植株的真?zhèn)?，進(jìn)行PCR檢測(cè)，鑒定植株體內(nèi)是否含有bar基因，觀察待測(cè)樣品是否含有目的條帶，從而對(duì)棉花轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行進(jìn)一步篩選。

3.2"室內(nèi)PCR鑒定轉(zhuǎn)基因棉花

選用通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得目的片段的難度相較于特異性引物更大，但使用通用引物獲得的目的片段不僅可以證明目的基因成功導(dǎo)入到受體植株中，還表明目的基因在植株體內(nèi)片段完整，并未發(fā)生基因漂移。采用通用引物對(duì)多世代轉(zhuǎn)基因材料進(jìn)行檢測(cè)還可以在一定程度上證明目的基因是否穩(wěn)定遺傳。趙柯柯等采用標(biāo)記基因引物和通用載體引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，不僅成功鑒定出GhMYB4過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因棉花，還通過(guò)該法得出目的基因可以穩(wěn)定遺傳給子代^［20］。本研究同時(shí)運(yùn)用草銨膦抗性篩選和通用引物PCR檢測(cè)對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行鑒定，可以得到更準(zhǔn)確的試驗(yàn)結(jié)果。

傳統(tǒng)育種技術(shù)通過(guò)雜交以表型性狀作為篩選手段，不僅耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，且工作量巨大，不是快速準(zhǔn)確篩選出具有優(yōu)異纖維品質(zhì)新品種的最佳方法^［21］。因此，在育種中，不能僅依靠表型鑒定，還需借助分子生物學(xué)方法，利用基因組學(xué)加以分析進(jìn)行分子育種，這是目前最為實(shí)用且快速的選育優(yōu)良品種的新方法^［22］。轉(zhuǎn)基因技術(shù)通過(guò)分子技術(shù)鑒定外源基因是否整合到受體細(xì)胞基因組中，隨著植株的生長(zhǎng)發(fā)育，通過(guò)觀察該基因在植物細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況，判斷該基因能否在后代中穩(wěn)定遺傳一種技術(shù)^［23］。由除草劑篩選及bar基因檢測(cè)的結(jié)果可得，T2代轉(zhuǎn)GbHCT13品系的陽(yáng)性率為60.0%、轉(zhuǎn)GbHCT15品系為80.0%，T3代轉(zhuǎn)GbHCT13品系的陽(yáng)性率為83.0%、轉(zhuǎn)GbHCT15品系為82.1%，本研究所用轉(zhuǎn)基因品系均是通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得的^［24］。T2代經(jīng)PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的植株，在T3代通過(guò)bar基因篩選時(shí)仍有植株未擴(kuò)增出目的條帶，說(shuō)明轉(zhuǎn)基因植株在最初幾代的遺傳中可能存在基因分離的現(xiàn)象，因此需要對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的每一代進(jìn)行鑒定。

3.3"轉(zhuǎn)GbHCT基因海島棉農(nóng)藝及產(chǎn)量性狀與對(duì)照的差異分析

目的基因GbHCT雖然與棉花的纖維發(fā)育相關(guān)，但該基因的導(dǎo)入不僅可使棉花的纖維品質(zhì)發(fā)生改變，同時(shí)對(duì)棉花的農(nóng)藝性狀和產(chǎn)量性狀產(chǎn)生不同程度的影響。本研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)GbHCT13品系和轉(zhuǎn)GbHCT15品系的株高高于對(duì)照，經(jīng)過(guò)多重比較分析得出，與對(duì)照組Y1169相比，轉(zhuǎn)基因品系的果枝數(shù)、有效果枝數(shù)、鈴數(shù)和有效鈴數(shù)等農(nóng)藝性狀均有所升高。轉(zhuǎn)GbHCT15品系的籽棉產(chǎn)量與對(duì)照相比顯著升高，但是單鈴重均低于對(duì)照組，衣分較對(duì)照均有升高。將農(nóng)藝性狀與產(chǎn)量性狀進(jìn)行相關(guān)性分析，可得株高、果枝數(shù)、有效果枝數(shù)、鈴數(shù)、有效鈴數(shù)、單鈴重均與籽棉產(chǎn)量顯著相關(guān)，說(shuō)明增加這些農(nóng)藝性狀可提高籽棉產(chǎn)量。對(duì)纖維品質(zhì)進(jìn)行分析可得，轉(zhuǎn)GbHCT13品系的上半部平均長(zhǎng)度和長(zhǎng)度整齊度與對(duì)照相比顯著降低，轉(zhuǎn)GbHCT15品系的斷裂比強(qiáng)度有所升高；但是轉(zhuǎn)GbHCT13品系的伸長(zhǎng)率與對(duì)照相比略微升高，而轉(zhuǎn)GbHCT15品系的纖維伸長(zhǎng)更為明顯，推測(cè)其原因可能是HCT基因促使受體棉花的纖維伸長(zhǎng)，這與前人的研究結(jié)果^［34］一致。此外轉(zhuǎn)GbHCT13品系的成熟度與對(duì)照相比略有升高。

劉方等對(duì)轉(zhuǎn)基因材料的株高、果枝數(shù)、鈴數(shù)等農(nóng)藝性狀進(jìn)行了深入研究，在轉(zhuǎn)相同基因的高代材料性狀間，會(huì)存在部分基因分離現(xiàn)象，同時(shí)還會(huì)出現(xiàn)遺傳不穩(wěn)定或發(fā)生突變現(xiàn)象^［25］，本試驗(yàn)結(jié)果與其結(jié)論相吻合。在轉(zhuǎn)基因抗旱性分析與農(nóng)藝性狀的變異解析中，錢進(jìn)等得出，轉(zhuǎn)基因株系發(fā)生明顯的變化，如在有效果枝數(shù)、單鈴重和衣分上明顯高于對(duì)照^［26］，本試驗(yàn)中轉(zhuǎn)基因株系的株高、衣分都顯著高于對(duì)照組。

從本試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，在轉(zhuǎn)基因過(guò)程中插入的GbHCT基因可能是隨機(jī)的，在試驗(yàn)中，轉(zhuǎn)GbHCT13品系和轉(zhuǎn)GbHCT15品系的農(nóng)藝性狀與對(duì)照組相比有顯著或極顯著變化，結(jié)合文獻(xiàn)可知，某些農(nóng)藝性狀的正向增長(zhǎng)與部分減少可能與插入的位點(diǎn)有關(guān)^［27］。在轉(zhuǎn)基因過(guò)程中，基因插入的位點(diǎn)越隨機(jī)，基因的遺傳變異越廣泛，對(duì)農(nóng)藝性狀發(fā)生的變異越多，借此可根據(jù)現(xiàn)有的品種和育種目標(biāo)來(lái)篩選所需的轉(zhuǎn)基因品系^{［12，28］}。

3.4"轉(zhuǎn)基因品系農(nóng)藝性狀對(duì)產(chǎn)量的影響

棉花的纖維品質(zhì)與產(chǎn)量一直是人們關(guān)注的熱點(diǎn)，因此，科研人員從高產(chǎn)、保產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)和高效等目的出發(fā)，導(dǎo)入有利于棉花纖維伸長(zhǎng)與產(chǎn)量提高的優(yōu)異基因，為保障在棉花產(chǎn)量不變或增產(chǎn)的前提下提高棉花的纖維品質(zhì)，使棉花原棉產(chǎn)生更大效益。沒(méi)有優(yōu)良的基因，高產(chǎn)的作物就不會(huì)出現(xiàn)，所以將優(yōu)良的目的基因整合到受體中，改變受體的短板、弱點(diǎn)，使其達(dá)到優(yōu)異的棉花品質(zhì)，將棉花的農(nóng)藝性狀與產(chǎn)量關(guān)聯(lián)起來(lái)，可以選育出更加優(yōu)異的棉花新品種，對(duì)新品種選育有重要的指導(dǎo)意義。劉昌文等研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)增加棉花的株高和鈴數(shù)，可有效提高棉花的籽棉產(chǎn)量^［29］，本研究中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因品系的農(nóng)藝性狀（衣分除外）與籽棉產(chǎn)量呈極顯著正相關(guān)，因此可以根據(jù)農(nóng)藝性狀對(duì)棉花產(chǎn)量的影響進(jìn)行人為干擾，進(jìn)而提高棉花的產(chǎn)量及纖維品質(zhì)。

3.5"轉(zhuǎn)基因品系纖維品質(zhì)的改變

通過(guò)對(duì)比轉(zhuǎn)基因品系與Y1169的各項(xiàng)纖維品質(zhì)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因品系的各項(xiàng)指標(biāo)均發(fā)生了一定變化。通過(guò)測(cè)量纖維品質(zhì)的9個(gè)指標(biāo)得出，轉(zhuǎn)GbHCT15品系的大部分纖維品質(zhì)相較于對(duì)照升高，前人研究得出，HCT基因與棉花纖維細(xì)胞有關(guān)，而將GbHCT15基因?qū)胧荏w后，轉(zhuǎn)基因棉花的纖維品質(zhì)確有升高，更加證實(shí)GbHCT基因與棉花的纖維發(fā)育相關(guān)。此外，越來(lái)越多的研究表明，目的基因的導(dǎo)入能夠改變棉花纖維品質(zhì)^［30］；斷裂比強(qiáng)度的不同程度增加會(huì)使纖維增粗^［31］。其他與纖維不相關(guān)的基因?qū)朊藁ㄊ荏w后，與棉花纖維發(fā)育相關(guān)的基因也會(huì)不同程度地發(fā)生少許改變，如斷裂比強(qiáng)度會(huì)發(fā)生不同程度的增加，而馬克隆值降低，從而影響棉花纖維品質(zhì)的改變^［32］，本試驗(yàn)結(jié)果與之相符；前人通過(guò)將纖維長(zhǎng)度、斷裂比強(qiáng)度與纖維品質(zhì)進(jìn)行相關(guān)分析得出，轉(zhuǎn)基因植株纖維品質(zhì)明顯提高^［33］。

4"結(jié)論

通過(guò)除草劑篩選與PCR標(biāo)記基因檢測(cè)初步證明，以GbHCT基因已經(jīng)整合到陸地棉Y1169基因組中，再在室內(nèi)進(jìn)行加代檢測(cè)，以證明轉(zhuǎn)化的GbHCT基因能夠穩(wěn)定遺傳。與陸地棉Y1169相比，2個(gè)轉(zhuǎn)基因品系的株高均高于對(duì)照，轉(zhuǎn)GbHCT13品系的果枝數(shù)、有效果枝數(shù)與對(duì)照相比差異不顯著，而轉(zhuǎn)GbHCT15品系的這些農(nóng)藝性狀與對(duì)照相比均有顯著升高。增加果枝數(shù)、有效果枝數(shù)、鈴數(shù)、有效鈴數(shù)均可提高籽棉產(chǎn)量，農(nóng)藝性狀的改變可引起籽棉產(chǎn)量的改變，尤其是果枝數(shù)與籽棉產(chǎn)量間呈極顯著正相關(guān)；此外，鈴數(shù)和有效鈴數(shù)的增加也均能使籽棉產(chǎn)量增加。綜上，2個(gè)轉(zhuǎn)基因棉花品系纖維伸長(zhǎng)率較對(duì)照組均有所伸長(zhǎng)，說(shuō)明調(diào)控纖維發(fā)育的HCT基因?qū)胧荏w后，不僅可以促進(jìn)受體植株纖維的發(fā)育，還影響著受體植株的其他性狀。

參考文獻(xiàn)：

［1］國(guó)際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織. 2017年全球生物技術(shù)/轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化發(fā)展態(tài)勢(shì)［J］. 中國(guó)生物工程雜志，2018，38（6）：1-8.

［2］胡"娜，楊青軍. 不同類型玉米品種冠層結(jié)構(gòu)及光合性能研究［J］. 河南農(nóng)業(yè)，2018，3（7）：56-58.

［3］吳蘭花，鄭麗霞. 玉米害蟲的研究進(jìn)展［J］. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018，46（3）：53-58.

［4］Shaw P. Higher production and market demands：the Ontario corn economy［J］. Ontario Grain Farmer，2018，9（4）：12-13.

［5］康升云，潘"華，劉晶晶，等. 轉(zhuǎn)基因在農(nóng)作物生產(chǎn)上的應(yīng)用［J］. 南方農(nóng)機(jī)，2022，53（7）：19-21，25.

［6］Xu Z H，Yu M M，Yin Y W，et al. Generation of selectable marker-free soft transgenic rice with transparent kernels by downregulation of SSSII-2［J］. The Crop Journal，2020，8（1）：53-61.

［7］陳淼平. 氮肥對(duì)轉(zhuǎn)crylAb水稻抗稻縱卷葉螟和稻飛虱的影響［D］. 福州：福建農(nóng)林大學(xué)，2017.

［8］Yang G，Wang H Y，F(xiàn)eng M Y，et al. Integrated analysis of gene expression and methylation profiles of novel pancreatic cancer cell lines with highly metastatic activity［J］. Science China Life Sciences，2019，62（6）：791-806.

［9］Stadhouders R，Li B W S，de Bruijn M J W，et al. Epigenome analysis links gene regulatory elements in group 2 innate lymphocytes to asthma susceptibility［J］. Journal of Allergy and Clinical Immunology，2018，142（6）：1793-1807.

［10］Vianna G R，Aragao F J L，Rech E L. A minimal DNA cassette as a vector for genetic transformation of soybean （Glycine max）［J］. Genetics and Molecular Research，2011，10（1）：382-390.

［11］Rubi T L，Knowles L L，Dantzer B. Museum epigenomics：Characterizing cytosine methylation in historic museum specimens［J］. Molecular Ecology Resources，2020，20（5）：1161-1170.

［12］李海強(qiáng)，李號(hào)賓，王冬梅，等. 轉(zhuǎn)Bt Cry1Ac基因抗蟲棉花外源基因漂移研究［J］. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018，55（2）：277-284.

［13］Hoffmann L，Besseau S，Geoffroy P，et al. Silencing of hydroxycinnamoyl-coenzyme A shikimate/quinate hydroxycinnamoyl transferase affects phenylpropanoid biosynthesis［J］. Plant Cell，2004，16（6）：1446-1465.

［14］王雪霞，薛永常，趙文超. 木質(zhì)素生物合成中C3H/HCT的研究進(jìn)展［J］. 生命的化學(xué)，2008，28（5）：650-653.

［15］韓慶梅. 高蛋氨酸轉(zhuǎn)基因大豆的鑒定和遺傳穩(wěn)定性分析［D］. 哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015.

［16］李婧婧，周桂林，彭家成，等. 一種棉花DNA快速提取方法［J］. 分子植物育種，2015，13（3）：670-674.

［17］Lai X F，Gao H，Kong J，et al. Cloning and characterization of the glutamine synthetase gene from Chinese shrimp Fenneropenaeus chinensis［J］. Aquaculture International，2011，19（5）：873-889.

［18］劉晨曦，吳孔明. 轉(zhuǎn)基因棉花的研發(fā)現(xiàn)狀與發(fā)展策略［J］. 植物保護(hù)，2011，37（6）：11-17，26.

［19］溫莉嫻，周"菲，鄒玉蘭. 抗除草劑轉(zhuǎn)基因水稻的研究進(jìn)展［J］. 植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2018，45（5）：954-960.

［20］趙柯柯，劉"娜，于月華，等. GhMYB4轉(zhuǎn)基因棉花的鑒定及遺傳分析［J］. 分子植物育種，2018，16（22）：7304-7308.

［21］郭書巧，倪萬(wàn)潮，王慶南，等. 轉(zhuǎn)基因抗除草劑棉花的創(chuàng)制及產(chǎn)業(yè)化前景［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2012，28（5）：943-947.

［22］郭三堆，孫"豹，孟志剛，等. 轉(zhuǎn)抗蟲、抗除草劑基因棉花分子育種［C］//中國(guó)棉花學(xué)會(huì). 中國(guó)棉花學(xué)會(huì)2015年年會(huì)論文匯編. 昌吉，2015：57.

［23］要"煥. 轉(zhuǎn)AtACS基因棉花產(chǎn)量及纖維發(fā)育分析［D］. 開封：河南大學(xué)，2018.

［24］孫華軍，李國(guó)瑞，陳永勝，等. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化影響因素研究進(jìn)展［J］. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（24）：26-27，77.

［25］劉"方，王坤波，宋國(guó)立，等. 棉花轉(zhuǎn)基因材料的獲得及主要農(nóng)藝性狀變異分析［J］. 棉花學(xué)報(bào)，2009，21（1）：23-27.

［26］錢"進(jìn)，楊云堯，任燕萍，等. 轉(zhuǎn)MvNHX1基因棉花抗旱性研究和株系變異分析［J］. 分子植物育種，2014，12（1）：80-86.

［27］徐澤俊，聶以春，張獻(xiàn)龍，等. 轉(zhuǎn)雙價(jià)抗蟲基因棉花的主要農(nóng)藝性狀的遺傳變異［J］. 植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2011，12（1）：125-130.

［28］鄧艷鳳，肖水平，楊"秀，等. 早熟棉新品系的主要性狀分析與優(yōu)異品系篩選［J］. 亞熱帶農(nóng)業(yè)研究，2020，16（3）：145-152.

［29］劉昌文，宋義前，張"燕，等. 新疆主要早熟陸地棉農(nóng)藝性狀相關(guān)分析與評(píng)價(jià)研究［J］. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，45（5）：791-796.

［30］楊"君，馬峙英，王省芬. 棉花纖維品質(zhì)改良相關(guān)基因研究進(jìn)展［J］. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，49（22）：4310-4322.

［31］張燕紅，王冬梅，周小云，等. 轉(zhuǎn)Susy基因?qū)γ藁ㄞr(nóng)藝性狀的影響［J］. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，45（1）：61-65.

［32］連麗君，呂素蓮，李汝忠，等. 轉(zhuǎn)BetA/als基因棉花材料的農(nóng)藝性狀考察［J］. 棉花學(xué)報(bào)，2008，20（6）：447-451.

［33］陸國(guó)清，王春玲，郝宇瓊，等. 轉(zhuǎn)G10eve基因高抗草甘膦棉花的農(nóng)藝性狀分析［J］. 核農(nóng)學(xué)報(bào)，2018，32（2）：274-282.

［34］滕"露. 海島棉GbHCT基因在纖維發(fā)育中的功能分析［D］. 烏魯木齊：新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，2022.