戈盧別夫氏菌培養(yǎng)液對烤煙上部葉生理特性的影響

摘要：探討不同濃度戈盧別夫氏菌培養(yǎng)液處理對烤煙上部6張葉片農(nóng)藝性狀及碳氮代謝關(guān)鍵酶活性的影響，篩選出最佳濃度處理，旨在為提高煙葉品質(zhì)提供理論依據(jù)。以烤煙品種云煙87為試驗材料，采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，設(shè)置3個戈盧別夫氏菌培養(yǎng)液濃度水平（分別為1/10、1/30、1/50原液）進(jìn)行田間試驗，處理時間分別為打頂后0、7、14 d，在處理后每隔7 d測定1次農(nóng)藝形狀以及碳氮代謝關(guān)鍵酶活性。結(jié)果表明：（1）與1/10原液處理相比，1/50原液處理7 d后，對倒2葉、倒4葉的葉長、葉寬有明顯促進(jìn)作用；（2）各處理的SPAD值在處理后0～14 d隨處理次數(shù)的增加呈逐漸上升趨勢，在處理后21～28 d呈減少的趨勢；其中1/30原液處理煙葉后，倒2葉、倒4葉的SPAD值相較于對照降低效果最優(yōu)；（3）就碳代謝關(guān)鍵酶而言，在處理后28 d，頂葉SPS活性最高的是1/30原液處理，INV活性最高的是1/50原液處理；從上二棚氮代謝關(guān)鍵酶來看，在處理后28 d，在戈盧別夫氏菌各處理中，GS、NR活性最大的整體上是1/30原液處理。綜上，1/50原液處理能夠提升烤煙的葉長、葉寬、葉面積、開片度等農(nóng)藝性狀；從處理后28 d來看，1/30原液處理對碳氮代謝關(guān)鍵酶活性的促進(jìn)效果較為顯著。

關(guān)鍵詞：戈盧別夫氏菌；烤煙；上部葉；農(nóng)藝性狀；碳氮代謝關(guān)鍵酶

中圖分類號：S572.01""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）22-0078-07

煙草作為一種葉用經(jīng)濟(jì)作物，上部葉是其產(chǎn)量構(gòu)成的重要組成部分；而通過打頂去除頂端優(yōu)勢，易導(dǎo)致烤煙上部葉出現(xiàn)組織結(jié)構(gòu)緊密、葉片較厚、開片不佳、成熟度較低等問題^［1］。目前可通過外源施用植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對烤煙上部葉進(jìn)行調(diào)控。植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)有調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育和改善作物品質(zhì)等作用^［2］。吲哚乙酸（IAA）、赤霉酸（GA3）、脫落酸（ABA）、褪黑素（MT）等是目前在生產(chǎn)實踐中應(yīng)用較多的植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)^［3］。李健忠發(fā)現(xiàn)，打頂后噴施油菜素內(nèi)酯和生長素能增強(qiáng)煙株的碳氮代謝強(qiáng)度，從而提高煙葉的產(chǎn)量和質(zhì)量^［4］。孫丹通過對打頂后煙葉涂抹NAA處理，發(fā)現(xiàn)NAA可調(diào)控烤煙碳氮代謝的平衡，提高烤煙的產(chǎn)量和品質(zhì)^［5］。張艾改研究表明，噴施葡萄糖能顯著提高煙株的INV、NR、GS活性，有利于煙葉品質(zhì)的提高^［6］。王春恒等研究發(fā)現(xiàn)，外源γ-氨基丁酸可增加葡萄葉片內(nèi)源γ-氨基丁酸的含量，進(jìn)而增強(qiáng)碳氮代謝相關(guān)酶活性^［7］。碳氮代謝是烤煙成熟過程中較為關(guān)鍵的部分，與烤后煙葉品質(zhì)的形成有著密不可分的關(guān)系；為收獲優(yōu)質(zhì)煙葉，可在煙葉生長發(fā)育和成熟過程中采取一定的措施，以促進(jìn)煙葉碳氮代謝的平衡協(xié)調(diào)^［8］。因此，調(diào)控植物體內(nèi)碳氮代謝平衡是調(diào)節(jié)煙葉品質(zhì)的一項重要措施。

前人的研究大多集中在1種或少數(shù)幾種植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)上，鮮少見到針對多種植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)共同作用的研究，迄今還未見戈盧別夫氏菌對烤煙上部葉生長發(fā)育以及碳氮代謝酶活性影響等方面的研究。因此，本研究以云煙87為試驗材料，探討戈盧別夫氏菌培養(yǎng)液對烤煙上部6張葉片農(nóng)藝性狀、SPAD值等的影響，旨在為提高煙葉品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1"材料與方法

1.1"材料

供試烤煙品種為云煙87，戈盧別夫氏菌菌株由貴州省煙草品質(zhì)研究重點實驗室提供。馬鈴薯葡萄糖（PD）培養(yǎng)液參照趙晨心等的方法^［9］制備。取25 ℃條件下在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）上培養(yǎng)12 d 的菌塊，使用5 mm×5 mm打孔器打孔，挑菌塊接種于盛有150 mL馬鈴薯葡萄糖（PD）液體培養(yǎng)基的三角瓶中，置于25 ℃、130 r/min的恒溫?fù)u床內(nèi)培養(yǎng)5～7 d后，8 000 r/min離心5 min，上清液即為試驗用戈盧別夫氏菌培養(yǎng)液原液。本試驗采用的戈盧別夫氏菌（Golubevia pallescens）是筆者所在課題組前期從錦繡杜鵑上分離鑒定出來的。通過靶向代謝組學(xué)鑒定，戈盧別夫氏菌培養(yǎng)液中含有8種植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，其含量從高到低分別為亞精胺（spermidine），976.82 ng/mL；組胺（histamine），23.40 ng/mL；脫落酸（ABA），20.87 ng/mL；茉莉酸（JA），5.14 ng/mL；吲哚乙酸（IAA），4.85 ng/mL；反式玉米素（trans-Zeatin），2.85 ng/mL；赤霉素（GA4），1.65 ng/mL；褪黑素（MT），1.10 ng/mL。

1.2"方法

1.2.1"試驗設(shè)計

試驗于2022年7—9月年在貴州省黔東南州鎮(zhèn)遠(yuǎn)縣煙草科技園舞陽煙葉站（27°03′N，108°25′E）進(jìn)行。共設(shè)3個不同濃度處理與1個清水對照。A處理：戈盧別夫氏菌1/10原液；B處理：戈盧別夫氏菌1/30原液；C處理：戈盧別夫氏菌1/50原液；CK：清水對照。選取地形平緩、土壤肥力均勻、植株生長狀況一致的煙田進(jìn)行試驗，水肥管理與當(dāng)?shù)卮筇锕芾泶胧┮恢隆Ｔ囼灢捎猛耆S機(jī)區(qū)組設(shè)計，處理間設(shè)保護(hù)行，每個處理40株，重復(fù)3次，共12個小區(qū)480株。

打頂當(dāng)天開始處理，用無菌水將淺色戈盧別夫氏菌培養(yǎng)液稀釋為不同濃度，每次噴施上部6張葉片正反面（頂葉3張、上二棚3張，即打頂后從上往下數(shù)6張葉片），單株噴液量為10 mL（以葉片正反面均勻形成細(xì)霧狀欲滴小液珠為準(zhǔn)）。隨后每隔 7 d 處理1次。處理時期為打頂后0、7、14 d，共計處理3次。

在每個小區(qū)內(nèi)隨機(jī)選取生長相似、大小適宜的3株定株觀察，用于農(nóng)藝性狀和SPAD值的觀測。處理前先取樣，每次取1株，分2個部分采集上部葉片（頂葉、上二棚），在試驗地用液氮速凍后，放入干冰保存，后放入實驗室-80 ℃冰箱保存待測。每隔 7 d 進(jìn)行1次取樣和指標(biāo)測定，分別為0、7、14、21、28 d。

1.2.2"農(nóng)藝性狀的測定

用軟尺測量定株第2、4葉位的葉長、葉寬，計算開片度和葉面積，公式如下：

開片度=葉寬/葉長；

葉面積=葉長×葉寬×0.634 5。

參照YC/T142—2010《煙草農(nóng)藝性狀調(diào)查測量方法》執(zhí)行。

1.2.3"煙葉SPAD值的測定

選取定株從上至下第2、4葉（從上至下依次編號為倒1～6葉），使用SPAD值-502葉綠素儀分別測定每片煙葉的葉基、葉中、葉尖的SPAD值，測定部位為葉緣和主脈間的中間部位，測定SPAD值的加權(quán)平均值為該片煙葉的SPAD值。

1.2.4"碳氮代謝關(guān)鍵酶活性的測定

硝酸還原酶（NR）、谷氨酰胺合成酶（GS）、蔗糖磷酸合成酶（SPS）、蔗糖轉(zhuǎn)化酶（INV）、可溶性淀粉酶（SSS）等5種碳氮代謝關(guān)鍵酶的活性，均采用蘇州格銳思試劑盒測定。

1.2.5"數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)采用Excel 2017整理，采用SPSS 27軟件進(jìn)行Duncan^，s分析。

2"結(jié)果與分析

2.1"對烤煙農(nóng)藝性狀的影響

倒2葉各處理的農(nóng)藝性狀見表1。在處理后7 d，倒2葉中，葉長最長的是C處理（1/50原液），為63.61 cm，比A處理（1/10原液）顯著提高 9.39%，但與其余處理之間不存在顯著差異；葉寬最大的為C處理，為18.50 cm，顯著高于A、B處理，分別提高了14.91%、19.34%；葉面積最大的為C處理，為746.82 cm²，顯著高于A、B處理。在處理后14 d，葉長、葉寬、葉面積最大的是B處理（1/30原液），分別為69.40 cm、20.14 cm、888.19 cm²。處理后 21 d，以C處理的葉寬、開片度、葉面積為最大，分別是 20.73 cm、0.30、893.11 cm²。處理后28 d，以C處理的葉寬、葉面積為最大，分別是21.88 cm、961.61 cm²。綜合各時期各處理的農(nóng)藝性狀來看，不同濃度的戈盧別夫氏菌培養(yǎng)液對烤煙倒2葉生長均有明顯促進(jìn)作用，其中以C處理（1/50原液）的效果最佳。

倒4葉各處理的農(nóng)藝性狀見表2。不同濃度的戈盧別夫氏菌培養(yǎng)液處理后7 d，以C處理倒4葉的葉寬、開片度、葉面積最大，分別為23.38 cm、0.30、1 062.44 cm²。處理后14 d，以B處理的葉寬、葉面積最大，分別是23.42 cm、1 139.08 cm²；處理后 21 d，以C處理的葉長、葉寬、葉面積最大，分別是77.01 cm、23.74 cm、1 163.18 cm²。處理后 28 d，以B處理的葉長、葉寬、葉面積最大，分別是78.71 cm、24.76 cm、1 240.38 cm²。綜合各時期各處理的農(nóng)藝性狀來看，戈盧別夫氏菌培養(yǎng)液對烤煙倒4葉有促進(jìn)生長的作用，其中以C處理（1/50原液）的效果最佳，B處理（1/30原液）效果次之。

2.2"對烤煙SPAD值的影響

由表3可知，處理后7 d，B處理的倒2葉SPAD值最低，為28.18，與CK相比顯著降低9.62%。處理后14 d，A處理的倒2葉SPAD值顯著低于CK，降低9.24%；C處理的倒4葉SPAD值顯著高于B處理，提高5.18%。處理后21 d，A、B、C處理后的倒2葉SPAD值均顯著高于CK，分別提高了22.36%、9.87%、13.94%。處理后28 d，C處理的倒4葉SPAD值顯著高于其余處理，比CK提高20.42%。

總體而言，處理后7～14 d，各處理的SPAD值表現(xiàn)趨勢一致，均逐漸升高，表明葉綠素含量增加；處理后14～28 d，各處理的SPAD值呈現(xiàn)逐漸降低趨勢，表明葉綠素含量逐漸減少，葉片趨于成熟。

2.3"對烤煙碳代謝關(guān)鍵酶活性的影響

由圖1可知，不同濃度戈盧別夫氏菌培養(yǎng)液處理3次，對烤煙上部葉SPS活性的影響不同。圖1-a中，處理后7 d，各處理的頂葉SPS活性與對照之間不存在顯著差異。處理后14 d，A、B、C處理的SPS活性均顯著高于CK，分別提高50.74%、16.22%、22.62%。處理后21 d，各處理與對照之間不存在顯著差異。處理后28 d，B處理顯著高于A處理、C處理、CK，分別提高161.63%、70.42%、64.70%。

圖1-b中，處理后7 d，各處理的上二棚SPS活性與對照之間不存在顯著差異。處理后14 d，A處理的SPS活性顯著高于C處理、CK，分別提高51.73%、51.45%。處理后21 d，培養(yǎng)液各處理與對照沒有顯著差異。處理后28 d，A、B、C處理均顯著高于CK，分別提高36.96%、21.87%、76.13%，其中以C處理（1/50原液）SPS活性最高，為 469.25 μg/（g·min）。

由圖2可知，不同濃度戈盧別夫氏菌培養(yǎng)液處理3次對烤煙上部葉的INV活性影響不同。圖2-a中，處理后7 d，A、B、C處理的頂葉INV活性均顯著高于對照，分別增加251.29%、245.01%、321.20%。處理后14 d，C處理的頂葉INV活性最高，為463.70 μg/（g·min），較CK顯著提高61.42%。處理后21 d，A處理的INV活性較CK顯著提高33.12%。 處理后28 d，A、C處理的INV活性均顯著高于CK，分別提高15.34%、15.95%，其中以C處理的頂葉INV活性最高，為64.12 μg/（g·min）。

圖2-b中，處理后7 d，C處理的上二棚INV活性最高，為552.95 μg/（g·min），較CK顯著提高43.09%。處理后14 d，各處理的上二棚INV活性顯著低于CK。處理后21 d，各處理與CK之間不存在顯著差異，其中以C處理最高，為100.89 μg/（g·min）。處理后28 d，各處理顯著低于CK。

不同濃度戈盧別夫氏菌培養(yǎng)液處理3次對烤煙上部葉SSS活性變化趨勢見圖3。圖3-a中，處理后7 d，B處理的頂葉SSS活性顯著高于A、C處理，分別提高56.11%、76.50%。處理后14 d，B處理的頂葉SSS活性較C處理顯著提高198.68%。處理后21 d，B處理的頂葉SSS活性與CK相比，顯著增加153.43%。處理后28 d，B處理的頂葉SSS活性比A處理顯著提高40.78%。

圖3-b中，處理后7 d，C處理的上二棚SSS活性最高，為6.75 nmol/（g·min）。處理后14 d，各處理與對照之間不存在顯著差異。處理后21 d，A、B處理的上二棚SSS活性顯著高于CK，分別提高103.48%、56.65%。處理后28 d，B、C處理的上二棚SSS活性均顯著高于A處理，分別提高69.46%、52.21%。處理后0～7 d，A、B、C處理的頂葉SSS活性總體呈增加的趨勢；處理7～21 d，SSS活性呈減少的趨勢；處理21～28 d，SSS活性又呈增加的趨勢。

2.4"對烤煙氮代謝關(guān)鍵酶活性的影響

由圖4可知，不同濃度戈盧別夫氏菌培養(yǎng)液處理3次對烤煙上部葉NR活性影響不同。圖4-a中，處理后7 d，A、B、C處理的頂葉NR活性均顯著低于CK，分別降低56.69%、68.21%、36.58%；各培養(yǎng)液處理中以C處理的頂葉NR活性最高，為486.07 nmol/（g·h）。處理后14 d，各處理之間不存在顯著差異。處理后28 d，A、B處理的頂葉NR活性均較CK顯著提高，分別提高90.49%、35.70%。

圖4-b中，處理后7 d，B、C處理 的上二棚NR活性顯著高于CK，分別提高30.40%、82.24%。處理后14 d，各培養(yǎng)液處理與對照之間均不存在顯著差異。處理后21 d，A處理的上二棚NR活性與CK相比無顯著差異，B、C處理均顯著低于CK。處理后28 d，B處理的上二棚NR活性顯著高于CK，提高156.54%。

由圖5可知，不同濃度戈盧別夫氏菌培養(yǎng)液處理3次對烤煙上部葉GS活性影響不同。圖5-a中，處理后7 d，B處理的頂葉GS活性顯著高于CK，提高24.98%。處理后14 d，各處理之間頂葉GS活性不存在顯著差異。處理后21 d，A處理的頂葉GS活性較CK顯著降低。處理后28 d，C處理的頂葉GS活性較CK顯著降低。

圖5-b中，處理后21 d，A、C處理的上二棚GS活性較CK顯著降低，分別降低24.47%、21.60%。處理后28 d，除C處理的上二棚GS活性顯著低于CK外，其余處理與CK間沒有顯著差異。

3"結(jié)論與討論

因葉綠素含量在烤煙葉片成熟過程中有明顯的變化，易于觀察測定，故常作為判斷煙葉成熟度的重要指標(biāo)。在生產(chǎn)實踐中，常將田間煙葉SPAD值與煙葉外觀顏色特征相結(jié)合，作為確定煙葉成熟度的重要依據(jù)^［10-11］。趙環(huán)宇的研究表明，噴施氯吡苯脲、生長素、6-芐氨基嘌呤等植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，可顯著提高煙株上部葉的葉綠素含量^［12］。本試驗中，烤煙上部葉的SPAD值在不同濃度戈盧別夫氏菌培養(yǎng)液處理后21 d均有所提高；倒2葉中，以A處理（1/10原液）作用最為顯著，倒4葉中，以C處理（1/50原液）作用最好，B處理（1/30原液）次之，這與朱振國等的結(jié)論^［13］一致。

在煙草成長過程中，碳氮代謝的速度、平衡狀況及其動態(tài)變化，會直接改變煙草中各種化學(xué)物質(zhì)的濃度與含量，進(jìn)而影響煙草質(zhì)量^［14］。生產(chǎn)上，可通過生物、化工、農(nóng)藝等手段有針對性地對碳氮代謝的相關(guān)酶活力加以調(diào)控，以協(xié)調(diào)碳氮代謝進(jìn)程，從而提高上部葉的煙草化學(xué)成分協(xié)調(diào)性，改善煙葉品質(zhì)^［15-16］。陳富彩發(fā)現(xiàn)，外源GA3、IAA配施有利于提高硝酸還原酶活性，對淀粉酶活性、轉(zhuǎn)化酶活性的提高具有極顯著的促進(jìn)作用^［17］。任志廣的研究表明，赤霉素與鉀肥互作可顯著提高烤煙上部葉的碳氮代謝酶活性，說明二者交互處理能增強(qiáng)上部葉的碳氮代謝強(qiáng)度，有利于煙葉品質(zhì)形成^［18］。陳明珠等的研究表明，日本外擔(dān)菌處理煙草葉片后，對碳氮代謝關(guān)鍵酶活性有顯著提高作用^［19］。

硝酸還原酶（NR）、谷氨酰胺合成酶（GS）作為高等植物生長發(fā)育過程中的關(guān)鍵酶，其活性在一定程度上反映了植物氮代謝的強(qiáng)度^［20-22］。本試驗結(jié)果表明，不同濃度戈盧別夫氏菌培養(yǎng)液處理3次后，烤煙上部葉氮代謝關(guān)鍵酶活性提高，從效果上來看，處理后28 d，A處理、B處理對頂葉效果較好，B處理對上二棚處理效果較好。

植物碳代謝過程需要包含蔗糖磷酸合成酶（SPS）、可溶性淀粉酶（SSS）以及蔗糖轉(zhuǎn)化酶（INV）等在內(nèi)的多種關(guān)鍵酶共同參與，各種關(guān)鍵酶的活性可作為判斷碳代謝強(qiáng)度的重要依據(jù)^［23］；提高INV活性可加速蔗糖的合成^［24］；SPS作為蔗糖合成過程中的關(guān)鍵酶，其活性的強(qiáng)弱可代表葉片光合產(chǎn)物轉(zhuǎn)化能力^［25］；SSS與支鏈淀粉形成有關(guān)，參與淀粉合成且能影響淀粉結(jié)構(gòu)^［26］。本試驗中，不同濃度戈盧別夫氏菌培養(yǎng)液處理3次在一定程度上促進(jìn)了烤煙上部葉不同碳代謝酶活性的增加，其中B處理（1/30原液）效果較好。

在本試驗中，烤煙上部SPAD值經(jīng)不同濃度戈盧別夫氏菌培養(yǎng)液處理3次后均有所提高，處理后21 d，各處理的SPAD值均顯著高于對照；處理后 28 d，B處理（1/30原液）的碳氮代謝酶活性顯著增加。 綜上，1/50原液處理促進(jìn)烤煙上部6片葉生長發(fā)育，1/30原液處理促進(jìn)碳氮代謝關(guān)鍵酶活性調(diào)控效果最明顯，有利于煙株上部葉化學(xué)品質(zhì)提高。后續(xù)還需進(jìn)一步探究戈盧別夫氏菌培養(yǎng)液對煙葉產(chǎn)生調(diào)控作用的分子機(jī)制，以期為生產(chǎn)實踐提供一定的理論基礎(chǔ)，為不同地區(qū)、不同品種烤煙的使用提供技術(shù)指導(dǎo)。

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