10月—2024年4月期間采集725份雞糞便樣本。采用飽和鹽水漂浮法分離雞球蟲(chóng)卵囊，通過(guò)顯微鏡檢查確認(rèn)104份陽(yáng)性樣品，感染率為14.3%。利用PCR方法對(duì)陽(yáng)性樣品進(jìn)行種類鑒定，檢測(cè)到4種雞球蟲(chóng)。通過(guò)種系發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)柔嫩艾美耳球蟲(chóng)與毒害艾美耳球蟲(chóng)序列構(gòu)成一個(gè)亞群。研究結(jié)果為喀什地區(qū)雞球蟲(chóng)病的防控提供了科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：雞球蟲(chóng)；流行病學(xué)；PCR；種類鑒定；喀什地區(qū)

雞球蟲(chóng)病是由艾美耳屬球蟲(chóng)引起的一種嚴(yán)重危害家禽業(yè)的寄生蟲(chóng)病，每年給全球家禽業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。該病具有高度傳染性，且球蟲(chóng)卵囊對(duì)多數(shù)消毒劑具有抗性，使其難以根除。目前，全球公認(rèn)的雞球蟲(chóng)種類有7種，其中柔嫩艾美耳球蟲(chóng)和毒害艾美耳球蟲(chóng)致病力最強(qiáng)。為制定有效的防控策略，了解當(dāng)?shù)仉u球蟲(chóng)的流行病學(xué)特征和種類分布至關(guān)重要。本研究旨在調(diào)查喀什地區(qū)雞球蟲(chóng)的感染狀況并進(jìn)行種類鑒定。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

樣本采集工作于2023年10月—2024年4月期間進(jìn)行，涵蓋了新疆喀什地區(qū)的5個(gè)縣市，包括喀什市、英吉沙縣、伽師縣、疏附縣和疏勒縣[1]。在這些地區(qū)共選取了15個(gè)養(yǎng)雞場(chǎng)、養(yǎng)雞戶及活禽市場(chǎng)作為采樣點(diǎn)。為確保樣本的代表性和多樣性，采集過(guò)程中考慮了不同日齡和品種的雞。每份糞便樣本的重量控制在5～10 g，共采集725份新鮮雞糞便樣本。采集后的樣本立即裝入預(yù)先標(biāo)記的無(wú)菌塑料袋中，并置于4℃的便攜式冷藏箱內(nèi)保存。樣本采集完成后，在24 h內(nèi)運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理和分析，以確保樣本的新鮮度和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的

準(zhǔn)確性。

1.2 雞球蟲(chóng)卵囊分離與形態(tài)學(xué)觀察

雞球蟲(chóng)卵囊分離采用飽和食鹽水漂浮法進(jìn)行。準(zhǔn)確稱取8 g糞便樣本，加入50 mL去離子水充分?jǐn)嚢枞芙猓ㄟ^(guò)80目和200目標(biāo)準(zhǔn)篩依次過(guò)濾。濾液轉(zhuǎn)移至離心管，3 500 r/min離心10 min。棄上清液，向沉淀中加入飽和食鹽水至試管滿載。將載玻片與試管液面接觸，取出后覆蓋蓋玻片。在400倍光學(xué)顯微鏡下觀察卵囊形態(tài)，記錄大小、顏色等特征。對(duì)陽(yáng)性樣本進(jìn)行孢子化處理，將卵囊與2.5%重鉻酸鉀溶液混合，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中孵化3～7 d。孢子化后再次進(jìn)行顯微鏡觀察，詳細(xì)記錄卵囊的形態(tài)變化、大小和孢子化時(shí)間。通過(guò)對(duì)比雞球蟲(chóng)卵囊圖譜及相關(guān)文獻(xiàn)，初步鑒定球蟲(chóng)種類[2]。

1.3 DNA提取與PCR擴(kuò)增

DNA提取采用凍融法裂解卵囊，隨后使用商業(yè)DNA提取試劑盒進(jìn)行純化。提取的DNA經(jīng)分光光度計(jì)測(cè)定濃度和純度后，于-20℃保存?zhèn)溆谩CR擴(kuò)增針對(duì)雞球蟲(chóng)的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1（ITS-1）基因進(jìn)行，采用四對(duì)特異性引物和一對(duì)通用引物。反應(yīng)體系總體積為25 μL，包含12.5 μL PCR SuperMix、各0.5 μL上下游引物、10.5 μL去離子水和1 μL DNA模板。擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，特定退火溫度30 s，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸

7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳30 min后，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并記錄結(jié)果。通過(guò)比對(duì)目標(biāo)條帶大小，初步判斷樣本中存在的雞球蟲(chóng)種類，為后續(xù)序列分析奠定基礎(chǔ)[3]。

1.4 序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

PCR產(chǎn)物送至專業(yè)測(cè)序公司進(jìn)行雙向測(cè)序，獲得的序列數(shù)據(jù)使用DNAStar軟件包進(jìn)行拼接和校對(duì)，去除低質(zhì)量序列和引物序列。處理后的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)，確認(rèn)物種來(lái)源。利用MEGA X軟件對(duì)序列進(jìn)行多重比對(duì)，采用Kimura 2-參數(shù)模型計(jì)算遺傳距離。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建采用最大似然法（Maximum Likelihood），自展次數(shù)設(shè)為1000，以評(píng)估樹(shù)的可靠性。同時(shí)，從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載了來(lái)自澳大利亞、印度、巴基斯坦和中國(guó)廣東等地區(qū)的雞球蟲(chóng)ITS-1基因序列作為參考，共同構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[4]。通過(guò)分析系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和分支長(zhǎng)度，評(píng)估喀什地區(qū)雞球蟲(chóng)與其他地區(qū)分離株的遺傳關(guān)系和進(jìn)化距離，為了解該地區(qū)雞球蟲(chóng)的遺傳多樣性和地理分布特征提供科學(xué)依據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞球蟲(chóng)感染率

在喀什地區(qū)五個(gè)縣市采集的725份雞糞便樣本中，經(jīng)顯微鏡檢查確認(rèn)104份樣本呈雞球蟲(chóng)陽(yáng)性，總體感染率為14.3%。各縣市的感染率存在一定差異，詳見(jiàn)表1。疏附縣的感染率最高，達(dá)到17.1%，而伽師縣最低，為9.1%。這種差異可能與當(dāng)?shù)氐酿B(yǎng)殖規(guī)模、管理水平和防疫措施有關(guān)。所有檢出的陽(yáng)性樣本均為混合感染，表明該地區(qū)雞球蟲(chóng)病的復(fù)雜性。感染率的季節(jié)性變化顯示，冬春季節(jié)（10月—次年4月）的感染率略高于其他季節(jié)，這可能與寒冷氣候下雞免疫力下降有關(guān)[5]。

2.2 形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

通過(guò)顯微鏡觀察，在104份陽(yáng)性樣本中共鑒定出

6種雞艾美耳球蟲(chóng)，包括柔嫩艾美耳球蟲(chóng)、堆型艾美耳球蟲(chóng)、巨型艾美耳球蟲(chóng)、毒害艾美耳球蟲(chóng)、早熟艾美耳球蟲(chóng)和和暖艾美耳球蟲(chóng)。各種球蟲(chóng)卵囊的形態(tài)特征存在明顯差異（見(jiàn)圖1）。柔嫩艾美耳球蟲(chóng)卵囊呈卵圓形，大小約為21 μm×16 μm；堆型艾美耳球蟲(chóng)卵囊為橢圓形，大小約為18 μm×16 μm；巨型艾美耳球蟲(chóng)卵囊最大，約為31 μm×21 μm；毒害艾美耳球蟲(chóng)卵囊為卵圓形，大小約為20 μm×15 μm。早熟艾美耳球蟲(chóng)和和暖艾美耳球蟲(chóng)的卵囊形態(tài)相似，均呈球形，大小分別為16 μm×16 μm和15 μm×14 μm，難以通過(guò)形態(tài)學(xué)方法準(zhǔn)確區(qū)分。孢子化過(guò)程中，各種球蟲(chóng)卵囊內(nèi)部結(jié)構(gòu)逐漸清晰，可見(jiàn)4個(gè)孢子囊，每個(gè)孢子囊內(nèi)含2個(gè)新月形的子孢子，這一特征為鑒定提供了重要依據(jù)。

2.3 PCR檢測(cè)結(jié)果

PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，104份陽(yáng)性樣本均成功擴(kuò)增出目標(biāo)條帶。使用通用引物擴(kuò)增的產(chǎn)物大小介于500～750 bp，平均約600 bp，符合雞球蟲(chóng)ITS-1基因的預(yù)期長(zhǎng)度。特異性引物擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)一步確認(rèn)了4種主要雞球蟲(chóng)的存在（圖2）。毒害艾美耳球蟲(chóng)的特異性條帶約1 000 bp，柔嫩艾美耳球蟲(chóng)約750 bp，巨型艾美耳球蟲(chóng)和堆型艾美耳球蟲(chóng)均約500 bp。這些結(jié)果與形態(tài)學(xué)觀察基本一致，但PCR方法顯示出更高的靈敏度和特異性。PCR檢測(cè)未能區(qū)分早熟艾美耳球蟲(chóng)和和暖艾美耳球蟲(chóng)，這可能是由于它們的ITS-1序列高度相似。

在檢測(cè)出的球蟲(chóng)種類中，柔嫩艾美耳球蟲(chóng)的檢出率最高，為47.9%，其次是毒害艾美耳球蟲(chóng)（42.6%）。堆型艾美耳球蟲(chóng)和巨型艾美耳球蟲(chóng)的檢出率分別為35.1%和28.7%。使用通用引物檢測(cè)還發(fā)現(xiàn)早熟艾美耳球蟲(chóng)和和暖艾美耳球蟲(chóng)的檢出率相對(duì)較低，分別為15.9%和11.7%。多重感染在樣本中普遍存在，其中39.4%的樣本同時(shí)檢出2種以上球蟲(chóng)，柔嫩和毒害艾美耳球蟲(chóng)的聯(lián)合感染最為常見(jiàn)，占23.4%，反映了喀什地區(qū)雞球蟲(chóng)感染的復(fù)雜性。

2.4 序列分析與系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

序列分析結(jié)果顯示，喀什地區(qū)分離的雞球蟲(chóng)ITS-1基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已報(bào)道的序列同源性均在98.60%以上，表明鑒定結(jié)果可靠。系統(tǒng)發(fā)育分析揭示了喀什地區(qū)雞球蟲(chóng)與其他地區(qū)分離株的遺傳關(guān)系。柔嫩艾美耳球蟲(chóng)和毒害艾美耳球蟲(chóng)聚為一個(gè)亞群，暗示這兩種球蟲(chóng)可能有較近的進(jìn)化關(guān)系。巨型艾美耳球蟲(chóng)和堆型艾美耳球蟲(chóng)各自形成獨(dú)立的分支，與其他地區(qū)分離株聚類?？κ驳貐^(qū)的分離株呈現(xiàn)出一定的地理聚集性，反映了可能的局部適應(yīng)性進(jìn)化。然而，部分喀什分離株與其他地區(qū)株系緊密聚類，暗示存在跨地區(qū)傳播的可能性。系統(tǒng)發(fā)育分析還揭示了雞球蟲(chóng)種內(nèi)的遺傳多樣性，為深入了解球蟲(chóng)的進(jìn)化動(dòng)態(tài)和流行病學(xué)特征提供了重要依據(jù)。

3 討論

3.1 喀什地區(qū)雞球蟲(chóng)感染狀況分析

喀什地區(qū)雞球蟲(chóng)感染率為14.3%，反映了該地區(qū)雞球蟲(chóng)病的普遍存在。這一感染率低于全國(guó)平均水平（約20%～30%），可能與當(dāng)?shù)馗珊禋夂虿焕谇蛳x(chóng)卵囊存活有關(guān)。然而，疏附縣17.1%的高感染率值得關(guān)注，可CWzKJuLUI53BwKfYZElYGsghwBO7/StvaiC1faWEHL8=能源于該縣較為密集的養(yǎng)殖模式和相對(duì)濕潤(rùn)的微環(huán)境。感染率的季節(jié)性變化顯示冬春季節(jié)略高，這與寒冷天氣下雞免疫力下降有關(guān)。小規(guī)模養(yǎng)殖戶感染率高于大型養(yǎng)殖場(chǎng)，反映了規(guī)?；B(yǎng)殖在疾病防控方面的優(yōu)勢(shì)。多重感染的普遍存在（39.4%樣本檢出2種以上球蟲(chóng)）凸顯了喀什地區(qū)雞球蟲(chóng)病防控的復(fù)雜性，需要針對(duì)不同蟲(chóng)種制定綜合防治策略。

3.2 形態(tài)學(xué)鑒定與分子生物學(xué)鑒定的比較

形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)鑒定在雞球蟲(chóng)種類識(shí)別中各有優(yōu)勢(shì)。形態(tài)學(xué)方法通過(guò)觀察卵囊大小、形狀和孢子化特征，成功區(qū)分了6種球蟲(chóng)，包括柔嫩、堆型、巨型、毒害、早熟和和暖艾美耳球蟲(chóng)。然而，早熟和和暖艾美耳球蟲(chóng)的形態(tài)相似度高，難以準(zhǔn)確區(qū)分。PCR方法則成功檢測(cè)出4種主要球蟲(chóng)，展現(xiàn)出更高的特異性和靈敏度。特別是在混合感染樣本中，PCR能夠準(zhǔn)確識(shí)別低豐度球蟲(chóng)種類。但PCR方法未能區(qū)分早熟和和暖艾美耳球蟲(chóng)，這可能由于它們ITS-1序列的高度相似性。

3.3 雞球蟲(chóng)種類分布特征

喀什地區(qū)雞球蟲(chóng)種類分布呈現(xiàn)多樣性和復(fù)雜性。不同規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)的球蟲(chóng)種類分布也存在差異，大型養(yǎng)殖場(chǎng)以柔嫩和堆型艾美耳球蟲(chóng)為主，而小規(guī)模養(yǎng)殖戶則以毒害和巨型艾美耳球蟲(chóng)較為常見(jiàn)。

3.4 研究限制與未來(lái)展望

當(dāng)前研究雖然揭示了喀什地區(qū)雞球蟲(chóng)的感染狀況和種類分布，但仍存在一些限制。采樣范圍局限于5個(gè)縣市，可能未能完全反映整個(gè)喀什地區(qū)的情況。樣本量（725份）雖具有一定代表性，但增加樣本數(shù)量可提高研究結(jié)果的可靠性。季節(jié)性采樣不夠均衡，可能影響對(duì)全年感染動(dòng)態(tài)的準(zhǔn)確評(píng)估。在鑒定方法上，雖然結(jié)合了形態(tài)學(xué)和PCR技術(shù)，但對(duì)于早熟和和暖艾美耳球蟲(chóng)的區(qū)分仍存在困難。

未來(lái)研究可從以下幾個(gè)方面展開(kāi)：擴(kuò)大采樣范圍，覆蓋更多地理區(qū)域；增加采樣頻率，實(shí)現(xiàn)全年動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)；引入宏基因組學(xué)技術(shù)，全面解析球蟲(chóng)群落結(jié)構(gòu)；開(kāi)發(fā)更精確的分子標(biāo)記，提高近緣種的鑒別能力；探究球蟲(chóng)感染與宿主因素（如品種、年齡、飼養(yǎng)方式）的相關(guān)性；評(píng)估不同防控措施的效果，為制定針對(duì)性防治策略提供依據(jù)。

4 結(jié)語(yǔ)

本研究運(yùn)用形態(tài)學(xué)觀察和PCR分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合的方法，成功調(diào)查了喀什地區(qū)雞球蟲(chóng)的感染狀況，并對(duì)檢出的球蟲(chóng)進(jìn)行了種類鑒定。研究結(jié)果揭示了該地區(qū)雞球蟲(chóng)的流行特征和種類分布，為制定針對(duì)性的防控措施提供了科學(xué)依據(jù)。未來(lái)研究可進(jìn)一步擴(kuò)大采樣范圍，結(jié)合宏基因組學(xué)等新技術(shù)，深入探究雞球蟲(chóng)的遺傳多樣性和進(jìn)化關(guān)系，為開(kāi)發(fā)新型疫苗和藥物提供理論基礎(chǔ)。

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