摘要：疫苗是控制動(dòng)物疫病的重要手段，傳統(tǒng)疫苗的設(shè)計(jì)理念為人類與動(dòng)物疫病的防控做出巨大貢獻(xiàn)。隨著分子生物學(xué)、免疫學(xué)等學(xué)科的發(fā)展和技術(shù)的進(jìn)步，現(xiàn)代疫苗技術(shù)在疫苗研發(fā)上的優(yōu)勢(shì)愈發(fā)明顯。本文從傳統(tǒng)疫苗與新型疫苗的研發(fā)切入，結(jié)合免疫學(xué)、病原學(xué)、生物醫(yī)藥等學(xué)科，淺析新型疫苗的設(shè)計(jì)思路，以期為研發(fā)更加安全有效的疫苗提供參考。

關(guān)鍵詞：疫苗；反向疫苗學(xué)；生物信息學(xué)；免疫學(xué)

疫苗是目前控制動(dòng)物疫病最經(jīng)濟(jì)實(shí)效的方式之一。人們通過(guò)注射含有特異性抗原的疫苗刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)，以產(chǎn)生針對(duì)特定病原體的保護(hù)作用，從而預(yù)防或減輕該病原體引起的相關(guān)疾病。早在1796年，英國(guó)醫(yī)生愛(ài)德華·詹納發(fā)現(xiàn)通過(guò)接種牛痘的方式能夠成功建立對(duì)天花病毒的免疫，這是人類運(yùn)用免疫學(xué)原理成功研制的第一支疫苗。隨后在1885年，法國(guó)病理學(xué)家路易斯·巴斯德針對(duì)牛瘟篩選出可以連續(xù)傳代的弱毒活疫苗，這是獸用疫苗研發(fā)的開端。此后，針對(duì)養(yǎng)殖業(yè)重要畜禽病的研究持續(xù)深入，很多新的疫苗被研發(fā)用于臨床。

經(jīng)過(guò)200多年的發(fā)展，獸用疫苗技術(shù)已經(jīng)在實(shí)驗(yàn)室研究和養(yǎng)殖實(shí)踐中得到了不斷的完善。傳統(tǒng)的疫苗研發(fā)遵循病原體的分離鑒定、純化培養(yǎng)、滅活或改造的思路，這種循序遞進(jìn)的方式盡管解決了很多疫病困擾，但仍存在著研發(fā)周期較長(zhǎng)、病原可能發(fā)生基因組變異或抗原漂移、免疫效果低下、機(jī)體副作用強(qiáng)、免疫方式繁瑣等一系列問(wèn)題[1]。而與傳統(tǒng)的疫苗技術(shù)相比，現(xiàn)代疫苗技術(shù)不僅可以更精確的靶向疫苗的抗原，更快捷地投產(chǎn)，還能夠針對(duì)復(fù)雜的病原提供更多的解決方案。本文以傳統(tǒng)疫苗與新型疫苗的類型為綱，結(jié)合免疫學(xué)、病原學(xué)、生物醫(yī)藥等學(xué)科知識(shí)，淺析新型動(dòng)物疫苗研發(fā)的思路，以期為生產(chǎn)更加安全有效的疫苗提供理論參考。

1 傳統(tǒng)疫苗類型

1.1 滅活疫苗

滅活疫苗是指使用物理或化學(xué)方法致使病原體失去其致病能力而保留其抗原性的一類疫苗，是目前制作方式最簡(jiǎn)便的疫苗。經(jīng)滅活后的病原體保留了一定程度的抗原特性，能夠激發(fā)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，提高免疫應(yīng)答的能力。滅活疫苗因其研發(fā)方法成熟、批量生產(chǎn)簡(jiǎn)便且安全性較高，一直是疫苗開發(fā)的主要方式，目前大多數(shù)動(dòng)物疫病病原都有相應(yīng)的滅活疫苗。但是，由于滅活疫苗病原在機(jī)體內(nèi)不能進(jìn)行自我復(fù)制，因此在大動(dòng)物上使用滅活疫苗通常需要加大免疫劑量、增加注射頻次才能獲得強(qiáng)效持久的免疫保護(hù)。

1.2 弱毒活疫苗

弱毒活疫苗是最早的疫苗類型，牛痘疫苗和牛瘟疫苗都是典型的弱毒活疫苗。傳統(tǒng)的弱毒疫苗主要是通過(guò)化學(xué)方法或突變方法從強(qiáng)毒株中篩選出弱毒株，在保留病原體的抗原及復(fù)制能力的前提下，使其降低或失去致病能力，實(shí)現(xiàn)疫苗的相對(duì)安全和免疫保護(hù)作用。與滅活苗相比，弱毒活疫苗的用量小并且持續(xù)作用效果顯著，但這種機(jī)體內(nèi)的持續(xù)復(fù)制并不可控，有毒力返強(qiáng)的隱患，因此在免疫力低下或處于惡劣環(huán)境的動(dòng)物群體中應(yīng)謹(jǐn)慎使用弱毒活疫苗。

1.3 亞單位疫苗

亞單位疫苗又稱次單位疫苗、組分疫苗，是一種利用分離、純化病原體的抗原表位（如細(xì)菌的外膜蛋白、莢膜多糖等）制成的疫苗。相比于滅活疫苗和弱毒活疫苗，亞單位疫苗只含有病原體中特定的抗原組分，同時(shí)其既不能在體內(nèi)復(fù)制又不包含致病毒力因子，因此誘發(fā)疾病的可能性較小，具有更高的安全性。然而亞單位疫苗的所攜帶的抗原表位較少，與弱毒活疫苗相比，其免疫原性低，需要加強(qiáng)劑量以維持長(zhǎng)期免疫力。

2 基于反向疫苗學(xué)的新型疫苗研究

反向疫苗學(xué)是一種基于基因組測(cè)序和生物信息學(xué)的新型疫苗研發(fā)方法。與傳統(tǒng)的疫苗研發(fā)思路不同，反向疫苗學(xué)更注重病原體抗原的預(yù)測(cè)與篩選，其研發(fā)思路主要是先利用生物信息學(xué)工具分析全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)中可能具有免疫原性的抗原位點(diǎn)，再通過(guò)表達(dá)、純化得到相應(yīng)的候選疫苗進(jìn)行驗(yàn)證開發(fā)[2]。

2.1 重組亞單位疫苗

重組亞單位疫苗又稱基因工程疫苗，其設(shè)計(jì)原理是整合編碼具有抗原性質(zhì)的基因，利用大腸桿菌、酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞等具有表達(dá)外源基因特性的原核或真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)相應(yīng)的蛋白或多肽，經(jīng)分離提純后制得疫苗。高效的異源表達(dá)系統(tǒng)不僅彌補(bǔ)了病原體抗原物質(zhì)量短缺的問(wèn)題，還保證了疫苗的高度特異性。此外，這類疫苗規(guī)避了傳統(tǒng)的亞單位疫苗的病原體培養(yǎng)問(wèn)題，在生產(chǎn)過(guò)程中避免了生物污染，滿足了疫苗研發(fā)過(guò)程中的安全性需求。

2.2 合成多肽疫苗

合成多肽疫苗是將比對(duì)得到的病原體天然抗原決定簇通過(guò)化學(xué)合成的方法合成相應(yīng)的多肽或肽鏈所制成的一類疫苗。這類合成多肽與天然抗原決定簇相似，其能夠在宿主細(xì)胞表面被MHC Ⅰ型和MHC Ⅱ型分子遞呈，進(jìn)而被CD8+ T細(xì)胞或CD4+ T細(xì)胞識(shí)別并殺傷，從而達(dá)到免疫或治療的目的[3]。化學(xué)合成多肽方法成熟、成本低、操作簡(jiǎn)潔，且不會(huì)引入活細(xì)菌、病毒、毒素等生物材料，避免了生物性的感染或中毒，同時(shí)短肽的穩(wěn)定性和可編輯性強(qiáng)，具有良好的激活免疫應(yīng)答的能力。

2.3 重組活載體疫苗

重組活載體疫苗與重組亞單位疫苗類似，均是利用改造的載體進(jìn)行病原體抗原物質(zhì)的異源表達(dá)，但是重組活載體疫苗是將活載體直接注射到機(jī)體中，利用活載體可以自我復(fù)制的特性來(lái)增強(qiáng)免疫原的穩(wěn)定性、延長(zhǎng)儲(chǔ)存期。常見(jiàn)的病毒活載體包括牛痘病毒和腺病毒，細(xì)菌活載體有卡介苗、乳酸桿菌、大腸桿菌等。除了注射方式外，重組活載體疫苗還可以采用口服、滴鼻等多種方式進(jìn)行免疫，免疫形式更加多元，操作也更加簡(jiǎn)便。目前，常見(jiàn)的利用基因敲除方法所構(gòu)建的基因缺失弱毒疫苗本質(zhì)上也屬于重組活載體疫苗的一種，即通過(guò)敲除病原體的毒力基因或抑制其表達(dá)以降低病原體的致病力。但與弱毒苗類似，基因缺失弱毒疫苗也存在毒力返強(qiáng)和病毒抗原漂移、轉(zhuǎn)移的隱患[4-5]。

2.4 重組病毒樣顆粒疫苗

病毒樣顆粒是一種由細(xì)胞分泌并自組裝的結(jié)構(gòu)蛋白所形成的納米級(jí)顆粒。人們通過(guò)對(duì)目標(biāo)病毒進(jìn)行基因測(cè)序獲悉相應(yīng)具備免疫原性的蛋白，并將其克隆、與高效的表達(dá)載體連接隨之轉(zhuǎn)化到表達(dá)體系中，以此獲得結(jié)構(gòu)蛋白。所表達(dá)的結(jié)構(gòu)蛋白經(jīng)表達(dá)體系中各種化學(xué)鍵和非化學(xué)鍵作用，能夠自組裝成球形、錐形等不同形態(tài)的病毒樣顆粒，將這些病毒樣顆粒進(jìn)行病毒純化后即可獲得可用于免疫的病毒樣顆粒。這些病毒樣顆粒具有病毒的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，但不含有活性病毒基因組，這使其在宿主機(jī)體內(nèi)可以被免疫系統(tǒng)識(shí)別但不能進(jìn)行自我復(fù)制，大大提高了疫苗的安全性，是一種理想的疫苗形式。但由于病毒樣顆粒的工業(yè)化生產(chǎn)配套工藝尚未完善，這類疫苗目前僅有部分市售，有待從實(shí)驗(yàn)室大規(guī)模走向市場(chǎng)[6]。

2.5 核酸疫苗

核酸疫苗是指利用含有特定蛋白編碼基因的質(zhì)粒所制備的疫苗，這些質(zhì)粒能夠整合到機(jī)體細(xì)胞中通過(guò)細(xì)胞自身轉(zhuǎn)錄、翻譯等過(guò)程表達(dá)出相應(yīng)的抗原蛋白，從而激活機(jī)體免疫應(yīng)答。作為一種新型疫苗，核酸疫苗在獸用疫苗領(lǐng)域的探索十分深入，取得的一系列成果也令人矚目[7]。與其它基因工程疫苗相比，核酸疫苗的研制周期更短，生物安全系數(shù)更高，但受限于核酸及質(zhì)粒在體內(nèi)的穩(wěn)定性，需要更嚴(yán)苛的保存和制備環(huán)境，同時(shí)外源基因如何更好地與宿主基因組整合依然是需要解決的問(wèn)題[8-9]。

3 新型疫苗設(shè)計(jì)的展望

盡管傳統(tǒng)疫苗技術(shù)存在著安全性不高、免疫程序繁瑣等弊端，但不可否認(rèn)傳統(tǒng)疫苗在疫病防控中確實(shí)起到了積極作用。在新型疫苗設(shè)計(jì)的過(guò)程中，根據(jù)各類疫苗的特性揚(yáng)長(zhǎng)避短，可設(shè)計(jì)出很多實(shí)用性較高的新疫苗。

基于傳統(tǒng)疫苗研發(fā)的正向思維，在已有疫苗的基礎(chǔ)上可以針對(duì)抗原物質(zhì)進(jìn)行優(yōu)化以提高免疫效果。首先是對(duì)已知抗原的優(yōu)化，目前針對(duì)細(xì)菌病原開發(fā)的蛋白多糖復(fù)合物疫苗是一類亞單位疫苗，其將表達(dá)的蛋白與細(xì)菌的多糖抗原結(jié)合，以實(shí)現(xiàn)多糖抗原的延時(shí)增效[6]。此外，注射抗原及其特異性抗體復(fù)合物亦可增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的抗原攝取能力和抗原呈遞細(xì)胞的遞呈能力，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答[10-11]。

除了優(yōu)化抗原外，如何優(yōu)化抗原的遞送系統(tǒng)也是目前研究的一大熱點(diǎn)。近年，人們?cè)诖竽c桿菌中發(fā)現(xiàn)細(xì)菌分泌的外膜囊泡可以作為疫苗遞送的載具。外膜囊泡的直徑僅有20～200 nm，富含外膜蛋白、脂多糖等細(xì)胞膜成分，這些物質(zhì)都是天然的抗原，具有很好的免疫原性[12-13]。在2018年，祝壯[14]利用大腸桿菌外膜囊泡成功構(gòu)建了遞呈胸膜肺炎放線桿菌GalT蛋白的外膜囊泡疫苗，經(jīng)驗(yàn)證該疫苗能達(dá)到87.5%的免疫保護(hù)率，并有效激活了小鼠的細(xì)胞免疫。除外膜囊泡外，納米材料優(yōu)越的遞呈作用也是疫苗佐劑的研發(fā)方向，如納米金可加速抗原向淋巴結(jié)等部位的遷移和富集，促進(jìn)免疫應(yīng)答[15]，樹突狀介孔有機(jī)硅納米粒子包被細(xì)菌外膜囊泡后所誘導(dǎo)的抗體滴度顯著高于單一外膜囊泡免疫等[16]。這些案例提示，將納米材料與含有特定抗原的外膜囊泡相結(jié)合，可能是促進(jìn)疫苗增效的一種方式。

現(xiàn)代疫苗技術(shù)不僅要優(yōu)化已知抗原，開發(fā)免疫增強(qiáng)劑，更是對(duì)未知病原及未知抗原的挖掘與分析。基于反向疫苗學(xué)思路，不僅要在同一階段面對(duì)多重感染威脅時(shí)，根據(jù)各病原的流行特點(diǎn)創(chuàng)制多聯(lián)免疫疫苗，實(shí)現(xiàn)“一針多免”的目標(biāo)，還要針對(duì)同一病原體的不同血清型或基因型研發(fā)能產(chǎn)生交叉免疫的疫苗。因此，基于比較基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)研究等分子生物學(xué)工具進(jìn)行比對(duì)分析，挖掘具有交叉免疫保護(hù)的抗原物質(zhì)或抗原表位是疫苗研發(fā)的基礎(chǔ)。

“反向疫苗學(xué)2.0”的思路是在自然感染和獲得性免疫的模型中篩選出特異性抗體模型，進(jìn)而通過(guò)結(jié)構(gòu)生物學(xué)方法篩選可能的抗原抗體結(jié)合位點(diǎn)，從而設(shè)計(jì)相關(guān)的疫苗，這種思路與結(jié)構(gòu)生物學(xué)的目的不謀而合。近年來(lái)人工智能算法搭配分子對(duì)接技術(shù)、AlphaFold2等蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)演算工具的普及使得疫苗的快速研發(fā)成為可能。利用計(jì)算機(jī)強(qiáng)大的算法預(yù)測(cè)抗原抗體結(jié)合域并反向驗(yàn)證，或利用結(jié)構(gòu)生物學(xué)的相關(guān)工具如X-晶體衍射、冷凍電鏡等對(duì)抗原抗體結(jié)合過(guò)程進(jìn)行直接觀察，可以得到抗原表位設(shè)計(jì)的豐富

信息。

除了對(duì)病原體的直接研究外，病原體與機(jī)體間的相互作用近年來(lái)也備受關(guān)注。人們將高通量測(cè)序與系統(tǒng)生物學(xué)交叉融合，利用高通量測(cè)序的結(jié)果持續(xù)分析機(jī)體免疫系統(tǒng)在免疫前后的差異變化，動(dòng)態(tài)地監(jiān)測(cè)疫苗研發(fā)各個(gè)階段的安全性及有效性，以促進(jìn)疫苗的合理設(shè)計(jì)。此外，分析病原體與宿主在相互作用間的基因組、代謝組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組等組學(xué)數(shù)據(jù)在篩選重要的抗原靶標(biāo)及抗原表位中也具有非常重要的作用，免疫組學(xué)作為新興學(xué)科必將對(duì)新型疫苗的設(shè)計(jì)研發(fā)起到指導(dǎo)作用[2]。

4 結(jié)語(yǔ)

疫苗的發(fā)展史是人類對(duì)微生物認(rèn)知過(guò)程的縮影。從病原微生物的分離鑒定培養(yǎng)到亞單位組分的運(yùn)用，從基因工程技術(shù)到組學(xué)分析技術(shù)，再到蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的精確解析，每一次疫苗技術(shù)的突破都離不開對(duì)病原體和宿主的不懈探索。盡管疫苗技術(shù)日趨成熟，但仍然有很多動(dòng)物疫病和人類傳染病領(lǐng)域尚未被涉及。新冠疫情為世界公共衛(wèi)生敲響了警鐘，人們對(duì)“同一個(gè)健康”的理念愈發(fā)深刻，在疫苗創(chuàng)制上，獸醫(yī)工作者應(yīng)是與人醫(yī)工作者同一個(gè)賽道，通過(guò)各學(xué)科的交叉融合，創(chuàng)新創(chuàng)造新的疫苗。

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