摘要：目的探討芪術(shù)方對(duì)非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）小鼠模型的療效及作用機(jī)制。方法60只雄性C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為正常組，模型組，芪術(shù)方低（4.75 g/kg）、中（9.50 g/kg）、高劑量組（19.00 g/kg），多唏磷脂酰膽堿組（磷脂組）（228 mg/kg），每組10只。高脂高膽固醇飼料和20%果糖水造模16周后，各組給予相應(yīng)藥物干預(yù)，每天給藥1次，連續(xù)8周。檢測(cè)血清ALT、AST、TC、TG、LDL；酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)血清游離脂肪酸（FFA）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）；蘇木素-伊紅（HE）和油紅O染色觀察肝組織病理變化；蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測(cè)微管相關(guān)蛋白輕鏈3B（LC3BⅡ/Ⅰ）、螯合體（p62/SQSTM1）、Beclin-1、動(dòng)力相關(guān)蛋白1（Drp1）表達(dá)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time PCR）檢測(cè)Drp1、Beclin-1、p62/SQSTM1 mRNA表達(dá)水平。計(jì)量資料多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。結(jié)果與正常組比較，模型組血清TG、TC、ALT、AST、LDL、FFA、TNF-α、IL-1β、MDA水平均升高，SOD水平降低（P值均lt;0.05）。HE染色結(jié)果顯示，模型組小鼠肝組織可見肝細(xì)胞脂肪變及大量脂肪空泡；油紅O染色結(jié)果顯示，模型組小鼠肝細(xì)胞內(nèi)有大量大小不一紅色脂滴沉積，油紅O染色面積百分比較正常組升高（Plt;0.05）。Real-time PCR結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組肝組織中Drp1、Beclin-1 mRNA升高，p62/SQSTM1 mRNA降低（P值均lt;0.05）。Western Blot結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組肝組織中Drp1、Beclin-1、LC3BⅡ/Ⅰ蛋白表達(dá)水平升高，p62/SQSTM1蛋白表達(dá)水平降低（P值均lt;0.05）。與模型組比較，部分劑量芪術(shù)方組和磷脂組血清TG、TC、ALT、AST、LDL、FFA、TNF-α、IL-1β、MDA水平均降低，SOD水平升高（P值均lt;0.05）。與模型組比較，各用藥組肝組織脂肪變改善明顯，且油紅O染色面積百分比降低（P值均lt;0.05）；Drp1、Beclin-1 mRNA降低，p62/SQSTM1 mRNA升高（P值均lt;0.05）；Drp1、Beclin-1、LC3BⅡ/Ⅰ蛋白表達(dá)水平降低，部分用藥組p62/SQSTM1蛋白表達(dá)水平升高（P值均lt;0.05），且芪術(shù)方中、高劑量效果更明顯（P值均lt;0.01）。結(jié)論芪術(shù)方改善NAFLD小鼠肝脂質(zhì)代謝及炎癥水平可能與調(diào)控肝細(xì)胞線粒體自噬有關(guān)。

關(guān)鍵詞：非酒精性脂肪性肝病；芪術(shù)方；線粒體自噬；脂質(zhì)代謝；炎癥

基金項(xiàng)目：上海市2021年度“科技創(chuàng)新行動(dòng)計(jì)劃”生物醫(yī)藥科技支撐專項(xiàng)（21S1900400）；安徽省自然科學(xué)基金（2308085MH293）；安徽省高校科學(xué)研究重大項(xiàng)目（2023AH040098）；安徽省衛(wèi)生健康科研重點(diǎn)項(xiàng)目（AHWJ2023A10035）；國(guó)家中醫(yī)藥管理局高水平中醫(yī)藥重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目（中醫(yī)肝膽病學(xué)）（zyyzdxk-2023060）

Effect of Qizhu prescription on a mouse model of non-alcoholic fatty liver disease incluced by high-fat，high-fructose，and high-cholesterol diet and its mechanism

CHEN Jiahao1a，ZHOU Zhenhua1b，2.（1.a.Cellular Immunity Laboratory，b.Department of Hepatology，Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 201203，China；2.Department of Hepatology，Anhui Hospital，Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Hefei 230011，China）

Corresponding author：ZHOU Zhenhua，jinghua1220@163.com（ORCID：0000-0002-5639-3857）

Abstract：Objective To investigate the therapeutic effect and mechanism of action of Qizhu prescription in mice withnon-alcoholic fatty liver disease（NAFLD）.Methods A total of 60 male C57BL/6J mice were randomly divided into normal group，model group，low-dose Qizhu prescription group（4.75 g/kg），middle-dose Qizhu prescription group（9.50 g/kg），high-dose Qizhu prescription group（19.00 g/kg），Yishanfu group（228 mg/kg），with 10 mice in each group.After 16 weeks of modeling with a high-fat high-cholesterol diet and 20%fructose water，each group was given the corresponding drug once a day for 8 weeks.The serum levels of alanine aminotransferase（ALT），aspartate aminotransferase（AST），total cholesterol（TC），triglyceride（TG），and low-density lipoprotein（LDL）were measured；ELISA was used to measure the serum levels of free fatty acid（FFA），tumor necrosis factor-α（TNF-α），interleukin-1β（IL-1β），superoxide dismutase（SOD），and malondialdehyde（MDA）；HE staining and oil red O staining were used to the pathological changes of liver tissue；Western blot was used to measure the protein expression levels of LC3BⅡ/Ⅰ，p62/SQSTM1，Beclin-1，and Drp1，and real-time PCR was used to measure the mRNA expression levels of Drp1，Beclin-1，and p62/SQSTM1.A one-way analysis of variance was used for comparison of continuous data between multiple groups，and the least significant difference t-test was used for further comparison between two groups.Results Compared with the normal group，the model groups had significant increases in the serum levels of TG，TC，ALT，AST，LDL，F(xiàn)FA，TNF-α，IL-1β，and MDA and a significant reduction in the serum level of SOD（Plt;0.05）.HE staining showed that the mice in the model group had hepatocyte steatosis and a large number of fat vacuoles in liver tissue，and oil red O staining showed that the mice in the model group had a large number of red lipid droplets of varying sizes in hepatocytes，with a significant increase in the percentage of oil red O staining area compared with the normal group（Plt;0.05）.Real-time PCR showed that compared with the normal group，the model group had significant increases in the mRNA expression levels of Drp1 and Beclin-1 and a significant reduction in the mRNA expression level of p62/SQSTM1 in liver tissue（all Plt;0.05），and Western blot showed that compared with the normal group，the model group had significant increases in the protein expression levels of Drp1，Beclin-1，and LC3BⅡ/Ⅰand a significant reduction in the protein expression level of p62/SQSTM1 in liver tissue（all Plt;0.05）.Compared with the model group，some Qizhu prescription groups and the Yishanfu group had significant reductions in the serum levels of TG，TC，ALT，AST，LDL，F(xiàn)FA，TNF-α，IL-1β，and MDA and a significant increase in the serum level of SOD（all Plt;0.05）.Compared with the model group，each administration group had a significant improvement in steatosis of liver tissue，a significant reduction in the percentage of oil red O staining area，significant reductions in the mRNA expression levels of Drp1 and Beclin-1，and a significant increase in the mRNA expression level of p62/SQSTM1（all Plt;0.05）；there were significant reductions in the protein expression levels of Drp1，Beclin-1，and LC3BⅡ/Ⅰ，while some administration groups had a significant increase in the protein expression level of p62/SQSTM1（all Plt;0.05），with a significantly better effect in the middle-and high-dose Qizhu prescription groups（all Plt;0.01）.Conclusion Qizhu prescription improves lipid metabolism and inflammation in mice with NAFLD possibly by regulating hepatocyte mitophagy.

Key words：Non-alcoholic Fatty Liver Disease；Qi Zhu Formula；Mitophagy；Lipid Metabolism；Inflammation

Research funding：Shanghai 2021“Science and Technology Innovation Action Plan”Biomedical Science and Technology Support Special Project（21S1900400）；Natural Science Foundation of Anhui Province（2308085MH293）；Key Scientific Research Project of Anhui Province（2023AH040098）；Health as a key project of scientific research in anhui province（AHWJ2023A10035）；The state administration of traditional Chinese medicine high level key discipline construction project of traditional Chinese medicine（TCM liver epidemiology）（zyyzdxk-2023060）

非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）是世界范圍內(nèi)最常見的慢性肝病，在全球普通人群中的患病率高達(dá)38%［1-2］。因此，早期預(yù)防和阻斷NAFLD意義重大。

脂肪在肝臟中不斷沉積導(dǎo)致脂質(zhì)代謝紊亂與脂肪酸氧化應(yīng)激產(chǎn)生的炎癥因子共同構(gòu)成NAFLD肝細(xì)胞損傷的主要病理環(huán)節(jié)［3］。肝脂質(zhì)代謝紊亂可導(dǎo)致線粒體功能障礙，進(jìn)而引起肝損傷。肝臟線粒體自噬在清除肝細(xì)胞受損線粒體，肝臟保護(hù)方面起著重要作用［4］。隨著中醫(yī)藥研究的不斷深入，中藥復(fù)方在減輕肝炎癥狀、改善肝功能、肝脂肪變性以及延緩肝纖維化等方面療效顯著［5］。已成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)。本課題組前期研究［6］表明，芪術(shù)方可減輕高脂高膽固醇飲食誘導(dǎo)的NASH小鼠肝損傷。為進(jìn)一步探索其作用機(jī)制，本研究通過建立高脂高膽固醇高果糖飲食NAFLD小鼠模型，為芪術(shù)方的臨床運(yùn)用提供更多實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與飼料60只SPF級(jí)雄性C57BL/6J小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量20～25 g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號(hào)：SCXK（滬）2022-0004。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證編號(hào)：SCXK（滬）2020-0009。小鼠飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。溫度20～24℃、濕度45%～55%、12 h光暗周期。高脂高膽固醇飼料由江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司提供，許可證號(hào)：蘇飼證（2019）01008。果糖由南通特洛菲飼料科技有限公司提供。

1.2藥物組成與制備芪術(shù)方：生黃芪15 g（上海虹橋中藥飲片有限公司，220919）、虎杖9 g（上?？禈蛑兴庯嬈邢薰?，221105）、杠板歸9 g、澤蘭9 g、蒼術(shù)9 g（上海萬仕誠(chéng)藥業(yè)有限公司，20221006-1、20220923-1、20220821-1）、廣陳皮6 g（上海養(yǎng)和堂中藥飲片有限公司，2022092407）。

提取工藝：將所有飲片加入藥品體積12倍純水中浸泡1 h，煮沸后提取濾液，共提取3次，加熱濃縮至含生藥0.475、0.95、1.90 g/mL的濃縮液。將多唏磷脂酰膽堿（北京賽諾菲制藥有限公司，H20059010，CBJD471）溶于純水中，質(zhì)量濃度為22.8 g/L，藥液于4℃冰箱存放備用。多唏磷脂酰膽堿及中藥飲片均購(gòu)自上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，由王衛(wèi)東主管藥師鑒定，符合2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)。

1.3試劑ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix、Freezol Reagent RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、提取試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司，Q711-03、R223-01、R711-02）；PCR引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成；TNF-α、IL-1β、游離脂肪酸（FFA）（上海圓創(chuàng)生物科技有限公司，202308-M028、202308-M009、YCM4328）；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）（ELISA）試劑盒（上海威奧生物科技有限公司，ET0012M、ET0001M）；山羊抗兔免疫球蛋白（Ig）G（H+L）抗體、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、組織線粒體分離試劑盒、PMSF（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，A0208、P0009-1、C3606、ST506）；LC3B抗體、p62/SQSTM1抗體、Beclin-1抗體（杭州華安生物技術(shù)有限公司，ET1701-65、HA721171、HA721216）、動(dòng)力相關(guān)蛋白1（Drp1）、GAPDH、β-actin（武漢三鷹技術(shù)有限公司，12957-1-AP、60004-1-Ig、23660-1-AP）

1.4儀器QuantStudio 6 Pro型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增儀、TSX600型?80℃超低溫冰箱（美國(guó)Thermo Scientific公司）；AMG-2201-023型全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek公司）；1658034型電泳轉(zhuǎn)膜儀ChemiDocMP型凝膠成像儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；Centrifuge 5430R型臺(tái)式高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）。

1.5方法

1.5.1造模、分組及給藥60只C57BL/6J雄性小鼠于動(dòng)物房適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常組（n=10）、模型組（n=10）和給藥組（n=40）。正常組小鼠予正常飼料和飲水，模型組和給藥組給予高脂高膽固醇飼料和20%果糖水［6-7］。造模16周后開始給藥，給藥組分為芪術(shù)方低、中、高劑量組、多唏磷脂酰膽堿組（磷脂組）。根據(jù)《中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》中人與小鼠藥物換算方式和本課題組前期研究［6］，得出芪術(shù)方低、中、高劑量組給藥劑量為4.75、9.50、19.00 g/kg，成人體質(zhì)量（按60 kg計(jì)算）日服劑量的5、10、20倍，磷脂組給藥劑量為228 mg/kg（成人日服劑量的10倍）。第17周起，正常組和模型組每日給予純水灌胃，其余各組給予對(duì)應(yīng)藥物灌胃，每日1次，持續(xù)8周。末次給藥后，腹腔注射1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉小鼠，眼眶后靜脈叢取血收集血清和肝組織樣本。

1.5.2肝組織線粒體提取稱取新鮮肝臟100 mg，按說明書加入試劑勻漿。3 000 r/min，4℃，10 min離心后，將上清轉(zhuǎn)移至另一離心管中。12 000 r/min，4℃，10 min，沉淀即為線粒體。存放于?80℃冰箱備用。

1.5.3生化指標(biāo)檢測(cè)血清委托上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院檢驗(yàn)科檢測(cè)肝功能及血脂。

1.5.4 HE染色固定好的肝組織石蠟包埋，切片，放入二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水；蘇木素、伊紅染色5 min，沖水后無水乙醇浸泡脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡下觀察各組小鼠肝組織。

1.5.5油紅O染色冰凍切片復(fù)溫干燥后固定液浸泡15 min，純水洗后晾干；油紅染液浸染10 min后60%異丙醇分化，自來水沖洗；蘇木素染色，純水浸洗，甘油明膠封片劑封片；鏡下觀察各組小鼠肝脂質(zhì)沉積。

1.5.6透射電鏡觀察肝組織超微結(jié)構(gòu)將新鮮肝組織切至1 mm3，放入2.5%戊二醛中固定2 h，清洗3次后放入1%餓酸中固定，清洗3次后，梯度乙醇脫水，丙酮浸透后包埋，半薄定位切片后采用醋酸雙氧鈾-檸檬酸鉛雙染法染色，鏡下觀察肝組織超微結(jié)構(gòu)。

1.5.7 ELISA法檢測(cè)炎癥因子、脂質(zhì)代謝、氧化應(yīng)激相關(guān)分子水平將存放于?80℃冰箱的血清取出，依據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行操作，檢測(cè)小鼠血清中TNF-α、IL-1β、FFA、MDA含量和SOD酶活力。

1.5.8實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time PCR）檢測(cè)Drp1、p62/SQSTM1、Beclin-1 mRNA表達(dá)按照RNA提取試劑盒說明書提取肝組織RNA，用HiScriptⅡQ RT SuperMix for qPCR試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。將cDNA與ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix混合后進(jìn)行Real-time PCR擴(kuò)增（反應(yīng)條件參考說明書），以GAPDH為內(nèi)參，采用相對(duì)定量2?ΔΔCt法進(jìn)行分析。PCR引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計(jì)提供。序列見表1。

1.5.9 Western Blot檢測(cè)肝組織線粒體p62/SQSTM1、Drp1、Beclin-1、LC3BⅡ/Ⅰ蛋白表達(dá)使用BCA法檢測(cè)線粒體蛋白濃度，配置蛋白樣品。上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉。分別加入一抗p62/SQSTM1、Drp1、Beclin-1、LC3B（1∶1 000），4℃孵育過夜后TBST洗膜3次分別加入二抗GAPDH、β-actin（1∶5 000），室溫孵育1 h，TBST洗膜3次后ECL法顯影，凝膠成像系統(tǒng)拍攝。以β-Actin和GAPDH為內(nèi)參，采用Image J進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)定量。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1芪術(shù)方對(duì)各組小鼠肝功能、血脂的影響與正常組相比，模型組小鼠AST、ALT、TC、TG、LDL水平均升高（P值均lt;0.05）。與模型組相比，各給藥組小鼠ALT、AST、TC、TG、LDL水平均降低（P值均lt;0.05）（表2）。

2.2芪術(shù)方對(duì)各組小鼠肝組織學(xué)變化的影響HE染色結(jié)果顯示：正常組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞邊界清晰，無脂肪空泡；模型組小鼠充斥大量脂肪變，伴炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肝細(xì)胞氣球樣變；與模型組比較，各用藥組均有不同程度改善，其中芪術(shù)方中、高劑量組脂肪變顯著減輕（圖1）。油紅O染色結(jié)果顯示：正常組小鼠肝細(xì)胞無紅色脂滴；模型組小鼠干細(xì)胞內(nèi)充斥大量形狀不規(guī)則紅色脂滴緊密排列，陽(yáng)性面積較正常組明顯增加（Plt;0.05）；芪術(shù)方各劑量組干預(yù)后，較模型組顯著改善，其中芪術(shù)方中、高劑量組效果顯著（P值均lt;0.01）（圖2，表3）。

2.3芪術(shù)方對(duì)各組小鼠肝臟超微結(jié)構(gòu)的影響正常組小鼠肝細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞內(nèi)可見大量線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和少量微小脂滴。模型組可見受損肝細(xì)胞，大量脂滴，腫脹線粒體及自噬溶酶體。芪術(shù)方中、高劑量組與磷脂組細(xì)胞胞漿中脂質(zhì)空泡減少，其中芪術(shù)方中、高劑量組中可見自噬小體（圖3）。

2.4芪術(shù)方對(duì)各組小鼠肝臟TNF-α、IL-1β、FFA、MDA及SOD的影響ELISA結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組小鼠血清中TNF-α、IL-1β、FFA、MDA表達(dá)水平提高，SOD表達(dá)水平降低（P值均lt;0.05）；用藥組小鼠血清中TNF-α、IL-1β、MDA均有不同程度改善（P值均lt;0.05），IL-1β、FFA、MDA在芪術(shù)方中、高劑量組改善作用更為明顯（P值均lt;0.05），芪術(shù)方低、中、高劑量組的SOD酶活性較模型組顯著提高（P值均lt;0.05）（表4）。

2.5芪術(shù)方對(duì)各組小鼠肝組織Drp1、Beclin-1、p62/SQSTM1 mRNA的影響與正常組相較，模型組小鼠肝組織Drp1、Beclin-1 mRNA表達(dá)水平增加，p62/SQSTM1 mRNA表達(dá)水平降低（P值均lt;0.05）；與模型組相比，各用藥組Drp1、Beclin-1 mRNA表達(dá)水平減少，芪術(shù)方中、高劑量組p62/SQSTM1 mRNA表達(dá)水平增加（P值均lt;0.05）（表5）。

2.6芪術(shù)方對(duì)各組小鼠肝組織線粒體Drp1、Beclin-1、p62/SQSTM1、LC3B蛋白表達(dá)影響與正常組相比，模型組小鼠肝組織線粒體LC3BⅡ/Ⅰ比值、Drp1、Beclin-1蛋白表達(dá)水平明顯增加，p62/SQSTM1蛋白表達(dá)水平減少（P值均lt;0.05）；與模型組相比，各用藥組LC3BⅡ/Ⅰ比值、Drp1、Beclin-1蛋白表達(dá)水平降低，部分用藥組p62/SQSTM1蛋白表達(dá)水平上升（P值均lt;0.05），其中芪術(shù)方中、高劑量組作用更明顯（P值均lt;0.01）（圖4，表6）。

3討論

NAFLD患病率逐年上升，中醫(yī)藥治療NAFLD具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，芪術(shù)方是由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院肝病科研發(fā)治療NAFLD的有效驗(yàn)方，臨床療效好，為進(jìn)一步探索其作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)通過建立高脂高膽固醇高果糖NAFLD小鼠模型，采用不同劑量芪術(shù)方干預(yù)8周，結(jié)果表明，芪術(shù)方可顯著降低NAFLD小鼠血脂、血清FFA，改善肝功能，減輕肝臟病理?yè)p傷及炎癥反應(yīng)。

NAFLD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前尚未完全闡明。隨著研究的深入，多重打擊學(xué)說被廣泛認(rèn)可，其中炎癥、肝脂肪變性、線粒體功能障礙和脂質(zhì)過氧化誘發(fā)氧化應(yīng)激在NAFLD發(fā)病中起重要作用［8］。炎癥作為NAFLD的關(guān)鍵加速因子，能促進(jìn)肝脂肪變性向肝纖維化進(jìn)展［9］。本研究結(jié)果顯示，芪術(shù)方能減少NAFLD小鼠血清TNF-α、IL-1β、MDA，促進(jìn)SOD表達(dá)，表明芪術(shù)方能減輕NAFLD肝臟炎癥。芪術(shù)方由生黃芪、虎杖、杠板歸、澤蘭、蒼術(shù)、廣陳皮組成。黃芪中主要活性成分黃芪甲苷對(duì)自噬可表現(xiàn)出不同的調(diào)控作用。在大鼠心肌再灌注損傷模型中，黃芪甲苷通過降低PINK1/Parkin信號(hào)通路表達(dá)，抑制線粒體自噬水平，發(fā)揮心肌細(xì)胞保護(hù)作用［10］。Su等［11］研究發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷上調(diào)PINK1線粒體自噬水平，改善糖尿病大鼠線粒體功能障礙?；⒄戎械幕钚猿煞帜軌蚋纳埔葝u素抵抗、抗氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、減輕炎癥浸潤(rùn)緩解NAFLD［12］?；⒄溶湛上抡{(diào)ATF6表達(dá)抑制自噬改善NAFLD［13］。蒼術(shù)苷可促進(jìn)AMPK活化，降低mTOR活性，誘導(dǎo)自噬體形成，從而加速肝臟中脂質(zhì)降解［14］。陳皮中的主要成分川陳皮素除了具有抑制炎癥反應(yīng)、抗腫瘤、改善代謝紊亂等藥理作用，也能促進(jìn)自噬。線粒體自噬是一種發(fā)生在線粒體中的高度保守的自我消化過程［15］，介導(dǎo)受損線粒體的清除，是維持線粒體穩(wěn)態(tài)的重要環(huán)節(jié)。線粒體自噬功能失調(diào)與多種肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［16］，是細(xì)胞為應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激、營(yíng)養(yǎng)缺乏、衰老等外界刺激的重要防御機(jī)制［17］。Drp1作為線粒體分裂的關(guān)鍵調(diào)控因子，能夠激活線粒體自噬。Li等［18］研究表明，柴胡疏肝散可抑制Drp1介導(dǎo)的線粒體過度自噬增強(qiáng)消化不良大鼠胃動(dòng)力。Drp1與LC3相互作用促進(jìn)線粒體自噬。LC3作為線粒體自噬標(biāo)志物，在線粒體自噬過程中發(fā)生泛素化，與自噬體的磷脂乙醇胺結(jié)合，在自噬體膜上形成LC3Ⅱ。LC3Ⅱ和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平在一定程度上反映了線粒體自噬水平［19］。p62/SQSTM1是一種特異性的線粒體吞噬底物，是參與選擇性自噬重要的接頭蛋白，對(duì)于泛素化聚集體的形成及運(yùn)輸至關(guān)重要，能夠與LC3結(jié)合通過自噬選擇性降解，調(diào)節(jié)線粒體自噬活性，從而維持線粒體自噬穩(wěn)態(tài)［20-21］。本研究發(fā)現(xiàn)NAFLD小鼠肝組織線粒體中Drp1表達(dá)增加，芪術(shù)方可抑制Drp1在肝組織線粒體中表達(dá)，調(diào)節(jié)自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、p62/SQSTM1、LC3，電鏡中也觀察到模型組中線粒體數(shù)量減少，線粒體損傷明顯，可見自噬溶酶體；芪術(shù)方中、高劑量組可見自噬小體，線粒體嵴較為明顯，線粒體損傷緩解。因此，芪術(shù)方治療NAFLD的作用機(jī)制可能與調(diào)控Drp1介導(dǎo)的肝臟線粒體自噬相關(guān)。

綜上所述，芪術(shù)方能夠減輕NAFLD小鼠肝損傷，其機(jī)制與調(diào)控Drp1介導(dǎo)的肝臟線粒體自噬及減輕肝臟炎癥有關(guān)。然而，NAFLD引發(fā)肝臟線粒體自噬，以及進(jìn)一步導(dǎo)致肝損傷的機(jī)制尚未完全了解，還有待進(jìn)一步闡述。

倫理學(xué)聲明：本研究方案于2023年3月29日經(jīng)由上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批，批號(hào)：PZSHUTCM2304110001，符合實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物管理與使用準(zhǔn)則。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：陳佳豪負(fù)責(zé)動(dòng)物相關(guān)實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及文章初稿；周振華負(fù)責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。

參考文獻(xiàn)：

[1]QUEK J，CHAN KE，WONG ZY，et al.Global prevalence of non-alcoholic fatty liver disease and non-alcoholic steatohepatitis in the overweight and obese population：A systematic review and meta-analysis[J].Lancet Gastroenterol Hepatol，2023，8（1）：20-30.DOI：10.1016/S2468-1253（22）00317-X.

[2]WONG VWS，EKSTEDT M，WONG GLH，et al.Changing epidemiol?ogy，global trends and implications for outcomes of NAFLD[J].J Hepatol，2023，79（3）：842-852.DOI：10.1016/j.jhep.2023.04.036.

[3]CHEN JH，ZHOU ZH.Research progress of abnormal lipid metabo?lism and mitochondrial dysfunction in the pathogenesis and disease process of NAFLD[J].Chin Hepatol，2023，28（11）：1372-1375.DOI：10.3969/j.issn.1008-1704.2023.11.027.

陳佳豪，周振華.肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝異常與線粒體功能障礙在NAFLD發(fā)病和疾病進(jìn)程中的研究進(jìn)展[J].肝臟，2023，28（11）：1372-1375.DOI：10.3969/j.issn.1008-1704.2023.11.027.

[4]REN QN，SUN QM，F(xiàn)U JF.Dysfunction of autophagy in high-fat diet-induced non-alcoholic fatty liver disease[J].Autophagy，2024，20（2）：221-241.DOI：10.1080/15548627.2023.2254191.

[5]XIN YJ，CHEN YY，YANG HL，et al.Effect of Xuanfuhua Decoction on a mouse model of nonalcoholic steatohepatitis induced by high-fat，high-fructose，and high-cholesterol diet[J].J Clin Hepatol，2023，39（6）：1340-1350.DOI：10.3969/j.issn.1001-5256.2023.06.014.

辛一敬，陳逸云，楊海琳，等.旋覆花湯對(duì)高脂高果糖高膽固醇飲食誘導(dǎo)非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型的影響[J].臨床肝膽病雜志，2023，39（6）：1340-1350.DOI：10.3969/j.issn.1001-5256.2023.06.014.

[6]ZHANG QY，ZHOU ZH.Mechanism of non-alcoholic steatohepatitis improved by Qizhu prescription based on AMPK signaling pathway[J].Chin J Exp Tradit Med Formulae，2024，30（8）：49-56.DOI：10.13422/j.cnki.syfjx.20232237.

張秋怡，周振華.基于AMPK信號(hào)通路探討芪術(shù)方改善非酒精性脂肪性肝炎的機(jī)制[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2024，30（8）：49-56.DOI：10.13422/j.cnki.syfjx.20232237.

[7]FAKHOURY-SAYEGH N，TRAK-SMAYRA V，SAYEGH R，et al.Fruc?tose threshold for inducing organ damage in a rat model of nonalco?holic fatty liver disease[J].Nutr Res，2019，62：101-112.DOI：10.1016/j.nutres.2018.11.003.

[8]CHEN Z，TIAN RF，SHE ZG，et al.Role of oxidative stress in the pathogenesis of nonalcoholic fatty liver disease[J].Free Radic Biol Med，2020，152：116-141.DOI：10.1016/j.freeradbiomed.2020.02.025.

[9]SCHUSTER S，CABRERA D，ARRESE M，et al.Triggering and reso?lution of inflammation in NASH[J].Nat Rev Gastroenterol Hepatol，2018，15（6）：349-364.DOI：10.1038/s41575-018-0009-6.

[10]ZHANG DW，ZHAO HY，LI QS，et al.Effect of AstragalosideIV and ginsenoside Rg1 on autophagy of myocardial tissue injury induced by ischemia-reperfusion injury in hyperlipidemic mice[J].Chin Arch Tradit Chin Med，2020，38（3）：60-64.DOI：10.13193/j.issn.1673-7717.2020.03.016.

張東偉，趙宏月，李全生，等.黃芪甲苷及人參皂苷Rg1對(duì)高脂大鼠心肌缺血再灌注損傷后心肌線粒體自噬的影響[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2020，38（3）：60-64.DOI：10.13193/j.issn.1673-7717.2020.03.016.

[11]SU J，GAO CT，XIE L，et al.Astragaloside II ameliorated podocyte in?jury and mitochondrial dysfunction in streptozotocin-induced diabeticrats[J].Front Pharmacol，2021，12：638422.DOI：10.3389/fphar.2021.638422.

[12]LI SD，CHEN XJ，LIU JK，et al.Signaling pathways involved in the active components of Polygonum cuspidatum in treatment of nonal?coholic fatty liver disease and their interaction[J].J Clin Hepatol，2022，38（4）：902-907.DOI：10.3969/j.issn.1001-5256.2022.04.033.

李淑娣，陳欣菊，劉江凱，等.虎杖活性成分治療非酒精性脂肪性肝病的相關(guān)信號(hào)通路及相互作用[J].臨床肝膽病雜志，2022，38（4）：902-907.DOI：10.3969/j.issn.1001-5256.2022.04.033.

[13]WANG Y，YANG ZY，LI SQ，et al.Regulatory mechanism of Polygoni?dine on endoplasmic reticulum stress in non?alcoholic fatty hepato?cytes[J].Anatomy Research，2023，45（1）：57-62.DOI：10.20021/j.cnki.1671-0770.2023.01.10.

王懿，楊志勇，李書芹，等.虎杖苷對(duì)非酒精性脂肪性肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的調(diào)控機(jī)制[J].解剖學(xué)研究，2023，45（1）：57-62.DOI：10.20021/j.cnki.1671-0770.2023.01.10.

[14]ZHANG PF，CHENG XY，SUN HM，et al.Atractyloside protect mice against liver steatosis by activation of autophagy via ANT-AMPK-mTORC1 signaling pathway[J].Front Pharmacol，2021，12：736655.DOI：10.3389/fphar.2021.736655.

[15]UENO T，KOMATSU M.Autophagy in the liver：Functions in health and disease[J].Nat Rev Gastroenterol Hepatol，2017，14（3）：170-184.DOI：10.1038/nrgastro.2016.185.

[16]MA XW，MCKEEN T，ZHANG JH，et al.Role and mechanisms of mi?tophagy in liver diseases[J].Cells，2020，9（4）：837.DOI：10.3390/cells9040837.

[17]LU YY，LI ZJ，ZHANG SQ，et al.Cellular mitophagy：Mechanism，roles in diseases and small molecule pharmacological regulation[J].Theranostics，2023，13（2）：736-766.DOI：10.7150/thno.79876.

[18]LI L，JIA QL，WANG XX，et al.Chaihu Shugan San promotes gastric motility in rats with functional dyspepsia by regulating Drp-1-medi?ated ICC mitophagy[J].Pharm Biol，2023，61（1）：249-258.DOI：10.1080/13880209.2023.2166966.

[19]LIU T，YU JN，LIU Y，et al.Effects of serum-free starvation on prolifera?tive capacity of muscle satellite cells and expression of autophagy-re?lated proteins LC3 and Beclin1[J].Chin J Tissue Eng Res，2019，23（11）：1657-1661.DOI：10.3969/j.issn.2095-4344.1062.

劉通，于佳妮，劉悅，等.去血清饑餓條件下肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖及自噬蛋白LC3、Beclin1的表達(dá)[J].中國(guó)組織工程研究，2019，23（11）：1657-1661.DOI：10.3969/j.issn.2095-4344.1062.

[20]SUI XY，XU P，DUAN CZ，et al.Advances in molecular function of p62 protein and its role in diseases[J].Chin J Biotechnol，2023，39（4）：1374-1389.DOI：10.13345/j.cjb.220681.

隋馨瑩，徐平，段昌柱，等.p62蛋白的分子功能及其在疾病中的研究進(jìn)展[J].生物工程學(xué)報(bào)，2023，39（4）：1374-1389.DOI：10.13345/j.cjb.220681.

[21]YAO RQ，REN C，XIA ZF，et al.Organelle-specific autophagy in in?flammatory diseases：A potential therapeutic target underlying the quality control of multiple organelles[J].Autophagy，2021，17（2）：385-401.DOI：10.1080/15548627.2020.1725377.

收稿日期：2024-05-23；錄用日期：2024-07-11

本文編輯：王瑩

引證本文：CHEN JH， ZHOU ZH. Effect of Qizhu prescription on a mouse model of non-alcoholic fatty liver disease incluced by high-fat， high-fructose， and high-cholesterol diet and its mechanism[J]. J Clin Hepatol， 2024， 40（11）： 2205- 2212.

陳佳豪， 周振華 . 芪術(shù)方對(duì)高脂高果糖高膽固醇誘導(dǎo)的非酒精性 脂肪性肝病小鼠模型的影響及其機(jī)制[J]. 臨床肝膽病雜志， 2024， 40（11）： 2205-2212.