水楊酰腙型高選擇性鋁離子熒光探針的合成及其應(yīng)用研究

摘要 本研究以香草醛衍生物為原料合成了4 種水楊酰腙型化合物（L1～L4），采用核磁共振（NMR）和高分辨質(zhì)譜（HRMS）對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。光學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，探針L1 和L3 可作為鋁離子（Al3+）熒光探針，加入Al3+后，探針L1 溶液的熒光顏色由無色變?yōu)樗{(lán)色，檢出限為25.1 nmol/L。與探針L1 相比，探針L3 與Al3+絡(luò)合后溶液熒光顏色由無色變色綠色，檢出限為17.3 nmol/L。探針L1 和L3 在Al3+檢測(cè)方面具有響應(yīng)時(shí)間短、選擇性好和抗干擾能力強(qiáng)等特點(diǎn)。通過HRMS 和1H NMR 證明了探針L1 和L3 對(duì)Al3+的識(shí)別機(jī)理。細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，探針L1 和L3 的細(xì)胞毒性低，在檢測(cè)生物體內(nèi)Al3+方面具有較大的應(yīng)用潛力。

關(guān)鍵詞 熒光探針；水楊酰腙型化合物；鋁離子；識(shí)別；細(xì)胞成像

作為地殼中含量最豐富的金屬元素，鋁元素被廣泛應(yīng)用于食品添加劑、水凈化處理和藥物合成等多個(gè)領(lǐng)域[1-5]。然而，鋁元素的不合理使用導(dǎo)致環(huán)境中游離的Al3+過量積累，對(duì)生態(tài)系統(tǒng)以及人體健康造成嚴(yán)重影響。人體內(nèi)Al3+的過量積累對(duì)鈣的吸收有嚴(yán)重干擾，并對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)以及其他器官造成嚴(yán)重?fù)p害，進(jìn)而引起多種疾病，如骨質(zhì)疏松癥、帕金森癥和阿爾茲海默病等[6-9]。此外，環(huán)境中過量積累的Al3+會(huì)對(duì)植物以及海洋生物產(chǎn)生致命影響[10-11]。世界衛(wèi)生組織（WHO）規(guī)定飲用水中Al3+濃度的最高限量值為7.41 μmol/L[12-14]。因此，對(duì)環(huán)境及生物體中Al3+的含量進(jìn)行分析，建立一種高靈敏度、高選擇性的Al3+快速檢測(cè)方法具有重要意義。

目前， Al3+檢測(cè)方法包括高效液相色譜法（HPLC）、原子吸收光譜法（AAS）、電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS）和原子發(fā)射光譜法（AES）[15-18]等。與這些傳統(tǒng)的檢測(cè)方法相比，熒光探針法具有操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、選擇性好、響應(yīng)快速、可實(shí)現(xiàn)無創(chuàng)和實(shí)時(shí)檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，在監(jiān)測(cè)活細(xì)胞及生物組織內(nèi)分析物含量方面發(fā)揮了重要作用[19-21]。近年來，研究者開發(fā)了一系列用于Al3+檢測(cè)的高選擇性、高靈敏度熒光探針，初步實(shí)現(xiàn)了生物組織內(nèi)Al3+的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)[22-24]。但是，目前的Al3+熒光探針依然存在細(xì)胞毒性高、合成過程復(fù)雜等問題。設(shè)計(jì)開發(fā)合成簡(jiǎn)單、光學(xué)性質(zhì)優(yōu)異的新型Al3+熒光探針是該領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。

席夫堿類熒光探針因其成本低、絡(luò)合能力強(qiáng)、合成簡(jiǎn)單、響應(yīng)時(shí)間短和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)而備受關(guān)注；同時(shí)，較低的細(xì)胞毒性、良好的光穩(wěn)定性以及較強(qiáng)的細(xì)胞穿透力使其被廣泛應(yīng)用于生物體內(nèi)多種分析物的檢測(cè)。席夫堿類化合物結(jié)構(gòu)中C=N 與苯環(huán)形成的共軛結(jié)構(gòu)使得探針呈弱熒光發(fā)射，而結(jié)構(gòu)中的亞胺或甲亞胺基團(tuán)（–RC=N–）為金屬離子絡(luò)合提供了富氮、富氧的配位環(huán)境[25-27]。與金屬離子配位后，共軛剛性骨架的形成引起體系熒光強(qiáng)度顯著變化，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)痕量金屬離子的檢測(cè)[28-32]。近年來，研究者開發(fā)了很多席夫堿類熒光探針， Tomer 等[33]設(shè)計(jì)合成了席夫堿類Cu2+熒光探針并將其應(yīng)用于環(huán)境水樣品中Cu2+的檢測(cè); Fu 等[34]合成了席夫堿類化合物并將其應(yīng)用于Zn2+和Al3+的檢測(cè)，該雙功能熒光探針可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)Zn2+和Al3+的痕量檢測(cè)；Liu 等[35]合成了一系列席夫堿類化合物，并將其應(yīng)用于細(xì)胞內(nèi)Al3+的檢測(cè)。

香草醛作為唯一商業(yè)化的芳香類木質(zhì)素衍生物，其來源廣、價(jià)格低，具有極大的工業(yè)化潛力。此外，從結(jié)構(gòu)上來看，香草醛及其衍生物作為有機(jī)合成的重要中間體，具有較高的化學(xué)反應(yīng)活性，易于通過化學(xué)合成方法進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化。本研究以鄰香草醛、香草醛、水楊醛和間茴香醛為原料，與水楊酰肼反應(yīng)，合成了4 種水楊酰腙型化合物（L1～L4），對(duì)比了這4 種化合物與Al3+的熒光響應(yīng)情況，采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）和核磁共振氫譜（1H NMR）探究了Al3+的響應(yīng)機(jī)理。最后，通過細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了探針在細(xì)胞內(nèi)痕量Al3+檢測(cè)方面的應(yīng)用潛力。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

F-7100 熒光分光光度計(jì)和UH5300 紫外-可見分光光度計(jì)（日本日立公司）；JMS-800D 高分辨質(zhì)譜儀（日本電子株式會(huì)社）；FM-4P-TCSPC 瞬態(tài)/穩(wěn)態(tài)熒光光譜儀（德國HORIBA JobinYvon 公司）；AV 400 MHz 核磁共振波譜儀（德國Bruker 公司）；STARTER2100 pH 測(cè)試儀（奧豪斯儀器（上海）有限公司）；N-1300 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）；TCS SP8 共聚焦顯微鏡（德國Leica 公司）。

香草醛、鄰香草醛、水楊醛、間茴香醛、水楊酰肼、乙酸乙酯、石油醚、二氯甲烷、甲醇、無水乙醇、N，N-二甲基甲酰胺及其它試劑均購自上海泰坦科技股份有限公司。所用試劑均為分析純，不經(jīng)進(jìn)一步處理，直接使用。

1.2 合成方法

實(shí)驗(yàn)所用化合物L(fēng)1～L4 的合成路線如式（1）所示：

1.2.1 化合物L(fēng)1 的合成

將水楊醛（244.24 mg， 2 mmol）和水楊酰肼（304.30 mg， 2 mmol）加入到無水乙醇（30 mL）中，加熱回流2 h，采用薄層色譜（TLC）跟蹤反應(yīng)進(jìn)程。反應(yīng)完畢后，減壓濃縮回收溶劑，得到387.34 mg 黃色固體L1，產(chǎn)率為75.08%。1H NMR（400 MHz， DMSO-d6）δ∶12.04（s， 1H）、11.80（s， 1H）、11.21（s， 1H）、8.69（s， 1H）、7.90（dd， J=8.0， 1.7 Hz， 1H）、7.57（dd， J=7.7， 1.7 Hz， 1H）、7.46（ddd， J=8.6， 7.2， 1.6 Hz，1H）、7.32 （ddd， J=8.5， 7.4， 1.7 Hz， 1H）， 6.97（ddd， J=15.4， 8.0， 4.2 Hz， 4H）。13C NMR（101 MHz，DMSO-d6）δ∶164.97、159.48、157.98、149.42、134.45、132.09、129.92、129.05、119.87、119.49、119.09、117.77、116.92、116.09。HRMS（ESI）calcd for C14H12N2O3 [M+H]+ 257.9423， found 257.9431 （詳見電子版文后支持信息圖S1～S3）。

1.2.2 化合物L(fēng)2 的合成

將間茴香醛（272.45 mg， 2 mmol）和水楊酰肼（304.30 mg， 2 mmol）加入到無水乙醇（30 mL）中，加熱回流2 h，采用TLC 跟蹤反應(yīng)進(jìn)程。反應(yīng)完畢后，減壓濃縮回收溶劑，得到412.31 mg 棕色固體L2，產(chǎn)率為76.07%。1H NMR（500 MHz， DMSO-d6）δ∶12.12（s， 2H）、8.80（s， 1H）、7.90（ddd， J=13.2， 7.8， 1.7 Hz，2H）、7.44（qd， J=8.4， 1.8 Hz， 2H）、7.13（d， J=8.4 Hz， 1H）、7.04（t， J=7.5 Hz， 1H）、6.98～6.82（m，2H）、3.88（s， 3H）。13C NMR（126 MHz， DMSO-d6）δ∶165.62、160.59、158.35、144.49、134.27、132.27、128.74、126.09、122.59、121.25、118.88、117.99、116.01、112.37、56.19。HRMS（ESI） calcd forC15H14N2O3[M+H]+271.1075， found 271.1082（詳見電子版文后支持信息圖S4～S6）。

1.2.3 化合物L(fēng)3 的合成

將鄰香草醛（304.25 mg， 2 mmol）和水楊酰肼（304.30 mg， 2 mmol）加入到無水乙醇（30 mL）中，加熱回流10 h，采用TLC 跟蹤反應(yīng)進(jìn)程。反應(yīng)完畢后，減壓濃縮回收溶劑，得到446.13 mg 黃色固體L3，產(chǎn)率為77.69%。1H NMR（400 MHz， DMSO-d6）δ∶11.94（d， J=14.2 Hz， 2H）、10.95（s， 1H）、8.75（s， 1H）、7.95（dd， J=8.0， 1.7 Hz， 1H）、7.57～7.44（m， 1H）、7.22（d， J=7.8 Hz， 1H）、7.13～7.07（m， 1H）、7.07～6.97（m， 2H）、6.92（t， J=7.9 Hz， 1H），、3.87（s， 3H）。13C NMR（101 MHz， DMSO-d6）δ∶165.00、159.55、149.31、148.45、147.71、134.41、129.06、121.20、119.56、119.44、119.35、117.78、116.15、114.42、56.30。HRMS（ESI）calcd for C16H16N2O3[M+H]+287.1051， found 287.1060（詳見電子版文后支持信息圖S7～S9）。

1.2.4 化合物L(fēng)4 的合成

將香草醛（304.25 mg， 2 mmol）和水楊酰肼（304.30 mg， 2 mmol）加入到無水乙醇（30 mL）中，加熱回流10 h，采用TLC 跟蹤反應(yīng)進(jìn)程。反應(yīng)完畢后，減壓濃縮回收溶劑，得到434.59 mg 黃色固體L4，產(chǎn)率為75.68%。1H NMR（400 MHz， DMSO-d6）δ∶11.98（s， 1H）、11.73（s， 1H）、9.70（d， J=63.5 Hz， 1H）、8.36（s， 1H）、7.90（dd， J=8.0， 1.7 Hz， 1H）、7.44（ddd， J=8.5， 7.1， 1.7 Hz， 1H）、7.34（d， J=1.9 Hz， 1H）、7.12（dd， J=8.2， 1.9 Hz， 1H）、7.01～6.92（m， 2H）、6.86（d， J=8.1 Hz， 1H）、3.84（s， 3H）。13C NMR（101 MHz， DMSO-d6），δ∶165.08、159.70、149.81、149.71、148.52、134.18、128.81、125.92、122.89、119.33、117.77、116.22、115.93、109.53、56.02。HRMS（ESI）calcd for C16H16N2O3[M+H]+ 287.1051，found 287.1060（詳見電子版文后支持信息圖S10～S12）。

1.3 溶液配制及光譜測(cè)試條件

將化合物L(fēng)1～L4 分別溶于DMF-H2O（1∶1， V/V）中，制備濃度為1.0 mmol/L 的探針母液，光譜測(cè)試時(shí)將探針母液稀釋至10 μmol/L。在靈敏度測(cè)試實(shí)驗(yàn)中，以AlCl3 配制不同濃度的Al3+溶液，分別滴入探針溶液中，記錄在不同濃度Al3+條件下探針溶液的熒光光譜變化情況。Al3+的檢出限（LOD）的計(jì)算公式為：LOD=3σ /k，其中， σ為空白樣品的標(biāo)準(zhǔn)偏差， k 為熒光強(qiáng)度與探針濃度的斜率。配制濃度為100 μmol/L 的不同金屬離子溶液（Ca2+、Cr3+、Cu2+、Cd2+、Al3+、Ni3+、Co2+、Ba2+、Fe3+、Fe2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+、Hg+和Ag+），在選擇性實(shí)驗(yàn)中，將不同金屬離子溶液分別加入探針溶液中，記錄金屬離子加入后探針溶液熒光光譜的變化情況。在干擾性實(shí)驗(yàn)中，將Al3+分別加入到含有不同金屬離子的探針溶液中，記錄加入后體系的熒光光譜變化。

在pH 響應(yīng)實(shí)驗(yàn)中，使用HCl 或NaOH 配制不同pH 值的探針溶液，并加入100 μmol/L Al3+，記錄熒光光譜的變化。動(dòng)力學(xué)響應(yīng)實(shí)驗(yàn)中，記錄加入Al3+后體系在不同時(shí)間點(diǎn)的熒光光譜變化情況。熒光光譜測(cè)試中的激發(fā)波長為375 nm，狹縫寬度為3 nm/5 nm。

1.4 細(xì)胞毒性檢測(cè)

通過CCK-8 法考察探針對(duì)HeLa 細(xì)胞的細(xì)胞毒性。HeLa 細(xì)胞在MEM+10% FBS 的條件下培養(yǎng)，然后將HeLa 細(xì)胞置于96 孔板中，在37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育24 h。向培養(yǎng)基中分別添加探針L1 和L3（0、3.13、6.25、12.5、50 和100 μmol/L），繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，加入CCK-8 溶液，在培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2 h，在搖床上輕輕混勻10 min。采用酶標(biāo)儀讀取各孔的光密度值（OD 值），按下面公式計(jì)算抑制率（I）：I （%）=（1–OD實(shí)驗(yàn)組/OD對(duì)照組）×100。

1.5 細(xì)胞成像

在37 ℃、5% CO2 的條件下， HeLa 細(xì)胞在含有10% FBS 和探針L1 和L3 的96 孔板中培養(yǎng)24 h。在培養(yǎng)基中添加5 μmol/L 探針L1 和L3，孵育30 min。用PBS 溶液洗滌3 次后，再分別與10、15 和20 μmol/L Al3+孵育30 min。對(duì)照組HeLa 細(xì)胞分別與5 μmol/L 探針L1 和L3 孵育30 min，與20 μmol/LAl3+孵育30 min，再與EDTA（60 μmol/L）孵育30 min。細(xì)胞成像前， HeLa 細(xì)胞用PBS 清洗3 次，去除細(xì)胞外的Al3+，采用激光共聚焦熒光顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞成像。

2 結(jié)果與討論

2.1 目標(biāo)化合物的合成

在探針的構(gòu)建中，選擇合適的熒光基團(tuán)和識(shí)別基團(tuán)是設(shè)計(jì)的關(guān)鍵。本研究選擇水楊醛、間茴香醛、鄰香草醛和香草醛為原料，與水楊酰肼發(fā)生加成消除反應(yīng)，得到水楊酰腙型熒光化合物L(fēng)1～L4，采用HRMS、1H NMR 和13C NMR 確認(rèn)了其結(jié)構(gòu)?；衔锝Y(jié)構(gòu)中的甲亞胺基、酰基和羥基為金屬離子提供了富氮、富氧的配位環(huán)境。香草醛及其衍生物具有優(yōu)異的熒光性能，可作為探針的熒光基團(tuán)。水楊酰腙型熒光探針可用作特異性熒光探針對(duì)Al3+進(jìn)行高靈敏檢測(cè)。此外，該合成路線具有化合物產(chǎn)率高、副產(chǎn)物少、提純方便和原料廉價(jià)易得等特點(diǎn)。

2.2 化合物L(fēng)1～L4 的光物理性質(zhì)研究

化合物L(fēng)1～L4 在DMF-H2O（1∶1， V/V）體系中的熒光發(fā)射光譜見電子版文后支持信息圖S13?；衔風(fēng)3 和L1 分別在500 和450 nm 處出現(xiàn)明顯的熒光發(fā)射峰，化合物L(fēng)2 和L4 未出現(xiàn)明顯的熒光發(fā)射峰。為進(jìn)一步了解化合物L(fēng)1～L4 熒光性能差異的原因，利用密度泛函理論計(jì)算（DFT）對(duì)化合物L(fēng)1～L4 的幾何結(jié)構(gòu)以及對(duì)應(yīng)的最低未占分子軌道（LUMO）和最高已占分子軌道（HOMO）進(jìn)行分析。如圖1 所示，化合物L(fēng)1～L4 的LUMO 軌道主要分布于整個(gè)化合物結(jié)構(gòu)中，而HOMO 軌道電子云主要分布于N-芐亞甲基乙酰肼結(jié)構(gòu)中。HOMO 軌道能量值越高，表明電子束縛力越小，容易給出電子。因此，化合物L(fēng)1（HOMO：?5.80 eV）與L3 （HOMO：?5.75 eV）相比，化合物L(fēng)3 結(jié)構(gòu)中N-芐亞甲基間位–OCH3 的引入有利于苯環(huán)上供電子能力的提高?；衔風(fēng)2 （HOMO：?5.93 eV）與L3 （HOMO：–5.75 eV）相比， L3 結(jié)構(gòu)中N-芐亞甲基鄰位–OH 的引入，使得苯環(huán)上的供電子能力明顯提高。對(duì)比L1（HOMO：–5.80 eV）與L2 （HOMO：–5.75 eV）發(fā)現(xiàn)，與N-芐亞甲基間位–OCH3 的引入相比，鄰位–OH 的引入更有利于苯環(huán)供電子能力的提高。對(duì)比化合物L(fēng)3（HOMO：–5.75 eV）與L4（HOMO：–5.87 eV）發(fā)現(xiàn)，與N-芐亞甲基對(duì)位–OH 的引入相比，鄰位–OH 的引入更有利于苯環(huán)供電子能力的提高。以上結(jié)果表明，水楊酰腙結(jié)構(gòu)中N-芐亞甲基鄰位–OH 和間位–OCH3 的引入最大程度上增加了苯環(huán)的供電子能力。

考察了加入Al3+前后化合物紫外-可見吸收光譜的變化。加入Al3+后，化合物L(fēng)1 在375 nm 處出現(xiàn)新的吸收峰（電子版文后支持信息圖S14）?；衔風(fēng)3 與Al3+后絡(luò)合后，在385 nm 處出現(xiàn)新的吸收峰（電子版文后支持信息圖S15）。進(jìn)一步通過熒光光譜分析化合物L(fēng)1～L4 對(duì)Al3+的熒光響應(yīng)性能，如電子版文后支持信息圖S16 所示，加入Al3+后，化合物L(fēng)1 和L3 溶液均出現(xiàn)明顯的熒光變化， L1 在450 nm 處的熒光信號(hào)明顯增強(qiáng)，體系顏色由無色變?yōu)樗{(lán)色，而化合物L(fēng)3 在500 nm 處出現(xiàn)明顯的熒光發(fā)射峰，體系顯示明顯的綠色熒光?；衔風(fēng)2 和L4 對(duì)Al3+僅有較弱的熒光響應(yīng)。因此，化合物L(fēng)1 和L3 可作為熒光探針對(duì)Al3+進(jìn)行檢測(cè)。

2.3 探針對(duì)Al3+的選擇性和抗干擾性能

考察了探針L1 和L3 在其它金屬離子存在下對(duì)Al3+的熒光響應(yīng)。如圖2A 所示，在其它干擾金屬離子（Ca2+、Cr3+、Cu2+、Cd2+、Al3+、Ni3+、Co2+、Ba2+、Fe3+、Fe2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+、Hg+和Ag+）存在的情況下，探針L1在DMF-H2O（1∶1， V/V; pH=7）體系中均未出現(xiàn)明顯的熒光發(fā)射峰，只有加入100 μmol/L Al3+后，體系的熒光強(qiáng)度明顯升高。同時(shí)，在含有不同金屬離子的探針L1溶液中分別加入Al3+ （100 μmol/L），體系均出現(xiàn)明顯的熒光響應(yīng)。

如圖2B 所示，在其它金屬離子存在的條件下，探針L3 在DMF-H2O（1∶1， V/V；pH=7）體系中均未出現(xiàn)明顯的熒光發(fā)射峰，只有加入100 μmol/L Al3+后，體系的熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)。在上述探針L3 溶液中加入不同金屬離子后，再加入100 μmol/L Al3+，體系在500 nm 處的熒光信號(hào)強(qiáng)度顯著增強(qiáng)。上述結(jié)果表明，探針L1 和L3 對(duì)Al3+均具有較好的選擇性，其它金屬離子未對(duì)Al3+的檢測(cè)產(chǎn)生影響。

2.4 體系pH 值及響應(yīng)時(shí)間的影響

考察了探針L1 和L3 識(shí)別Al3+的響應(yīng)時(shí)間。由圖3A 可知，加入Al3+ 90 s 后，探針L1 的DMF-H2O 溶液（1∶1， V/V；pH=7）出現(xiàn)較強(qiáng)的熒光響應(yīng)信號(hào)，隨著時(shí)間延長，探針L1 體系的熒光強(qiáng)度不斷增強(qiáng)，1600 s 后體系依然維持較強(qiáng)的熒光發(fā)射。同樣，在探針L3 的DMF-H2O（1∶1， V/V；pH=7）溶液中加入Al3+， 90 s 后體系出現(xiàn)明顯的熒光響應(yīng)，隨著時(shí)間延長，體系熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)， 1600 s 后體系依然維持穩(wěn)定的熒光發(fā)射（圖3B）。因此，探針L1 和L3 可以快速有效實(shí)現(xiàn)Al3+的檢測(cè)。

進(jìn)一步考察了探針L1 和L3 在pH 2～13 范圍內(nèi)對(duì)Al3+的識(shí)別能力，結(jié)果見電子版文后支持信息圖S17 和S18。在pH 6～11 范圍內(nèi)，探針L1 和L3 保持穩(wěn)定的熒光發(fā)射，能夠選擇性識(shí)別Al3+。

2.5 探針對(duì)Al3+的檢出限

在探針L1 的DMF-H2O（1∶1， V/V; pH=7）溶液中分別加入不同濃度的Al3+（0～200 μmol/L），如圖4A 所示，隨著加入的Al3+濃度增大，探針L1 在450 nm 處的熒光強(qiáng)度不斷增加。在20～160 μmol/L 范圍內(nèi)，Al3+濃度與探針L1 在450 nm 處的熒光強(qiáng)度呈良好的線性關(guān)系（圖4B），線性回歸方程為y=7.01x+377.69（R2=0.9927）。根據(jù)公式LOD=3σ/k，計(jì)算得到檢出限為25.1 nmol/L。

如圖5A 所示，在探針L3 的DMF-H2O（1∶1， V/V；pH=7）溶液中分別加入不同濃度的Al3+，隨著溶液中Al3+濃度（0～160 μmol/L）增加，探針L3 在500 nm 處的熒光強(qiáng)度逐漸增大，在17.3～120 μmol/L 濃度范圍內(nèi)， Al3+濃度與熒光強(qiáng)度呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為y=4.93x+402.37（R2=0.9932）（圖5B）。計(jì)算得到檢出限為17.3 nmol/L。因此，合成的探針L1 和L3 在Al3+檢測(cè)中均具有較好的靈敏度[36-42]。

2.6 探針對(duì)Al3+的識(shí)別機(jī)理研究

通過Job’s 曲線證明了探針L1 和L3 與Al3+以1∶1 的比例絡(luò)合（見電子版文后支持信息圖S19）。通過1H NMR 和MS 進(jìn)一步探究探針L1和L3 對(duì)Al3+的識(shí)別機(jī)理。如圖6A 所示，在探針L1的1H NMR 譜圖中，羥基上的Ha 和Hb 的化學(xué)位移峰分別出現(xiàn)在δ 11.84 和11.61 處，酰胺上的Hc 的化學(xué)位移峰出現(xiàn)在δ 11.15處。加入Al3+后，在δ 11.84 和11.15 處的羥基上的Ha 以及酰胺上的Hc 的峰逐漸消失，在δ 11.61 處的羥基上的Hb 信號(hào)移動(dòng)至δ 11.66 處。根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)探針L1 與Al3+的識(shí)別機(jī)理如圖6B 所示。此外，探針L3 以及探針L3-Al3+的1H NMR 結(jié)果表明，與Al3+絡(luò)合后，探針L3 中的羥基上的Ha（δ 11.94）與酰胺上的Hc（δ 10.95）的信號(hào)峰消失，羥基上的Hb 的信號(hào)峰由δ 11.94 轉(zhuǎn)移至δ 11.51（電子版文后支持信息圖S20A）。Al3+與探針L3 的配位機(jī)理與探針L1 相似（電子版文后支持信息圖S20B），結(jié)構(gòu)中羥基上的O 以及酰胺基上的N 與Al3+配位。通過LCMS 進(jìn)一步驗(yàn)證以上推測(cè)結(jié)果，如電子版文后支持信息圖S21A 所示，在m/z 351.30 處出現(xiàn)的離子峰可歸屬于L1-Al3+（[M?1]+，計(jì)算值為m/z 351.99）；如電子版文后支持信息圖S21B 所示，在m/z 381.20 處出現(xiàn)的離子峰可歸屬于L3-Al3+（[M?1]+，計(jì)算值為m/z 381.00）。

通過DFT計(jì)算進(jìn)一步驗(yàn)證探針L1 和L3 與Al3+的配位機(jī)理。圖6C 展現(xiàn)了探針L1 和探針L1-Al3+優(yōu)化后的幾何結(jié)構(gòu)，以及對(duì)應(yīng)的LUMO和HOMO 軌道。探針L1 的LUMO 軌道電子云分布于整個(gè)分子結(jié)構(gòu)中，而HOMO 軌道的電子云分布于N-芐亞甲基乙酰肼結(jié)構(gòu)中。此外，探針L1-Al3+的LUMO 軌道電子集中在Al3+周圍， HOMO 軌道的電子分布集中在N-芐亞甲基上。探針L1-Al3+的HOMO-LUMO 能帶能隙（1.56 eV）明顯小于探針L1（4.18 eV）。同時(shí)，探針L3 的HOMO-LUMO 能帶能隙值為4.11 eV，探針L3-Al3+的能帶能隙值減至1.22 eV，此結(jié)果表明，探針L1和探針L3與Al3+形成穩(wěn)定的配合物。此外，探針L3-Al3+的HOMOLUMO能帶能隙值（1.22 eV）小于探針L1-Al3+（1.56 eV），與探針L1-Al3+相比，探針L3-Al3+的最大熒光發(fā)射峰明顯紅移，分別移至500 nm（L3-Al3+）和450 nm（L1-Al3+），詳見電子版文后支持信息圖S20C。

2.7 細(xì)胞內(nèi)Al3+的熒光成像

采用CCK-8 法評(píng)價(jià)探針對(duì)HeLa 細(xì)胞的細(xì)胞毒性。結(jié)果顯示，當(dāng)使用3.125、6.25、12.5、25、50 和100 μmol/L 的探針L1 和L3 處理細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞存活率均大于80%（電子版文后支持信息圖S22A 和S22B）；當(dāng)探針L1 和L3 的濃度為200 μmol/L 時(shí)，細(xì)胞存活率大于50%。上述結(jié)果表明，探針L1 和L3的細(xì)胞毒性較低，可應(yīng)用于細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)。

為進(jìn)一步評(píng)價(jià)探針L1 和L3 示蹤活細(xì)胞中Al3+的能力，采用探針L1 和L3 進(jìn)行了細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)。如圖7A 所示，將HeLa 細(xì)胞與探針L1 孵育30 min 后，未出現(xiàn)明顯的熒光現(xiàn)象。將探針L1 預(yù)處理的HeLa細(xì)胞與不同濃度Al3+（0、5、10、15 和20 μmol/L）孵育30 min 后， HeLa 細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)明顯的藍(lán)色熒光。同時(shí)，隨著Al3+濃度增大，細(xì)胞內(nèi)藍(lán)色熒光逐漸增強(qiáng)。此外，探針L3 預(yù)處理的HeLa 細(xì)胞與不同濃度的Al3+（0、5、10、15 和20 μmol/L）孵育30 min 后， HeLa 細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)明顯的綠色熒光，熒光強(qiáng)度隨Al3+濃度升高而逐漸增強(qiáng)（圖7B）。對(duì)照組中， HeLa 細(xì)胞與探針L1 和L3 孵育30 min 后，依次加入20 μmol/LAl3+和60 μmol/L EDTA 后，體系中未出現(xiàn)明顯熒光，表明Al3+與EDTA 形成絡(luò)合物后，體系未出現(xiàn)明顯熒光。因此，探針L1 和L3 均具有較好的細(xì)胞滲透性，可用于細(xì)胞內(nèi)Al3+的檢測(cè)。

3 結(jié)論

設(shè)計(jì)合成了新型水楊酰腙型化合物L(fēng)1～L4，并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征。對(duì)比化合物L(fēng)1～L4 與Al3+的熒光響應(yīng)結(jié)果，表明化合物L(fēng)1 和L3 可作為Al3+熒光探針。在DMF-H2O（1∶1， V/V；pH=7）體系中，探針L1和L3 可實(shí)現(xiàn)Al3+的特異性識(shí)別，以及快速且高靈敏的檢測(cè)，檢出限分別為25.1 和17.3 nmol/L。采用1H NMR、MS 以及理論計(jì)算進(jìn)一步分析了探針L1 和L3 對(duì)Al3+的識(shí)別機(jī)理。探針L1 和L3 的細(xì)胞毒性低，可用于活細(xì)胞中Al3+的熒光成像。本研究為特異性Al3+熒光探針的合成提供了新思路。

References

[1] WU L， YAO S， XU H， ZHENG T， LIU S， CHEN J， LI N， WEN H. Chin. Chem. Lett. ， 2022， 33（1）： 541-546.

[2] LU X， WU M， WANG S， QIN J， LI P. Dyes Pigm. ， 2022， 203： 110372.

[3] MAITY M B， DUTTA B， RAHAMAN A， SAHU N， MANDAL D P， BHATTACHARJEE S， SINHA C. J. Mol. Struct. ， 2022，1250： 131870.

[4] GUO F F， WANG B B， WU W N， BI W Y， XU Z H， FAN Y C， BIAN L Y， WANG Y. J. Mol. Struct. ， 2022， 1251： 132073.

[5] MU Y， FAN H， LI M， WANG R， CHEN Z， FAN C， LIU G， PU S. J. Mater. Chem. B， 2022， 10（44）： 9235-9248.

[6] CHEN Y， SUN Z， HOU Y， GAO D， LI Z. Process Saf. Environ. Prot. ， 2022， 165： 336-346.

[7] CAI S， WU L， WANG G， LIU J， SONG J， XU H， LUO J， SHEN Y， SHEN S. Ecotoxicol. Environ. Saf. ， 2022， 229： 113048.

[8] YEO K F H， DONG Y， YANG Y， LI C， WU K， ZHANG H， CHEN Z， ATSE E B， YANG L， WANG W. Environ. Pollut. ，2022， 314： 120236.

[9] RYAN P R， YANG J. Cell Res. ， 2024， 34（4）： 269-270.

[10] LI C H， SHE W Z， LIU J Z， LI R S， CAO Q. Colloids Surf. ， A， 2024， 691： 133841.

[11] DATHEES T J， NARMATHA G， PRABAKARAN G， SEENITHURAI S， CHAI J D， KUMAR R S， PRABHU J，NANDHAKUMAR R. Food Chem. ， 2024， 441： 138362.

[12] XU H Y， ZHANG S Z， GU Y L， LU H F. Spectrochim. Acta， Part A， 2022， 265： 120364.

[13] OU Z， WANG M， ZHANG Z， LIANG J， TANG J， LEI X， YANG L， LIU H， MA L J. Microchem. J. ， 2023， 195： 109386.

[14] LI R Y， WEI Z L， WANG L， ZHANG Y， RU J X. Microchem. J. ， 2021， 162： 105720.

[15] ?EMEN S， MERCAN S， YAYLA M， A?IKKOL M. Food Chem. ， 2017， 215： 92-100.

[16] HUTCHINSON R W， COX A G， MCLEOD C W， MARSHALL P S， HARPER A， DAWSON E L， HOWLETT D R. Anal.Biochem. ， 2005， 346（2）： 225-233.

[17] DRAVECZ G， BENCS L， BEKE D， GALI A. Talanta， 2016， 147： 271-275.

[18] SMITH C D， DIETZ M L. Talanta， 2021， 222： 121541.

[19] WALTER E R H， LEE L C C， LEUNG P K K， LO K K W， LONG N J. Chem. Sci. ， 2024， 15（13）： 4846-4852.

[20] WANG X， DING Q， GROLEAU R R， WU L， MAO Y， CHE F， KOTOVA O， SCANLAN E M， LEWIS S E， LI P， TANG B，JAMES T D， GUNNLAUGSSON T. Chem. Rev. ， 2024， 124（11）： 7106-7164.

[21] SHARMA A， VERWILST P， LI M， MA D， SINGH N， YOO J， KIM Y， YANG Y， ZHU J H， HUANG H， HU X L， HE X P，ZENG L， JAMES T D， PENG X， SESSLER J L， KIM J S. Chem. Rev. ， 2024， 124（5）： 2699-2804.

[22] LI M， LI N， SHAO F， WANG R， CHEN M， ZHAO Y， LI R. Spectrochim. Acta， Part A， 2024， 308： 123676.

[23] YAN Q， WANG Y， WANG Z L， ZHANG G， XU H J. Spectrochim. Acta， Part A， 2022， 279： 121384.

[24] CHEN H， LI X， GAO P， PAN Y， LIU J. J. Mol. Struct. ， 2022， 1262： 133015.

[25] FANG Y， CHEN R X， QIN H F， WANG J J， WANG K P， HU Z Q. Sens. Actuators， B， 2021， 334： 129603.

[26] WANG J T， PEI Y Y， YAN M Y， LI Y G， YANG G G， QU C H， LUO W， WANG J， LI Q F. Microchem. J. ， 2021， 160：105776.

[27] YIN P C， NIU Q F， LIU J Q， WEI T， QIN X Y， CHEN J B. Sens. Actuators， B， 2021， 331： 129418.

[28] YANG J L， HUANG C X， XU X， YANG H M， WU L R. Spectrochim. Acta， Part A， 2021， 255： 119730.

[29] YAN H， ZHONG K， LU Y. Anal. Methods， 2019， 11（28）： 3597-3607.

[30] SUN H， SUN S S， HAN F F， ZHAO Y， LI M D， MIAO B X， NIE J， ZHANG R， NI Z H. Chem. Eng. J. ， 2021， 405： 127000.

[31] ZHONG W， WANG L， FANG S， QIN D， ZHOU J， YANG G， DUAN H. RSC Adv. ， 2020， 10（6）： 3048-3059.

[32] WEN X， FAN Z. Anal. Chim. Acta， 2016， 945： 75-84.

[33] TOMER N， GOEL A， GHULE V D， MALHOTRA R. J. Mol. Struct. ， 2021， 1227： 129549.

[34] FU J X， CHANG Y X， LI B， WANG X H， XU K X. Spectrochim. Acta， Part A， 2020， 225： 117493.

[35] LIU T T， LI S J， FU H， TIAN Z N， SUN X J， XING Z Y. J. Photochem. Photobiol. ， A， 2020， 403： 112865.

[36] ZHANG Y， XUE L， XU Y， ZENG Z， WANG X， WANG H. Spectrochim. Acta， Part A， 2023， 302： 123013.

[37] DAS A， DAS G. New J. Chem. ， 2022， 46（39）： 19002-19008.

[38] XIE Y Q， HAN M M， ZHANG Y M， CHEN H， ZHANG H B， REN C Y， LI L， WU R， YAO H， SHI X N， LIN Q， WEI T B. J.Photochem. Photobiol. ， A， 2023， 437： 114488.

[39] WANG J， HU K， WANG H， SUN W， HAN L， LI L， WEI Y. J. Mol. Struct. ， 2023， 1271： 134085.

[40] ZHAO L， HE X， XIE K， HU J， DENG M， ZOU Y， GAO S， FU Y， YE F. Spectrochim. Acta， Part A， 2023， 285： 121882.

[41] DAS S， DAS M， LAHA S， RAJAK K， CHOUDHURI I， BHATTACHARYYA N， SAMANTA B C， MAITY T. J. Mol. Struct. ，2022， 1263： 133214.

[42] LII P， LI R， WANG K， LIU Q， REN B， DING Y， GUAN R， CAO D. Spectrochim. Acta， Part A， 2022， 276： 121213.

支持信息

水楊酰腙型高選擇性鋁離子熒光探針的合成及其應(yīng)用研究

譚浩雪 王忠龍 楊曉琴 饒小平 趙平 姜倩

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No. 32160350）和云南省基礎(chǔ)研究項(xiàng)目（Nos. 202201AU070069， 202301BD070001-117）資助。