手持式折光儀間接測定甘蔗中總糖含量及其不確定度評估

摘要：建立手持式折光儀糖度與甘蔗汁中總糖含量的定量關(guān)系，為甘蔗生產(chǎn)上快速、準確檢測甘蔗糖度提供技術(shù)支持。采用手持式折光儀測定甘蔗汁糖度后再將甘蔗汁進行適當稀釋，經(jīng)加蒸餾水和HCl溶液，用保鮮膜密封，在恒溫水浴中進行酸水解后使用3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylicacid，DNS）法測定其還原糖含量，間接獲取甘蔗汁總糖含量，形成一種采用手持式折光儀間接測定甘蔗汁總糖含量的方法，并對其不確定度進行評估。結(jié)果表明，建立的手持式折光儀甘蔗汁糖度與甘蔗汁總糖含量關(guān)系曲線為y=8.462x+0.4338，相關(guān)系數(shù)（R2）=0.9951，標準不確定度為2.045%，擴展不確定度為4.09%（k=2），其中，由甘蔗汁糖度與總糖含量標準曲線擬合引入的不確定度最大；在一定誤差范圍內(nèi)，手持式折光儀間接測定甘蔗汁總糖含量法可將手持式折光儀的讀數(shù)直接轉(zhuǎn)換為甘蔗汁的總糖含量。因此，以手持式折光儀間接測定甘蔗汁總糖含量法操作簡便，結(jié)果重現(xiàn)性好，準確可靠，可作為甘蔗品種選育及制糖領(lǐng)域質(zhì)量控制的參考方法應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：甘蔗汁；還原糖含量；總糖含量；手持式折光儀；間接測定法；不確定度

中圖分類號：TS247" " " " " " " " " " " " "文獻標志碼：A 文章編號：2095-820X（2025）01-0008-05

0 引言

甘蔗主要種植于熱帶亞熱帶地區(qū)，是我國最主要的糖料作物［1］。甘蔗壓榨后的甘蔗汁可進一步加工成食糖［2］，而食糖是重要的戰(zhàn)略資源，因此，我國非常重視甘蔗生產(chǎn)，甘蔗種植面積和產(chǎn)量分別排在全球第4位和第3位［3］。隨著甘蔗產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，簡單、快速、準確、經(jīng)濟地測定甘蔗的總糖含量，對于甘蔗原料及其產(chǎn)品的開發(fā)和利用極其重要。甘蔗汁含有豐富的糖分，如蔗糖、果糖和葡萄糖，其中又以蔗糖為主。蔗糖是一種非還原性雙糖，其含量測定的常用方法有離子色譜法［4］、高效液相色譜法［5-6］、化學(xué)法［7］、旋光法［8］、紅外光譜法［9］、酶—比色法［10］和旋光度測定法［11］等。其中，有些方法所使用的儀器較昂貴，如高效液相色譜儀和紅外光譜儀；有些方法操作過程繁瑣，測定時間較長，要測定甘蔗汁中的蔗糖含量須基于蔗糖在加熱條件下經(jīng)鹽酸水解轉(zhuǎn)化為還原糖，蔗糖酸解后產(chǎn)生葡萄糖和果糖［12］，再使用紫外分光光度法測定甘蔗汁中的蔗糖含量［13］，整個操作過程需耗時約60 min。近年來，隨著科技的發(fā)展，已實現(xiàn)手持式折光儀快速測定果汁中糖度［14］。手持式折光儀是根據(jù)光折射原理，其測定結(jié)果是樣品中可溶性固形物成分的濃度百分比數(shù)值［15-16］，在純糖溶液中該數(shù)值相當于純糖溶液的糖度（°Brix）或總糖含量。但甘蔗汁中除含有糖類外，還存在非糖物質(zhì)，故手持式折光儀直接測量甘蔗汁中的總糖濃度準確度偏低，因此，目前鮮見以手持式折光儀測定甘蔗汁中總糖含量后進行不確定度評估的報道。本研究采用手持式折光儀測定甘蔗汁糖度，建立手持式折光儀糖度與甘蔗汁中總糖含量的定量關(guān)系，間接獲取甘蔗汁總糖含量，并對其不確定度進行評估，最終形成一種采用手持式折光儀間接測定甘蔗汁總糖含量的方法，為甘蔗生產(chǎn)上快速準確檢測甘蔗糖度提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

甘蔗汁由廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院實驗基地提供。試驗試劑酒石酸鉀鈉、3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylicacid，DNS）、苯酚、亞硫酸氫鈉、葡萄糖和蔗糖均為分析純，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

主要儀器設(shè)備：PAL迷你數(shù)顯折射計（廣州市愛宕科學(xué)儀器有限公司）、UVmini-1240紫外—可見分光光度計（日本島津公司）、PL303電子分析天平［梅特勒—托利多儀器（上海）有限公司］、TW12水浴鍋［優(yōu)萊博技術(shù)（北京）有限公司］。

1.2 試驗方法

1.2.1 還原糖標準曲線繪制

稱取105 ℃烘干的葡萄糖0.2500 g，加水溶解并定容至250.0 mL，得到1.0 mg/mL葡萄糖標準液。分別取葡萄糖標準液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4和1.6 mL，加入蒸餾水至2.0 mL，再加入1.5 mL DNS溶液，混勻，沸水浴5 min，取出用冷水冷卻至室溫，再加入21.5 mL蒸餾水，搖勻，在540 nm處測定吸光度（OD540），每個梯度設(shè)3次平行，以每組的平均值減去空白組平均值，繪制還原糖標準曲線。

1.2.2 蔗糖標準曲線及蔗糖含量與糖度關(guān)系曲線測定

稱取105 ℃烘干的蔗糖11.2000 g，加水溶解并定容至100.0 mL，得到112.0 mg/mL蔗糖標準液。分別取蔗糖標準液0、0.125、0.250、0.375、0.500、0.625、0.750、0.875和1.000 mL，分別加入適量蒸餾水定容至1.000 mL，得到濃度分別為14.0、28.0、42.0、56.0、70.0、84.0、98.0和112.0 mg/mL的蔗糖溶液，使用手持式折光儀測定其糖度。分別取不同濃度的蔗糖溶液0.1 mL，10倍梯度稀釋得到相應(yīng)的蔗糖溶液。取稀釋后的蔗糖溶液1.0 mL置于試管中，分別加入5.0 mL蒸餾水和1.0 mL的6.0 mol/L HCl，蓋上保鮮膜，70 ℃恒溫水浴20 min，取出后立即冷卻至室溫，加入1滴酚酞指示劑，用6.0 mol/L NaOH溶液中和至溶液呈微紅色，即得到不同濃度蔗糖水解液，用于總糖含量測定。取不同濃度蔗糖水解液1.0 mL按1.2.1的方法測定OD540，繪制蔗糖標準曲線。同時，建立不同濃度蔗糖溶液的糖度、稀釋倍數(shù)及其稀釋后總糖含量關(guān)系曲線，以評估該關(guān)系曲線的可靠性。

1.2.3 甘蔗汁總糖標準曲線及其總糖含量與糖度關(guān)系曲線測定

取新鮮甘蔗汁，加入新配制的石灰乳調(diào)節(jié)pH至7.0，靜置澄清后取濾液，通過濃縮或稀釋分別調(diào)整其糖度為1.4、2.8、4.2、5.6、7.0、8.4、9.8和11.2 °Brix（采用手持式折光儀測定）。將上述不同糖度的甘蔗汁10倍稀釋后，按1.2.2的方法制備甘蔗汁水解液，再按1.2.1的方法繪制甘蔗汁總糖標準曲線。最后，建立不同濃度甘蔗汁的糖度、稀釋倍數(shù)及其稀釋后總糖含量關(guān)系曲線，并對其標準物質(zhì)稱量、手持式折光儀測量重復(fù)性、溫度計示值誤差、手持式折光儀示值誤差及由標準曲線擬合引入的不確定度進行評估。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標準曲線和蔗糖標準曲線的測定結(jié)果

以葡萄糖濃度為橫坐標、OD540為縱坐標繪制的葡萄糖標準曲線（圖1-A），其回歸方程為y=0.4838x-0.01122，相關(guān)系數(shù)（R2）=0.9992，說明葡萄糖濃度與OD540具有較好的線性關(guān)系，可用于計算樣品中的還原糖含量。從圖1-B可看出，將蔗糖酸水解為還原糖后，使用DNS法測定其OD540，并繪制蔗糖標準曲線，得到回歸方程為y=0.0769x-0.01454（R2=0.9990），說明蔗糖濃度與OD540具有較好的線性關(guān)系，蔗糖水解為還原糖的方法具有較高穩(wěn)定性。由此可見，蔗糖酸水解體系可將蔗糖溶液中的蔗糖基本水解，且在允許的誤差范圍內(nèi)可利用酸水解方法將以蔗糖為主的甘蔗汁水解，從而測定其總糖含量。

2.2 蔗糖溶液糖度與總糖含量測定結(jié)果及其相關(guān)性

將蔗糖水解為還原糖后測定的OD540代入葡萄糖標準曲線中，計算獲得實測蔗糖溶液的還原糖含量，再乘以稀釋倍數(shù)，即得到實測蔗糖的總糖含量，最終建立以蔗糖溶液糖度為橫坐標、蔗糖總糖含量為縱坐標的關(guān)系曲線（表1）。由表1可知，蔗糖溶液糖度與蔗糖總糖含量的關(guān)系曲線為y=10.04x+0.7509（R2=0.9994），說明在一定的蔗糖濃度范圍內(nèi)，手持式折光儀測定法可代替紫外分光光度法測定蔗糖樣品溶液中的總糖含量，且能應(yīng)用于以蔗糖含量為主的甘蔗汁總糖含量測定。

2.3 甘蔗汁總糖標準曲線及其總糖含量與糖度的關(guān)系曲線

從圖2可看出，以不同糖度甘蔗汁被酸水解后測定還原糖OD540繪制的甘蔗汁糖度與OD540標準曲線具有較好的線性關(guān)系（R2=0.9944），說明甘蔗汁糖度與甘蔗汁總糖含量間存在較好的轉(zhuǎn)換關(guān)系，且在該糖度范圍（0～11.2 °Brix）內(nèi)，手持式折光儀測定法可代替紫外分光光度法間接測定甘蔗汁中的總糖含量；以甘蔗汁糖度為橫坐標、甘蔗汁總糖含量為縱坐標繪制的甘蔗汁糖度與其總糖含量轉(zhuǎn)換關(guān)系曲線為y=8.462x+0.4338（R2=0.9951），轉(zhuǎn)換關(guān)系曲線相關(guān)性較好。說明在一定誤差范圍內(nèi)，甘蔗汁糖度與其總糖含量轉(zhuǎn)換關(guān)系曲線可用于手持式折光儀測定甘蔗汁糖度，并計算甘蔗汁總糖含量。

2.4 不確定度評估

2.4.1 標準物質(zhì)稱量引入的不確定度u（x1）

由稱量標準物質(zhì)所使用的電子天平（量程為0.0000～50.0000 g）檢定證書可知，稱量標準物質(zhì)的最大允許誤差為±0.0005 g。當蔗糖的實際稱量質(zhì)量為11.2000 g時，按矩形分布計算，由標準物質(zhì)稱量引入的不確定度［17］為：

2.4.2 手持式折光儀測量重復(fù)性引入的不確定度u（x2）

用手持式折光儀分別測定3種濃度（4.0、8.2和11.2 °Brix）的甘蔗汁，連續(xù)測定8次，將測定結(jié)果與標準偏差記錄于表2。對3個標準偏差整合成合并樣品偏差（sp），實際測定重復(fù)3次，取算術(shù)平均值作為手持式折光儀測量重復(fù)性引入的不確定度［18］為：

2.4.3 由溫度計示值誤差引入的標準不確定度u（x3）

數(shù)字式溫度計的最大允許誤差為±0.1 ℃，由在線糖量（含量）計校準的附錄C［19］可知：在20.0 ℃時，溫度每變化0.1 ℃，以被測濃度最大值11.2%計，蔗糖質(zhì)量分數(shù)引入的最大允許誤差為±0.0070%。假設(shè)服從均勻分布，由溫度計示值誤差引入的不確定度為：

2.4.4 手持式折光儀示值誤差引入的不確定度u（x4）

手持式折光儀示值的最大允許誤差為±0.1000%，假設(shè)服從均勻分布，由手持式折光儀示值誤差引入的不確定度為：

2.4.5 由標準曲線擬合引入的不確定度u（x5）

由甘蔗汁糖度與總糖含量標準曲線（圖2）擬合引入的不確定度［20］為：

式中，sR表示標準曲線殘差標準偏差（3.3702），b為標準曲線斜率（8.462），x—樣品為甘蔗汁樣品8次測定結(jié)果平均值（7.6 °Brix）；P為甘蔗汁樣品測定次數(shù)（8次），x標準為甘蔗汁標準樣品糖度平均值（8.0 °Brix）；xi為每個甘蔗汁標準樣品濃度。將上述的公式（1）～公式（4）代入公式（5），得到u（x5）=2.0436%。

2.4.6 不確定度評估結(jié)果

綜合2.4.1～2.4.5的不確定度分量相互獨立，需合成標準不確定度（uc）［17］：

取包含因子k=2，則擴展不確定度為U=kuc=4.0900%。當測量甘蔗汁的總糖含量為50.000 mg/L時，其拓展不確定度為50.0000 mg/L×4.0900%= 2.0450 mg/L，即測量結(jié)果表示為50.0000±2.0450 mg/L（k=2）。

3 討論

甘蔗中存在大量以蔗糖為主的糖類，為了檢測甘蔗汁中的總糖含量，可使用手持式折光儀快速測定，但甘蔗汁中存在的非糖物質(zhì)會干擾測量結(jié)果，使用手持式折光儀測定得到的甘蔗汁總糖含量準確度偏低，與黃宏等［15］的研究結(jié)果一致。本研究將蔗糖和甘蔗汁分別酸水解成還原糖，再以DNS法測定還原糖含量間接得到總糖含量，在此過程中發(fā)現(xiàn)蔗糖和甘蔗汁的糖度分別與OD540標準曲線具有較好的線性關(guān)系，R2分別為0.9994和0.9944，與李利軍等［13］的研究結(jié)果相似，說明甘蔗汁糖度與甘蔗汁總糖含量間存在較好的轉(zhuǎn)換關(guān)系，且在0～11.2 °Brix范圍內(nèi)，手持式折光儀測定法可代替紫外分光光度法間接測定甘蔗汁中的總糖含量。由此可見，可用甘蔗汁酸水解后進行DNS測定還原糖的方法對手持式折光儀測定的甘蔗汁總糖含量進行校正。通過試驗驗證，最終建立了手持式折光儀甘蔗汁糖度與甘蔗汁總糖含量關(guān)系曲線y=8.462x+0.4338（R2=0.9951）。

此外，本研究進行了標準物質(zhì)稱量、手持式折光儀測量重復(fù)性、溫度計示值誤差、手持式折光儀示值誤差及由標準曲線擬合引入的不確定度評估，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其標準不確定度為2.0450%，擴展不確定度為4.0900%（k=2），其中，由甘蔗汁糖度與總糖含量標準曲線擬合引入的不確定度最大（2.0436%），與王麗敏等［20］的研究結(jié)果存在差異，可能與甘蔗汁需酸水解成還原糖再進行測定及手持式折光儀的測量精確度不高有關(guān)；其他3個指標引入的不確定度均較低（0.0026%～0.0577%）。因此，在建立手持式折光儀甘蔗汁糖度與甘蔗汁總糖含量關(guān)系曲線時，需特別注意甘蔗汁的酸水解操作及其糖度測定的準確性，同時選用精確度更高的手持式折光儀（分度值≤0.01%），以提高該方法測定的準確性。

4 結(jié)論

通過手持式折光儀間接測定甘蔗汁總糖含量的方法可將手持式折光儀的讀數(shù)直接轉(zhuǎn)換為用于計算甘蔗汁溶液中總糖含量的數(shù)據(jù)，且使用儀器簡單，無需使用有毒或昂貴的試劑，操作快速簡便，讀數(shù)直觀，工作效率得到極大提高，測定結(jié)果重現(xiàn)性好，準確可靠，可作為甘蔗品種選育及制糖領(lǐng)域質(zhì)控的參考方法。

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（責任編輯 王 暉）

收稿日期：2025-01-03

基金項目：四川旅游發(fā)展研究中心項目（LY21-42）；宜賓職業(yè)技術(shù)學(xué)院科技科研平臺項目（ybzy21kypt-02）；宜賓職業(yè)技術(shù)學(xué)院院級科研項目（ZR22ZD-04，GZJG2022-721）

通信作者：李秀萍（1990-），女，碩士，副教授，主要從事食品微生物及發(fā)酵工程研究工作，E-mail：574849972@qq.com

第一作者：陸兵（1988-），男，博士，講師，主要從事生物質(zhì)資源轉(zhuǎn)化技術(shù)與微生物發(fā)酵技術(shù)研究工作，E-mail：583391765@qq.com