細胞質雄性不育表型及不育機制研究進展

摘 要：" 植物線粒體基因組內特殊的開放閱讀框（open reading frame， ORF）導致植物不產(chǎn)生雄配子或產(chǎn)生的雄配子無法正常受精，這種現(xiàn)象被稱為細胞質雄性不育（cytoplasmic male sterility， CMS）。CMS材料雄配子穩(wěn)定敗育的特性使其在雜交種商業(yè)化生產(chǎn)中一直扮演著重要角色，有效降低了制種成本，提高了雜交種純度。隨著對CMS現(xiàn)象研究的深入，新的CMS材料通過各種手段被不斷創(chuàng)制出來，相關的不育基因也逐漸被定位和克隆。該文首先概述了目前對CMS基因進化的研究和常用CMS材料及其相關CMS基因的挖掘情況，隨后總結了CMS材料在物質能量代謝、激素水平等方面的表型特點。同時整合了當前對CMS分子機制的幾種假說，并結合實驗證據(jù)提出對CMS分子機制的觀點。以期在總結當前細胞質雄性不育研究的基礎上對未來更加深入的理論和實驗研究提供參考。

關鍵詞： 細胞質雄性不育， 線粒體基因組， 活性氧（ROS）， 開放閱讀框（ORF）， CMS分子機制

中圖分類號：" Q944

文獻標識碼：" A

文章編號：" 1000-3142（2025）03-0483-17

Advances in cytoplasmic male sterility phenotype and infertility mechanism

WANG Xuesong1，2， ZOU Yi1， WANG Jie1， NIE Liyun1， WU Zhiqiang1*

（ 1." Shenzhen Branch， Guangdong Laboratory of Lingnan Modern Agriculture， Agricultural Genomics Institute at Shenzhen， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Shenzhen 518120， Guangdong， China;

2. College of Plant Science amp; Technology， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， China ）

Abstract：" The presence of some specialized open reading frames （ORFs） within plant mitochondrial genomes can cause the failure of male gamete production or their abnormal fertilization， which is referred to as cytoplasmic male sterility （CMS）. CMS material is of great value in the commercial production of hybrid seeds， owing to their sterility effectively reduce breeding costs and enhance hybrid seed purity. With progressive investigations， new CMS materials are continuously being created through various means， with associated sterility genes being identified and cloned. Herein， the current research on the evolution of CMS genes is throughly reviewed， as well as the exploration of common CMS materials and their responsible CMS genes. The phenotypic characteristics of CMS materials in material-energy metabolism and hormone levels are summarized. Meanwhile， several hypotheses concerning the molecular mechanisms of CMS are discussed and some new insights are proposed based on the empirical evidence. This review aims to assist in integrating the current research on cytoplasmic male sterility and contributing to more profound theoretical and experimental investigations in the future.

Key words： cytoplasmic male sterility （CMS）， mitochondrial genome， reactive oxygen species （ROS）， open reading frames （ORF）， molecular mechanism of CMS

細胞質雄性不育現(xiàn)象（cytoplasmic male sterility， CMS）普遍存在于植物界中，至今已在超過150種植物中觀察到這一現(xiàn)象（Xu et al.， 2022）。1763年德國生物學家Joseph Gottlieb Klreuter首次記錄了植物在種內和種間雜交中出現(xiàn)的花藥敗育現(xiàn)象（Mayr， 1986）。1931年美國植物學家Marcus Morton Rhoades在玉米（Zea mays）不育系的研究中發(fā)現(xiàn)不育性狀遵循母系遺傳（Rhoades， 1931）。CMS現(xiàn)象是由植物線粒體基因組重組產(chǎn)生的特殊開放閱讀框（open reading frame， ORF）與細胞核基因組互作引起，主要表現(xiàn)為植物不產(chǎn)生雄配子或雄配子無法完成正常受精作用，但雌配子仍能與正常雄配子結合完成受精作用。

線粒體不僅是細胞的能量供給場所，而且還通過與其他細胞結構相互協(xié)調，在細胞內信號傳導、氧化還原穩(wěn)態(tài)調節(jié)等方面同樣起著重要作用（Ghifari et al.， 2023）。根據(jù)內共生假說，線粒體起源于約10億年前的α-變形菌（α-Proteobacteria），經(jīng)過漫長的內共生過程逐步演化而來（Gray et al.， 1999; Braun amp; Klusch， 2024）。在內共生過程中線粒體與細胞核、葉綠體三套基因組之間不斷進行著遺傳物質的轉移，即細胞內水平基因轉移（intracellular gene transfer， IGT），在IGT過程中以葉綠體和線粒體的序列向細胞核轉移為主（Kleine et al.， 2009; Wang et al.， 2022）。相較于目前最接近線粒體原始祖先的立克次氏體（Rickettsiale），線粒體基因組的尺寸減小了約98.5%（Roger et al.， 2017）?；蚪M尺寸的縮小削弱了線粒體蛋白編碼能力，在植物線粒體內的1 000～2 000種蛋白質中，僅有少數(shù)蛋白由線粒體基因組編碼（Robles et al.， 2012; Murcha et al.， 2014）。例如，在硬葉兜蘭（Paphiopedilum micranthum）的線粒體基因組中僅有39個蛋白質編碼基因（Yang et al.， 2023）。大量的基因轉移與丟失使得線粒體的遺傳自主性降低，生命活動受到細胞核的深度調控。線粒體與細胞核間的調控主要由兩部分組成：一種是細胞響應外部刺激，調節(jié)細胞核和線粒體基因的表達，使線粒體能夠合成和募集相關蛋白，從而調節(jié)線粒體的生命活動；另一種是線粒體受到刺激后能夠向細胞核傳遞信號，細胞核對線粒體的狀態(tài)變化做出反應，通過一系列線粒體應激反應來抑制線粒體異變，從而維持細胞穩(wěn)態(tài)，這一過程也被稱為逆行調節(jié)（Ryan amp; Hoogenraad， 2007; Khan et al.， 2024）。

核質互作深刻影響了植物的生命活動，線粒體基因組內的CMS基因控制花粉敗育，而細胞核基因組內的育性恢復（restorer of fertility， Rf）基因又能夠消除或減弱CMS基因的影響，保證花粉正常發(fā)育（Chen amp; Liu， 2014）。雄配子育性可控這一特性使得CMS材料在作物雜交制種中有著重要意義。不同品系物種雜交產(chǎn)生的后代可以在產(chǎn)量、抗性等農(nóng)藝性狀上優(yōu)于任一親本，這種現(xiàn)象被稱為雜種優(yōu)勢（heterosis 或 hybrid vigor）（裴虎等，2022）。利用雜交種的雜種優(yōu)勢，水稻（Oryza sativa）產(chǎn)量相比自交系可以提升10%～20%（Luo et al.， 2013）。然而，雜種優(yōu)勢表現(xiàn)更強的玉米在產(chǎn)量等重要性狀上中親優(yōu)勢率可以達到35%～40%（魏鋒等，2022）。在雜交制種的過程中需要去除母本雄蕊防止自交，而利用CMS材料做母本可以有效節(jié)省人工去雄的人力成本，提高制種效率和制種質量。同時相較于化學殺雄的方式，利用CMS材料不僅可以提高雜交種的純度，還能夠避免在去雄過程中對作物和環(huán)境造成損害。利用CMS基因和Rf基因配置出雜交制種的“三系”（不育系、恢復系、保持系），通過設計“三系”間的雜交組合，在雜交制種的同時保證“三系”的傳代，這一體系在雜交種的規(guī)?；a(chǎn)中起到了至關重要的作用。

目前，在全球的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，一半以上的水稻、玉米在使用雜交種進行生產(chǎn)，在我國蔬菜品種中雜交種的占比較高，為80%～90%（劉增兵等，2019）。因此，對CMS材料背后的作用機制展開研究有助于在更多物種中利用雜種優(yōu)勢更好地增產(chǎn)。本文對植物CMS基因以及不育系的表型與機理進行綜述，結合細胞代謝等領域的研究探討了當前不育分子機制模型的合理性，并對未來CMS研究方向進行了展望。旨在為今后深入研究CMS分子機制提供參考，推動CMS在雜種優(yōu)勢中的利用和核質互作中的研究。

1 CMS基因進化與克隆

1.1 線粒體基因組與CMS基因進化

大多數(shù)植物的線粒體基因組遵循母系遺傳，這一特性使其很少發(fā)生個體間的基因交流（Camus et al.， 2022）。在這種情況下，線粒體一方面要保證基因序列的高度保守，另一方面要盡可能消除基因組內的有害突變，從而保證子代線粒體功能正常（Broz et al.， 2022）。研究表明，線粒體能夠通過內部同源重組系統(tǒng)清除突變序列（Chevigny et al.， 2020）。然而，重組系統(tǒng)也導致線粒體基因組的序列容易發(fā)生重排，因而線粒體基因組兼具序列高度保守和結構變化迅速兩個特點，這也被稱為“線粒體進化悖論”（mitochondrial evolution paradox）（Chevigny et al.， 2020; Christensen， 2021; Kan et al.， 2022）。

在線粒體基因組頻繁重組過程中，不同序列片段隨機組合形成嵌合序列，在這一過程中可能形成新的ORF，部分ORF能夠與細胞核基因組互作引起雄配子敗育，這些ORF即為CMS基因。因此，CMS基因序列呈現(xiàn)明顯的重組特征，有學者分析了來自13種作物的28種CMS基因，發(fā)現(xiàn)這些基因全部是嵌合基因，并且CMS基因中嵌合了線粒體功能基因的序列（Chen amp; Liu， 2014）。由于線粒體基因組遺傳自主性較低，其序列重組過程在很大程度上受到了核基因組的調控。研究人員在植物核基因組中定位到多種積極阻止細胞器基因組有害重組的基因，其中包括了MutS homologue 1（MSH1）、RecA-like recombinases（RECA）以及兩個植物特異性單鏈DNA（ssDNA）結合蛋白家族［Organellar ssDNA-binding proteins（OSBs）和Whirlies（WHYs）］（Maréchal amp; Brisson， 2010）。有研究表明，MSH1作為抑制線粒體基因組異位重組的重要基因，其突變會導致葉綠體和線粒體基因組的重組活躍、序列突變增加以及亞化學計量偏移（substoichiometric shifting， SSS）變化增大（Wu et al.， 2020; Zou et al.， 2022; Xu et al.， 2022）。在芥菜（Brassica juncea）（Zhao et al.， 2016），高粱（Sorghum bicolor）、粟（Setaria italica）和大豆（Glycine max）（Arrieta-Montiel amp; Mackenzie， 2011），煙草（Nicotiana tabacum）和番茄（Solanum lycopersicum）（Sandhu et al.， 2007）中通過RNAi技術沉默MSH1表達后，檢測到了線粒體基因組的SSS現(xiàn)象和CMS現(xiàn)象。干擾OSB1和RECA后雖然也檢測到線粒體重排或SSS現(xiàn)象，但并沒有研究報道在突變體中觀察到CMS現(xiàn)象。

研究表明，CMS基因形成需要經(jīng)過多輪重組與變異。Tang等（2017）對808個野生稻和栽培稻線粒體基因組進行分析，提出了水稻CMS-WA型不育系CMS基因WA352可能的進化路線（圖1）。Tang等（2017）認為WA352的進化起源于稻屬祖先的RPL5/COX1/ORF284結構，在線粒體基因組頻繁重組中這一結構不斷被打斷并與其他序列拼接形成嵌合序列。在祖先種和近緣種的線粒體基因組中定位到多種與WA352基因具有相似片段的類WA352嵌合序列，這些過渡形態(tài)的嵌合序列分布在栽培稻及其野生近緣種的線粒體基因組中，但不會引起花粉的敗育（Tang et al.， 2017）。嵌合序列在頻繁重組中還伴隨著核苷酸的變異，經(jīng)過頻繁重組與多次變異逐步形成新的功能基因。基于此，Tang等（2017）提出了CMS基因的進化模型，其中涉及多重重組，原基因（protogene）的形成以及功能化等過程。

1.2 CMS材料創(chuàng)制簡述

CMS現(xiàn)象廣泛存在于植物界中，野生植株和栽培植株均能自發(fā)形成CMS基因，但通常情況下植物核基因組中存在Rf基因，因而不會出現(xiàn)雄蕊敗育現(xiàn)象（Chen amp; Liu， 2014）。在CMS材料的創(chuàng)制中，一方面可以通過大規(guī)模篩選調查，尋找核基因組中不存在Rf基因的個體。例如，1964—1965年，袁隆平院士在栽培稻群體中篩查了140 000個稻穗，終于在洞庭早秈、勝利秈、矮腳南特和早粳中發(fā)現(xiàn)了6個雄性不育株（朱英國，2016）。此外，水稻的野敗型（CMS-WA）、矮敗型（CMS-DA）和馬協(xié)型（CMS-MX）等多種常用CMS材料都是在野生群體或栽培群體的田間篩查中被發(fā)現(xiàn)。另一方面通過設計雜交組合能夠將CMS基因引入近緣種，隨后連續(xù)回交剔除Rf基因，從而獲得CMS材料。Christov Michail的團隊在向日葵（Helianthus annuus）及其近緣種間通過雜交獲取到15種CMS材料（Michail， 2012）。綜上所述，大規(guī)模篩選和有規(guī)劃的種間雜交是獲取CMS材料的主要手段。

綜合CMS基因產(chǎn)生的機理與CMS/Rf系統(tǒng)，獲取CMS個體有兩個要點：（1）要盡可能提高篩選群體中出現(xiàn)CMS基因的期望；（2）在引入含有CMS基因的胞質后需要在后代中分離核基因組內的Rf基因。通過連續(xù)回交替換非輪回親本核基因組的方式可以穩(wěn)定分離Rf基因，而增加群體中線粒體基因組中出現(xiàn)CMS基因的期望有很多種方法?？傮w而言分為兩種途徑：一種途徑是在不改變線粒體基因組突變率和重組率的基礎上大規(guī)模擴大調查群體增加出現(xiàn)CMS基因的概率［野敗型（CMS-WA）、矮敗型（CMS-DA）、馬協(xié)型（CMS-MX）等多種不育系都是在野生群體和栽培群體的調查中被發(fā)現(xiàn)］；另一種途徑是群體數(shù)量相對穩(wěn)定的情況下，通過改變線粒體基因組的重組率和突變率增加群體內出現(xiàn)CMS基因的期望。

隨著技術的進步和CMS機制研究的深入，育種家開發(fā)了一系列加速線粒體基因組進化的方法，這些方法有效提高了獲取CMS材料的速度，具體如下：

（1）體細胞融合：當親緣關系較遠的個體間無法通過人工授粉完成雜交時會采用體細胞融合的方式來實現(xiàn)基因交流。這種方式不但可以強制引入遠緣物種的高異質性線粒體基因組，而且在細胞融合過程中還可能出現(xiàn)染色體消除和線粒體基因組高頻重排（Liu et al.， 2005），可以同時實現(xiàn)CMS基因的產(chǎn)生和Rf基因的丟失。

（2）理化誘變：誘變育種可以通過理化手段（例如堿基類似物、射線照射）破壞細胞內所有遺傳系統(tǒng)的DNA序列，產(chǎn)生大量的雙鏈斷裂和錯配現(xiàn)象。因此，序列修復的過程會引起線粒體的重排和序列的變異。通過后代的雜交和篩選可以選育出CMS材料（王乃元等，2005）。

（3）核調控干涉：隨著線粒體基因組及核質互作研究的深入，育種可以通過調節(jié)核基因組影響線粒體基因組的重排，從而創(chuàng)制出新的CMS材料。例如，Sally團隊通過沉默芥菜中MSH1（MutS HOMOLOG 1）基因降低線粒體基因組的穩(wěn)定性，成功創(chuàng)制CMS材料（Zhao et al.， 2016）。

從成本高周期長的田間篩選到各種生物技術的應用，CMS材料的創(chuàng)制手段隨著CMS現(xiàn)象研究的深入不斷改良，獲取CMS材料的難度也在不斷下降。

1.3 CMS基因挖掘與克隆現(xiàn)狀

迄今已在超過150種植物中發(fā)現(xiàn)了CMS現(xiàn)象，部分物種（例如水稻、油菜）甚至發(fā)現(xiàn)了不止一種CMS材料。CMS基因的序列和嵌合結構決定了CMS材料的不育機制與生理特性，是劃分不同CMS材料的根本依據(jù)（表1）。對于未完成CMS基因鑒定的不育材料，通常以不育材料的育性恢復和育性保持關系作為劃分依據(jù)（Laughnan amp; Gabay-Laughnan， 1983）。為了方便對材料進行交流與研究，開發(fā)者會根據(jù)CMS材料的特征為其命名。例如，水稻CMS-TAA型不育系（也稱CMS-TA）是由菲律賓秈稻品種‘Tadukan’與粳稻‘臺中65’雜交后連續(xù)回交產(chǎn)生，基于親本品種‘Tadukan’縮寫為TAA或者TA（Takatsuka et al.， 2022）。胡蘿卜（Daucus carota）的CMS-Carpeloid和CMS-Petaloid兩種材料根據(jù)花器官的敗育特征命名（Linke et al.， 2003）。

篩選鑒定CMS材料的不育基因，不僅能方便育種家區(qū)分不同的CMS類型，還可加深研究者對CMS現(xiàn)象的理解，從而更好地利用CMS材料開展研究。在早期CMS研究中，為確定不育系中的CMS基因，往往通過RNA印跡尋找不育系異常轉錄本（Luo et al.， 2013）。隨著高通量測序技術以及線粒體基因組組裝技術的發(fā)展，當前主要利用多組學的比較分析來篩選CMS候選基因。通過比對不育系與相應保持系或恢復系間在轉錄組、蛋白質組間的差異，結合線粒體基因組結構上的區(qū)別篩選候選CMS基因。

候選CMS基因需要通過敲除或轉化實驗驗證其功能。由于此前缺少將基因片段導入線粒體基因組的可靠手段，因此研究人員會將線粒體定位信號（mitochondrial targeting signal， MTS）與候選基因片段連接在一起構建載體，驗證基因片段在細胞核中表達后轉運到線粒體內，通過觀察轉化后的植株育性變化來驗證候選基因是否為CMS基因。該策略成功地分析了水稻CMS-BT型不育系的ORF79（Wang et al.， 2006）、芥菜CMS-Hau型不育系的ORF288（Jing et al.， 2012）、水稻CMS-WA型不育材料的WA352（Luo et al.， 2013）、甜菜（Beta vulgaris）CMS-I-12型不育系的ORF129（Yamamoto et al.， 2008）和辣椒（Capsicum annuum）不育系的ORF456（Kim et al.， 2007）、芥菜不育系的ORF220（Yang et al.， 2010）、玉米CMS-C型不育系的ATP6c（Yang et al.， 2022）等不育系基因的功能。近年來，緊湊型TALENs（compact TALEN， cTALENs）技術的發(fā)展使得線粒體基因組編輯成為可能，利用cTALENs與MTS結構結合可以對線粒體基因組中的序列直接進行敲除（Beurdeley et al.， 2013; Kazama et al.， 2019）。相對于利用MTS將細胞核內表達產(chǎn)物轉入線粒體的方式，靶向敲除方式更有說服力。Shin-ichi Arimura團隊利用這種技術先后驗證了番茄CMS-P型不育系的ORF137（Kuwabara et al.， 2022）、水稻CMS-RT102型不育系的ORF352（Omukai et al.， 2021）、水稻CMS-BT型不育系的ORF79和甘藍型油菜（Brassica napus）CMS-Kosena型不育系的ORF125（Kazama et al.， 2019）。

2 CMS材料的表型與生理特點

在植物進入生殖生長期后，其形態(tài)、細胞學特征、生理生化參數(shù)均在發(fā)生顯著變化。本文中所有涉及的植物可觀測性狀將統(tǒng)一定義為表型并進行討論。通常，植物在進入生殖生長期后，代謝活動顯著增強，主要表現(xiàn)為物質合成增加和能量代謝速率提升，以支持花器官的發(fā)育和種子形成所需的物質基礎和能量供應。大量有關不育系表型的研究表明，不育系與可育系在雄蕊形態(tài)、物質能量代謝、激素水平等方面都存在顯著的表型差異。

2.1 雄蕊形態(tài)與細胞學行為異常

雄蕊退化、花粉敗育是CMS材料最典型的性狀，例如甘藍CMS-Ogu型不育系相比于可育品系表現(xiàn)出花絲纖細、花藥萎縮的表型（Chen et al.， 2023）。雄性不育根據(jù)雄蕊敗育分為4種類型：雄蕊無典型花藥花絲結構，甚至完全退化；花藥畸形無內容物；花藥外形正常但內部花粉畸形；花粉粒外形正常但無內容物，缺少萌發(fā)活力（范彥君等，2016；Mo et al.， 2023）。部分CMS材料的雄蕊在表型上沒有明顯變化，如水稻CMS-Tetep型不育材料的花藥在大部分生育期內表現(xiàn)都正常，甚至花藥內還具有活性的花粉，但花藥開裂異常導致其產(chǎn)生CMS現(xiàn)象（Lee et al.， 2022）。除雄蕊表型以外，在花粉發(fā)育過程中起關鍵作用的絨氈層細胞也在多種CMS材料中檢測到了異常的細胞學特征。在甘藍型油菜和野甘藍（Brassica oleracea）的CMS材料中發(fā)現(xiàn)，絨氈層細胞在解體前常常會出現(xiàn)細胞過度膨大和液泡化現(xiàn)象，擠壓內部小孢子，從而導致小孢子發(fā)育異常花粉敗育（Xing et al.， 2022; Chen et al.， 2023）。

2.2 物質和能量代謝降低

研究者們利用多種手段對比不育系和可育系的代謝強度，不同研究指標均表明不育系代謝強度顯著低于可育系。Chen等（2019）對花粉發(fā)育過程中絨氈層細胞進行3D成像，發(fā)現(xiàn)該細胞內線粒體出現(xiàn)體積增大和密度顯著增加等現(xiàn)象。這表明花粉發(fā)育是一個高度耗能的過程。關于ATP含量的研究表明，在玉米（Yang et al.， 2022）、油菜（Xing et al.， 2022）、大豆（Bai et al.， 2022）和煙草（Mo et al.， 2023）等物種的不育系中，雄蕊ATP含量顯著低于可育系。Mo等（2023）在煙草丙酮酸含量的研究中發(fā)現(xiàn)，不育系雄蕊的丙酮酸含量同樣低于可育系。除直接參與能量代謝的物質以外，多種呼吸作用的相關酶（如ATP合酶、細胞色素c氧化酶）的活性在不育系中也呈下降趨勢（侯建華等，2003）。Wang等（2023）在大豆不育系中發(fā)現(xiàn)ATP合酶等基因的表達出現(xiàn)下調。這些證據(jù)表明，不育系雄蕊的能量代謝受到了多種層次的抑制。

除了能量供給，物質合成對保障花粉的發(fā)育同樣重要。在玉米花藥組織物質代謝的研究中發(fā)現(xiàn)，在不育系小孢子發(fā)育的整個過程中，花藥組織的淀粉、可溶性糖、可溶性蛋白質、脯氨酸含量以及淀粉酶活性均顯著低于可育系（夏濤和劉紀麟，1993）。前人在油菜和水稻不育系中進行了類似的研究，結果表明雄蕊中糖類、蛋白質等結構物質或營養(yǎng)物質含量偏低，相關酶活性低于可育系（莊榮福和黃厚哲，1987; Xing et al.， 2022）。物質代謝的減弱可能進一步加劇了花粉能量供應不足，同時還阻礙了花粉母細胞和絨氈層細胞的正常生命活動。

2.3 活性氧濃度偏高

在氧化磷酸化（oxidative phosphorylation， OXPHOS）過程中，線粒體電子傳遞鏈（mitochondrial electron transfer chain， mETC）傳遞的電子可以提前與O2結合生成超氧陰離子（O2-·）或單線態(tài)氧（1O2）（Mailloux et al.， 2013）。正常情況下，呼吸作用消耗的O2有0.2%～2.0%以活性氧（reactive oxygen species， ROS）的形式排放（Balaban et al.， 2005）。這些ROS會作為生長發(fā)育的調節(jié)信號參與植物生命活動，并在傳遞信號后由超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）和過氧化物酶（peroxidase， POD）等構成的抗氧化系統(tǒng)快速降解（Shadel amp; Horvath， 2015; Waszczak et al.， 2018）。然而，當呼吸速率減慢、ATP合成受阻時，產(chǎn)生ROS的速率會快速提高（Huang et al.， 2016）。不育系ROS含量相關研究表明，在不育系中ROS含量偏高，細胞內出現(xiàn)被ROS破壞的跡象。

前人在油菜和玉米中的雄蕊中檢測到不育系的O2-·含量顯著高于恢復系或保持系，同時不育系中丙二醛（malondialdehyde， MDA）含量也高于恢復系和保持系（Xing et al.， 2022; Yang et al.， 2022）。由此可見，不育系中ROS的含量已經(jīng)超出抗氧化系統(tǒng)消除的閾值，并且生物膜系統(tǒng)已經(jīng)受到ROS的損傷。通常情況下，細胞內的O2-·會在SOD的催化下歧化為H2O2，再由抗氧化酶（如POD）催化生成H2O（趙晶晶等，2022）。在油菜不育系中，H2O2含量顯著低于可育系但MDA的含量卻顯著高于可育花藥，而且其中的SOD和POD均不如保持系（Xing et al.， 2022），這說明在不育系中還存在著ROS代謝異常的現(xiàn)象。推測在油菜不育系中ROS均以超氧陰離子的形態(tài)存在，ROS的代謝受阻，SOD和POD的活性并沒有提高，ROS損傷細胞膜，MDA含量升高。Bai等（2022）在大豆不育系中的分析發(fā)現(xiàn)，與ROS代謝相關的基因存在差異化表達?？傮w而言，不育系的花藥組織相對于可育系的花藥受到了更多的來自ROS的脅迫。ROS增加可能引發(fā)氧化應激，對細胞結構和功能產(chǎn)生不利影響，這將進一步加劇細胞能量困境。

2.4 激素水平異常

植物花器官發(fā)育會受到多種植物激素調控，通過調節(jié)某些激素的含量能夠引起花器官發(fā)育的異常。有研究表明通過外源添加細胞分裂素（cytokinin， CTK）可以改變花器官性別（Champault， 1973）。Li等（2023）通過影響茉莉酸（jasmonic acid， JA）含量改變了棉花花粉的育性。Browse（2009）將JA合成和信號相關基因突變后發(fā)現(xiàn)在后代中出現(xiàn)花絲過短、花藥不開裂、花藥無活性、花粉管生長不良等不育表型，并且這些不育表型可以通過外源施加JA逆轉。這些研究說明植物激素調節(jié)與雄蕊發(fā)育之間同樣存在密切聯(lián)系，激素水平差異可能也是CMS材料雄蕊敗育的誘因。

在植物中多種激素信號相互作用形成復雜信號網(wǎng)絡，這一網(wǎng)絡在不同物種、不同時空條件下表現(xiàn)出不同特征，因而研究不同物種間同種植物激素的“三系”間差異并未得到一致的結論。例如，脫落酸（abscisic acid， ABA）在甘藍型油菜的CMS-Pol、CMS-Nsa和CMS-Ogu 3種不育系的各階段含量均高于可育系（Ding et al.， 2018）。然而在沙梨（Pyrus pyrifolia）的“新高”不育系中，ABA在單核花粉早期和單核花粉晚期高于可育系，其他時期則低于可育系（李六林等，2006）。此外，由于在不同的不育系中引起花藥敗育的分子機制存在差異，即使是在同一物種的不同“三系”間，同種植物激素的差異并不完全相同。例如，在甘藍型油菜的CMS-Pol、CMS-Nsa和CMS-Ogu 3種不育系中，同樣是在花芽發(fā)育早期，僅有CMS-Nsa 1種不育系在IAA含量上與保持系有顯著性差異，其他2種不育系均未檢測到顯著性差異。在花芽發(fā)育后期，盡管3種不育系的IAA含量均低于保持系，但不同不育系與保持系在IAA含量上差異的顯著性也不相同（Ding et al.， 2018）。

雖然現(xiàn)有研究已經(jīng)證實植物激素水平差異與CMS現(xiàn)象存在密切聯(lián)系，但目前對于“三系”間激素水平差異的探究仍處于相對初級的階段。尤其是針對植物激素調控網(wǎng)絡差異的深入研究尚顯不足。

3 CMS基因作用機制假說

當前大量CMS基因得到了克隆和定位，然而對于CMS現(xiàn)象分子機制的深入解析卻僅限于少數(shù)農(nóng)作物（如水稻、玉米等）?；贑MS材料相關研究，以下4種分子機制模型得到了較多的認可，即細胞毒素模型 （cytotoxicity model）、 細胞異常凋亡圖片未按比例繪制，引用修改自Tang等（2017）模型（aberrant programmed cell death model）、能量缺乏模型（energy deficiency model）及逆行調節(jié)模型（retrograde regulation model）（Chen amp; Liu， 2014; Heng et al.， 2018）。

3.1 細胞毒素模型

細胞毒素模型認為CMS蛋白屬于毒性蛋白，CMS蛋白可以通過破壞細胞結構特異性影響雄蕊的某些細胞，從而引起花粉敗育（圖 2）（Levings， 1993; Chen amp; Liu， 2014）。在玉米CMS-T型不育系URF13基因的研究中發(fā)現(xiàn)，原核生物（大腸桿菌）和真核生物（酵母、草地貪夜蛾幼蟲細胞、粉紋夜蛾幼蟲）在表達URF13后表現(xiàn)出不同程度的生長抑制（Dewey et al.， 1988; Huang et al.， 1990; Korth amp; Levings， 1993）。除玉米以外，向日葵的ORF522基因（Nakai et al.， 1995）、水稻CMS-BT型不育系的ORF79基因（Wang et al.， 2006）、芥菜CMS-Hau型不育系的ORF288基因（Jing et al.， 2012）在轉化后均對大腸桿菌生長表現(xiàn)出不同程度的抑制。然而，目前還沒有研究報道在雄蕊中成功檢測或分離出“雄蕊特異性毒素”。細胞毒素模型的另一理論依據(jù)是在多種CMS蛋白中發(fā)現(xiàn)了跨膜結構，這一結構通常出現(xiàn)在毒性蛋白中。但是，在水稻CMS-WA型不育系和芥菜CMS-Hau型不育系的CMS蛋白研究中發(fā)現(xiàn)，將跨膜結構去除后的截短CMS蛋白仍然可以造成花粉敗育（Luo et al.， 2013; Heng et al.， 2018）。另外，將芥菜CMS-Hau型不育系的CMS基因截為多個片段并轉化后發(fā)現(xiàn)，僅具有跨膜結構的片段對大腸桿菌生長表現(xiàn)出細胞毒性，跨膜片段編碼序列轉化到擬南芥（Arabidopsis thaliana）后沒有導致花粉敗育，而不含跨膜片段的編碼序列導致轉化后的擬南芥出現(xiàn)花粉敗育現(xiàn)象（Heng et al.， 2018）。另外，在水稻CMS-Tetep型不育系中，雖然ORF312基因轉化到大腸桿菌后表現(xiàn)出細胞毒性，但不育系的花藥可以產(chǎn)生成熟花粉（Lee et al.， 2022）。上述研究表明，細胞毒性與花粉活力之間沒有必然聯(lián)系。

根據(jù)上述研究，細胞毒素模型有一定的說服力，但該模型對CMS分子機制的解釋相對片面?；诂F(xiàn)有研究，細胞毒素模型缺乏直接性實驗證據(jù)，如果能分離或檢測到“雄蕊特異性毒素”將大幅度提高這一模型的說服力，細胞毒素模型還需要在未來的研究中進一步完善。

3.2 細胞異常凋亡模型

細胞程序性死亡（programmed cell death， PCD）又稱凋亡，主要指細胞在受到脅迫、損傷時或在生命周期特定階段由特定信號分子（包括ROS、一氧化氮、乙烯等）介導的細胞有序裂解過程（Breusegem amp; Dat， 2006）。細胞異常凋亡模型認為，雄蕊中凋亡信號分子（主要是ROS）作用階段異常，導致花粉發(fā)育關鍵細胞異常凋亡，從而引起花粉的敗育（圖2）。絨氈層細胞作為花粉發(fā)育的關鍵細胞，在調控花粉發(fā)育進程、保護花粉母細胞和花粉壁形成等方面扮演著重要角色，絨氈層細胞凋亡時間過早或過晚都會引起花粉敗育。研究表明，不育系中存在絨氈層細胞異常凋亡以及ROS異常積累的現(xiàn)象，如在水稻CMS-WA型不育系中，WA352蛋白聚集在絨氈層細胞中抑制COX2的功能，導致過氧化物代謝異常和ROS積累，繼而引發(fā)絨氈層異常凋亡和花粉敗育（Luo et al.， 2013）。玉米CMS-C型不育系中同樣存在ROS異常積累以及絨氈層細胞異常凋亡現(xiàn)象（Yang et al.， 2022）。

當前在多種不育系中發(fā)現(xiàn)了絨氈層細胞異常凋亡的現(xiàn)象，這些證據(jù)有力地證明了細胞異常凋亡模型。盡管細胞異常凋亡模型還無法解釋所有CMS現(xiàn)象，但該模型有效地將花粉敗育與呼吸作用異常聯(lián)系起來，為不育系CMS分子機制的解析提供了研究方向。

3.3 能量缺乏模型

在花粉發(fā)育過程中，花藥呼吸速度和花藥組織的線粒體數(shù)量都遠多于葉組織，這些現(xiàn)象表明花粉發(fā)育過程需要消耗更多的ATP（Lee amp; Warmke， 1979; Chen et al.， 2019）。能量缺乏模型認為，CMS蛋白能夠影響線粒體功能從而導致能量代謝紊亂和能量供應不足，進而導致花粉發(fā)育受阻并引起花粉敗育（圖2）。

能量缺乏模型得到了多種實驗證據(jù)的支撐。例如，多種呼吸突變體出現(xiàn)了花粉敗育表型（Hernould et al.， 1993; Heiser et al.， 1997）；Liu的團隊將苧麻（Boehmeria nivea）ATP9基因對應的RNAi沉默載體轉入煙草，每株轉化煙草均有約50%的花粉不育（Liu amp; Yang， 2020）；Geisler等（2012）利用T-DNA插入技術破壞細胞核內編碼ATP合酶δ亞基的基因，在突變體中也出現(xiàn)了花粉部分敗育的現(xiàn)象。此外，在擬南芥（León et al.， 2007; Li et al.， 2010; Busi et al.， 2011）、馬鈴薯（Solanum tuberosum）（Heiser et al.， 1997）、小麥（Hernould et al.， 1993）和煙草（Liu amp; Yang， 2020）的呼吸突變體中也觀察到類似的現(xiàn)象，這說明通過破壞呼吸鏈影響ATP合成可以引起花粉敗育。此外，大多數(shù)CMS基因中嵌合了與mETC途徑相關的基因片段，CMS蛋白可能與mETC相關的復合物互作影響正常呼吸作用，通過影響ATP合成引起花粉敗育（Chen amp; Liu， 2014）。例如，在水稻CMS-HL不育系中，CMS基因ORFH79編碼的蛋白與mETC復合物Ⅲ的p61亞基相互作用，導致ATP和NADH含量降低（Wang et al.， 2013），并降低復合物V的數(shù)量和活性（Zhang et al.， 2007; Liu et al.， 2012）。向日葵CMS基因ORF522編碼的蛋白與ATP合酶相互作用，降低其活性從而減少花藥中ATP的合成（Sabar et al.， 2003）。另外，含有跨膜結構的CMS蛋白可能會通過影響膜兩側的電化學勢來影響ATP合成，如玉米CMS-T不育系的URF13蛋白（Rhoads et al.， 1995）和油菜CMS-Ogu不育系的ORF138蛋白（Duroc et al.， 2005）都可以在線粒體內膜上形成孔道結構。有學者提出質子可通過該孔泄漏降低膜兩側的質子電化學勢，從而導致ATP合成減少（Rhoads et al.， 1995; Duroc et al.， 2009）。

能量缺乏模型得到了較多證據(jù)的支持，然而該模型仍然存在一定的局限性。第一， 在呼吸突變體相關的研究中，突變體仍有部分可育花粉產(chǎn)生，這與CMS現(xiàn)象中花粉完全敗育的表型存在差異（Meyer et al.， 2009; Geisler et al.， 2012; Touzet amp; Meyer， 2014）。第二，該模型的證據(jù)以間接證據(jù)和推論為主，基于現(xiàn)有研究還無法確定能量供應下降與CMS現(xiàn)象間是否存在因果關系。如果能證明外源增加ATP供應會恢復不育系的花粉育性將進一步提高這一模型的說服力。綜上所述，能量缺乏模型仍需更多直接實驗證據(jù)的佐證。

3.4 線粒體逆行調節(jié)模型

線粒體逆行調節(jié)模型認為，線粒體通過影響核基因組的基因表達干涉花粉發(fā)育，從而引起CMS現(xiàn)象（圖3）。研究人員發(fā)現(xiàn)，核基因組的某些基因在不育系與可育系之間存在差異化表達。

Theissen和Saedler（2001）提出了花發(fā)育的ABCDE模型，這一模型認為MADS-box轉錄因子對花器官發(fā)育的不同結構和階段均起到重要作用，其中B類基因和C類基因與雄蕊發(fā)育相關。Linke等（2003）在胡蘿卜的CMS-Petaloid型與CMS-Carpeloid型不育系中發(fā)現(xiàn)，線粒體逆行信號通過調節(jié)MADS-box轉錄因子的表達影響B(tài)類基因和C類基因的表達，導致雄蕊呈心皮化、花瓣化，從而引起CMS現(xiàn)象（圖3：）。另外，Zhang等（2021）在大豆CMS-RN型不育系中發(fā)現(xiàn)miRNA169存在差異表達。由于miRNA169能夠調控MADS-box基因表達，因此研究人員推測miRNA169可能與大豆CMS-RN型不育系的CMS現(xiàn)象有關。

在水稻CMS-CW型不育系中，rf17基因受到逆行信號調節(jié)表達上調，rf17編碼的蛋白表達增加后會抑制花粉萌發(fā)，從而導致花粉敗育（Fujii amp; Toriyama， 2009）。在恢復系中，rf17的等位基因Rf17由于啟動子調控區(qū)突變，不受逆行信號調控，花粉得以正常發(fā)育（圖3）。另外，植物體內與花發(fā)育相關的調控基因也存在差異表達的現(xiàn)象。

一方面，當前支持線粒體逆行調節(jié)模型的直接證據(jù)仍然有限；另一方面，由于線粒體逆行信號調節(jié)涉及的通路較多，不同的實驗證據(jù)所涉及的通路并不一致。因此，線粒體逆行調節(jié)模型可以認為是對一類CMS分子機制的概述。這一模型為CMS研究提供了另一方向，即通過分析核基因組表達來解釋CMS現(xiàn)象的機制。

3.5 CMS分子機制模型評述

當前對于CMS分子機制的研究還不夠深入，僅有少量不育系的分子機制得到了實驗驗證，因而現(xiàn)有分子模型不可避免地存在局限性。

研究表明，絨氈層細胞異常PCD導致玉米CMS-C型不育系花粉敗育，然而不育系的雄蕊還存在ATP含量下降、膜電位差下降等現(xiàn)象，這些現(xiàn)象表明不育系花藥的能量供應下降（Yang et al.， 2022）。另外，ATP6蛋白是FoF1-ATP合酶的重要組成部分，因而筆者推測將ATP6c轉入大腸桿菌或酵母后可能導致能量供給減少和ROS含量上升，進而抑制大腸桿菌或酵母的生長。如果這一推測成立，這一實驗可以作為細胞毒性模型的證據(jù)。上述研究和推論說明，當前不同CMS分子機制模型間缺乏明確的劃分標準，同一種不育系的分子機制能夠利用多種機制模型解釋。

當前尚無一種CMS分子機制模型能夠解釋所有CMS現(xiàn)象?；诂F(xiàn)有研究推測，不同不育系間花粉敗育機制存在較大差異，很難用一種CMS分子機制模型解答所有CMS現(xiàn)象。在現(xiàn)有CMS分子機制模型中，細胞毒素模型、能量缺乏模型和細胞異常凋亡模型的實驗證據(jù)與呼吸通路存在較強關聯(lián)性，而逆行調節(jié)模型的實驗證據(jù)集中于細胞核基因的差異化表達，因此筆者認為不育系CMS分子機制可以根據(jù)主導遺傳系統(tǒng)的不同大致分為線粒體主導型和細胞核主導型。根據(jù)現(xiàn)有研究，線粒體主導型CMS機制主要通過干擾呼吸通路影響造孢細胞向成熟花粉發(fā)育的過程，而細胞核主導型CMS機制主要在線粒體逆行信號的作用下調節(jié)細胞核基因表達，從而干擾花粉萌發(fā)、花器官發(fā)育等過程。

4 總結與展望

在雜交制種領域，CMS材料的應用創(chuàng)造了巨大的經(jīng)濟效益，對保障糧食安全作出了巨大貢獻。除了用于雜交制種，CMS材料對研究雄配子發(fā)育和植物受精作用同樣有重要意義（Chase， 2007）。然而，CMS材料的研究和應用當前仍存在很多問題。主要有（1）CMS基因的篩選和克隆集中在重要農(nóng)作物，大多數(shù)不育系的研究聚焦于禾本科、十字花科和茄科的植物。這對于分析CMS基因在較大物種尺度上的進化較為不利。另外， 在已克隆

CMS基因的不育系中，能夠深入解析CMS機制的不育系少之又少。盡管研究人員提出了一些CMS分子機制的假說，但這些假說受制于當前的研究基礎，均存在一定的局限性。（2）當前對CMS現(xiàn)象的研究相對獨立，不能與呼吸作用、物質代謝、花器官發(fā)育和激素調節(jié)網(wǎng)絡等領域的研究結合。不育系的生理特征缺乏詳細清晰的闡釋，這對CMS現(xiàn)象分子機制模型的構建具有阻礙作用。另外，在生產(chǎn)應用中，多種作物長期依賴某一種或少數(shù)幾種CMS細胞質生產(chǎn)雜交種。由于細胞質遺傳的特殊性，因此同一類型的CMS品系遺傳背景較為單一，應對病蟲害的能力較弱。1969年，因URF13基因編碼的蛋白而導致玉米對玉米小斑病菌（Bipolaris maydis）T型小種異常敏感，加之美國南部大面積連片種植了CMS-T型玉米，玉米葉斑病在美國南部迅速蔓延，帶來了巨額的經(jīng)濟損失（Levings，1993）。因此，在雜交種生產(chǎn)中要注重CMS細胞質多樣化，這對增加CMS群體的遺傳復雜性從而對抗?jié)撛诘牟∠x害有著重要意義。

近年來隨著各種新技術的誕生和應用，CMS領域的研究也進入快車道。新的測序技術以及細胞器組裝技術可以幫助我們更加精準地比較細胞器基因組間序列的差異，通過構建泛基因組可以協(xié)助對CMS基因中嵌合序列的溯源，減少其中未知來源序列的比例。然而，轉錄組、蛋白組為代表的多組學手段對CMS基因挖掘起著不可忽視的作用，利用這些手段不僅可以更為高效地挖掘線粒體基因組中可能引發(fā)CMS現(xiàn)象的ORF。靶向線粒體的TALEN技術（mitochondrial-targeted TALEN， MitoTALEN）對CMS基因的直接編輯填補了線粒體內序列編輯的空白。Mito-TALEN技術不僅可以幫助我們更直接操作線粒體基因組敲除候選的CMS基因進行驗證，也讓研究人員對CMS基因的研究有了更多的可能。

CMS現(xiàn)象是研究核質互作的重要模型，同時對核質互作的研究加深了對CMS現(xiàn)象的理解。隨著線粒體基因組復制、重組、修復（replicate，recombine，repair，也稱RRR基因）相關基因研究的不斷深入，細胞核對線粒體序列變化的調控也在被不斷揭示。核質互作領域的研究不僅有助于深入解析線粒體基因組的重組機制，而且還為通過調控核基因表達影響CMS基因進化提供了理論基礎。這將為雜交種的生產(chǎn)提供更為豐富的CMS種質資源，相信不斷涌現(xiàn)的新技術和不斷揭示的新機制可為植物CMS現(xiàn)象的研究提供更多的參考。隨著對CMS現(xiàn)象研究的不斷深入，CMS材料能夠更好地用于生產(chǎn)和研究中。

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（責任編輯 周翠鳴）

基金項目：" 國家自然科學基金（32170238）； 廣東省“珠江人才計劃”青年拔尖計劃支持（2021QN02N792）。

第一作者： 王雪松（1998—），碩士研究生，主要從事植物細胞質雄性不育研究，（E-mail）wrah66@163.com。

*通信作者：" 武志強，博士，研究員，主要從事植物細胞器基因組研究，（E-mail）wuzhiqiang@caas.cn。