六堡茶群體種葉綠體基因組捕獲歷史與遺傳多樣性研究

摘 要：" 六堡茶群體種（Camellia sinensis var. sinensis" ‘Liupao’）是制作六堡茶的主要原材料植物。為探索六堡茶群體種的遺傳背景，特別是其系統(tǒng)發(fā)育和演化歷史，該文對27份六堡茶群體種和5份突肋茶開展了淺層基因組和轉(zhuǎn)錄組測序，并進(jìn)行了六堡茶群體種的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、分歧進(jìn)化時(shí)間及遺傳多樣性分析。結(jié)果表明：（1）在葉綠體樹上，六堡茶群體種樣品被分為距離較遠(yuǎn)的兩組。一組與茶親緣關(guān)系最近，嵌入了主要由茶組成的分支內(nèi)部，分別與不同栽培茶聚在一起；另一組則形成單系分支，與突肋茶親緣關(guān)系最近且嵌入其內(nèi)部。然而，在核基因樹上，六堡茶群體種樣品與栽培茶及山茶屬其他幾個(gè)物種聚為一支，但與突肋茶關(guān)系較遠(yuǎn)。核質(zhì)基因組系統(tǒng)發(fā)育矛盾表明，部分六堡茶群體種的祖先曾與突肋茶發(fā)生過雜交事件，捕獲了突肋茶的葉綠體基因組。（2）分子鐘分析進(jìn)一步表明，該雜交事件發(fā)生在1.55百萬年前的第四紀(jì)時(shí)期，遠(yuǎn)早于人類栽培和制作茶的歷史。（3）基于葉綠體基因組和核基因的遺傳多樣性分析均發(fā)現(xiàn)，六堡茶群體種具有較高的單倍型多樣性，有較大的演化潛力。該研究為六堡茶群體種種質(zhì)資源保護(hù)、品種選育及開發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù)和指導(dǎo)。

關(guān)鍵詞： 六堡茶群體種， 葉綠體基因組， 轉(zhuǎn)錄組， 葉綠體基因組捕獲， 雜交， 遺傳多樣性

中圖分類號：" Q943

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：" A

Chloroplast genome capture history and genetic diversity of Camellia sinensis var. sinensis" ‘Liupao’

YAO Shuting1，2， ZHANG Qiang1， SU Min3， WU Yuting3， PANG Yuelan3，LIANG Yanni4， CAI Aihua1， QIN Xinmei1*

（ 1. Guangxi Key Laboratory of Plant Conservation and Restoration Ecology in Karst Terrain， Guangxi Institute of Botany， Guangxi Zhuang Autonomous Region and Chinese Academy of Sciences， Guilin 541006， Guangxi， China;

2. College of Life Sciences， Guangxi Normal University， Guilin 541004， Guangxi， China;

3. Tea Science and Research Institute， Guangxi Zhuang Autonomous Region，Guilin 541004， Guangxi， China;

4. Wuzhou University， Wuzhou 543002， Guangxi， China ）

Abstract：

Camellia sinensis var. sinensis" ‘Liupao’ is the main raw material for making Liupao tea. To explore the genetic background of C. sinensis var. sinensis" ‘Liupao’， especially its phylogenetic position and evolutionary history， 27 individuals of C. sinensis var. sinensis" ‘Liupao’ and five individuals of C. costata were sampled for genome skimming and transcriptomic sequencing. The phylogenetic relationship， the divergence evolution time， and the genetic diversity of C. sinensis var. sinensis" ‘Liupao’ were analyzed. The results were as follows： （1） On the chloroplast tree， samples of C. sinensis var. sinensis" ‘Liupao’ were divided into two distantly-related groups， one was nested within a clade mainly consisting of C. sinensis， being interspersed among other cultivated C. sinensis， while the other group formed as a well supported lineage that was most closely-related to and nested within C. costata; on the nuclear gene tree， however， all the 27 samples of C. sinensis var. sinensis" ‘Liupao’ formed a clade with other C. sinensis as well as some other Camellia species with generally unresolved relationships among them. Despite the lack of resolution in this clade， it was definitely far separated from C. costata; the cytonuclear phylogenetic conflict suggested once ancient introgression hybridization of C. costata with the ancestor of some C. sinensis var. sinensis" ‘Liupao’ individuals so that the latter captured the chloroplast genome of the former. （2） The time estimate further indicated that the introgression hybridization event occurred in the Quaternary period， ca. 1.55 million years ago， long before the history of tea cultivation and production by humans. （3） In addition， both the chloroplast genomes and nuclear genes revealed that the C. sinensis var. sinensis" ‘Liupao’ had high haplotype diversity， possessing high evolutionary potential. This study" provides the references for the germplasm protection， variety breeding， development and" utilization of C. sinensis var. sinensis" ‘Liupao’.

Key words： Camellia sinensis var. sinensis" ‘Liupao’， chloroplast genomes， transcriptomes， chloroplast genome capture， hybridization， genetic diversity

廣義的茶樹指山茶科（Theaceae）山茶屬（Camellia）茶組（Sect. Thea）植物，而狹義的茶樹則指茶（Camellia sinensis）這一種（含變種、變型等種下等級）植物（楊世雄，2021a）。茶包含了眾多品種或地方種，具有不同的風(fēng)味品質(zhì)。茶的不同品種以及山茶屬其他種類被認(rèn)為存在頻繁的雜交和多倍化，具有復(fù)雜的演化歷史（Huang et al.， 2013；Wang et al.， 2020；Zan et al.， 2023）。例如，山茶（C. japonica）和短柄山茶（C. rusticana）之間能發(fā)生自然雜交（Ueno amp; Tsumura， 2009）。Meegahakumbura等（2016）對392份茶樣品的遺傳分析發(fā)現(xiàn)30%的樣品具有不同類型茶樹的遺傳混合，表明它們?yōu)殡s交起源，其中柬埔寨茶（Cambod tea）就被認(rèn)為是阿薩姆茶（Assam tea）和中國茶（China tea）的雜交品種。李苗苗等（2015）利用核基因微衛(wèi)星標(biāo)記對普洱茶（C. sinensis var. assamica）和大理茶（C. taliensis）進(jìn)行STRUCTURE聚類分析，發(fā)現(xiàn)在混栽的大理茶和普洱茶居群間，存在由大理茶向普洱茶的基因漸滲。Li等（2021）研究發(fā)現(xiàn)武夷菜茶水仙茶樹品種（三倍體）和山茶屬其他4個(gè)物種在trnE-trnT間隔區(qū)具有同樣335 bp的序列缺失，但292份栽培茶都沒有缺失這段。由此推測，該茶樹在三倍化過程中發(fā)生了葉綠體轉(zhuǎn)移，即通過漸滲雜交捕獲了其他物種的葉綠體。雖然葉綠體基因已廣泛應(yīng)用于山茶屬植物系統(tǒng)發(fā)育和遺傳多樣性研究（葉曉倩等， 2014；Li et al.， 2021；閆明慧等，2021），但是葉綠體基因組通常為母系遺傳，單獨(dú)使用無法準(zhǔn)確解析雜交或基因漸滲等網(wǎng)狀演化，而利用核低拷貝直系同源基因序列則已成功解決了許多疑難的系統(tǒng)發(fā)育尤其復(fù)雜的網(wǎng)狀演化問題（Yang et al.， 2015；Wu et al.， 2022；Zan et al.， 2023）。

廣西茶樹種質(zhì)資源極為豐富，根據(jù)閔天祿的茶組分類系統(tǒng)，茶組共包含12種6變種，而廣西有8種，是中國茶組植物資源最豐富的地區(qū)（Ming amp; Bartholomew， 2007；楊世雄，2021b）。廣西也擁有很多歷史悠久的地方品種及名茶（陳宗懋，1992），其中廣西梧州的六堡茶，為中國二十四大名茶之一，以其“紅、濃、陳、醇”及獨(dú)特的檳榔香特點(diǎn)聞名于世（陳佳等，2020）。六堡茶群體種是制作六堡茶的主要原材料。根據(jù)《中國茶樹品種志》中的相關(guān)記載，六堡茶群體種為廣西地方有性系茶樹品種，為中葉種，主要分布在廣西蒼梧、賀縣、蒙山和昭平等地（中國茶樹品種志編寫委員會，2001）。對六堡茶群體種開展的研究主要為形態(tài)特征、資源調(diào)查和開發(fā)利用（陳佳等，2010；邱瑞瑾等，2020；滕翠琴等，2020）以及基于EST-SSR和SSR分子標(biāo)記進(jìn)行的親緣關(guān)系與遺傳多樣性分析（周炎花等，2011；黃厚宸等，2021；王留彬等，2022），而基于序列分析的遺傳背景及遺傳多樣性研究還未見報(bào)道，其起源和演化歷史仍不清楚。值得注意的是，茶組植物中突肋茶（C. costata）的模式產(chǎn)地為廣西昭平縣，與六堡茶群體種分布區(qū)重疊。目前，對突肋茶的研究只限于對廣西昭平縣突肋茶的資源調(diào)查和開發(fā)利用（李朝昌等，2019；龔明壽等，2021），以及貴州地方茶組植物（包含突肋茶）的親緣關(guān)系研究（郭燦等，2021）。六堡茶群體種與突肋茶地理分布重疊，它們之間及其與同組或同屬其他種類間是否存在雜交或基因漸滲尚無研究。

本研究以27份六堡茶群體種和5份突肋茶為實(shí)驗(yàn)材料，通過淺層基因組和轉(zhuǎn)錄組測序，拼接組裝葉綠體基因組并篩選單拷貝核基因，結(jié)合公共數(shù)據(jù)庫中已公布的山茶科相應(yīng)的核苷酸序列，重建六堡茶群體種與其他山茶屬物種間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，估算六堡茶群體種樣品的葉綠體基因組分歧進(jìn)化時(shí)間，并計(jì)算遺傳多樣性指數(shù)，擬探討以下問題：（1）六堡茶群體種的系統(tǒng)發(fā)育位置；（2）六堡茶群體種與其他山茶屬物種是否存在雜交或基因漸滲；（3）六堡茶群體種的遺傳多樣性。六堡茶群體種種質(zhì)資源對促進(jìn)當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)發(fā)展及鄉(xiāng)村振興具有重要意義，本研究可為六堡茶群體種資源保護(hù)、品種選育及開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究使用的27份六堡茶群體種均來源于梧州市，其中12份采自梧州市蒼梧縣六堡鎮(zhèn)石牛村，編號為H1-H12；10份采自梧州市蒼梧縣六堡鎮(zhèn)四柳村，編號為Q13-Q22；5份采自梧州市藤縣大益村馬歐嶺，編號為D1-D5。27份六堡茶群體種葉片多樣性較高，小、中、大葉類均有，綠芽、紫芽、黃白芽均有。另外，還有5份突肋茶采自廣西賀州昭平縣農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所資源圃，編號為T1-T5。選擇無病蟲害、生長狀況良好的新鮮幼嫩葉片用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 DNA、RNA提取和測序

基因組淺層測序和轉(zhuǎn)錄組測序主要委托青島百邁克生物科技有限公司進(jìn)行。32份樣品的總DNA和RNA分別采用CTAB法和天根DP411試劑盒進(jìn)行提取，并檢測其濃度和完整性。使用檢驗(yàn)合格的DNA和RNA構(gòu)建測序文庫，并用Illumina NovaSeq 6000測序儀進(jìn)行雙端測序（PE150 bp）。最終獲得淺層基因組和轉(zhuǎn)錄組原始數(shù)據(jù)，每個(gè)樣分別約為3 Gb和6 Gb。

1.3 數(shù)據(jù)處理

1.3.1 葉綠體基因組的組裝和注釋 對獲得的淺層基因組原始數(shù)據(jù)用Fastp 0.20.1軟件（Chen et al.， 2018）進(jìn)行質(zhì)量控制，去掉接頭和低質(zhì)量的片段（reads）后得到凈化數(shù)據(jù)（clean data），使用GetOrganelle 1.7.5軟件（Jin et al.， 2020）在默認(rèn)參數(shù)設(shè)置下進(jìn)行拼接組裝。以茶（C. sinensis var. sinensis）為參考序列（GenBank登錄號為NC_020019），利用PGA軟件（Qu et al.， 2019）進(jìn)行葉綠體基因組注釋，并使用OGDRAW（https：//chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/OGDraw）繪制葉綠體基因組圖譜。

1.3.2 轉(zhuǎn)錄組拼接和篩選單拷貝核基因 除本研究新獲得的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)以外，我們還從NCBI數(shù)據(jù)庫下載了山茶科26個(gè)物種（38份樣品）的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)（表1），包括1個(gè)大頭茶屬（Polyspora）物種，25個(gè)山茶屬物種。用上述1.3.1中的質(zhì)控方式獲得凈化數(shù)據(jù)，使用Trinity 2.11.0軟件（Haas et al.， 2013）在默認(rèn)參數(shù)設(shè)置下把凈化數(shù)據(jù)從頭組裝成轉(zhuǎn)錄本。使用TransDecoder 5.5.0軟件（Haas et al.， 2013）識別轉(zhuǎn)錄本序列中的候選編碼區(qū)。使用CD-HIT 4.8.1軟件（Fu et al.， 2012）根據(jù)序列的相似度對序列進(jìn)行聚類以去除冗余的序列，序列相似性閾值設(shè)置為0.98。因?yàn)橐恍悠窚y序質(zhì)量不高會影響篩選直系同源基因數(shù)量，所以選擇11個(gè)測序質(zhì)量較高且具有系統(tǒng)發(fā)育代表性的樣品，使用OrthoFinder 2.5.2軟件（Emms amp; Kelly， 2019）搜索出11個(gè)樣品之間的798個(gè)單拷貝核基因（一對一核直系同源基因）。在其余樣品中，使用BLAST++軟件（Wang et al.， 2003）搜索并提取798個(gè)單拷貝核基因?qū)?yīng)的得分最高的同源序列。

1.3.3 序列比對與構(gòu)建系統(tǒng)樹 選取1條組裝好的六堡茶群體種葉綠體基因組序列作為參考序列，

在NBCI上進(jìn)行相似性搜索，下載山茶科77種（含變種）植物的103條葉綠體基因組序列（表2），包含山茶屬76種（含變種），圓籽荷屬（Apterosperma）1種。除茶這一物種共下載29條序列以外，其余每種下載1條序列。使用MAFFT 7.490軟件（Katoh amp; Standley， 2013）對所有序列進(jìn)行比對，再用BioEdit 7.2.5軟件（Hall， 1999）手工調(diào)整。使用MEGA 7.0軟件（Kumar et al.， 2016）計(jì)算葉綠體基因組矩陣的長度、變異位點(diǎn)以及堿基組成頻率。以圓籽荷（A. oblata）為外類群（閆明慧等，2021），基于葉綠體基因組序列，用RAxML 7.2.6軟件（Stamatakis， 2006）中的最大似然法（maximum likelihood， ML）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，堿基替換模型設(shè)定為GTRGAMMA，用隨機(jī)起始樹，矩陣重復(fù)抽樣100次計(jì)算支持率（bootstrap support）。

用MUSCLE 3.8.1軟件（Edgar， 2004）對798個(gè)單拷貝核基因序列分別進(jìn)行比對，之后用自創(chuàng)R包alignmentFilter（Zhang et al.， 2023）過濾比對不可靠區(qū)段，刪除缺失（gap）超過90%的位點(diǎn)，并去掉矩陣中序列長度低于100 bp的序列及矩陣長度低于500 bp的基因，最終獲得689個(gè)基因用于后續(xù)分析。通過PhyloSuite 1.2.2軟件（Zhang et al.， 2020）將689個(gè)核基因進(jìn)行串聯(lián)，計(jì)算串聯(lián)矩陣的長度、變異位點(diǎn)以及堿基組成頻率，并以山茶科四川大頭茶（Polyspora speciosa）為外類群（Wu et al.， 2022）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，方法和參數(shù)設(shè)置與上述相同。

1.3.4 基于核基因的基因流分析 為檢驗(yàn)六堡茶群體種與突肋茶核基因組之間是否存在基因流，分別開展了STRUCTURE分析和D檢驗(yàn)（ABBA-BABA統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)）。STRUCTURE分析：利用PGDSpider 2.1.1.5軟件（Lischer amp; Excoffier， 2012）將32份六堡茶群體種和突肋茶樣品的核基因串聯(lián)矩陣從FASTA格式轉(zhuǎn)換為VCF格式。通過Admixture 1.3.0軟件（Alexander et al.， 2009）分析32份樣品的種群結(jié)構(gòu)和遺傳混合程度，分別假設(shè)樣品的分群數(shù)（K值）為1～10進(jìn)行聚類，根據(jù)CV誤差（cross validation error）得到最佳K值（CV誤差最?。?。D檢驗(yàn)：使用Dsuite 0.4 r42軟件進(jìn)行了ABBA-BABA統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)（Malinsky et al.， 2021）。該檢驗(yàn)利用四個(gè)分類單元P1、P2、P3和O，以O(shè)為外群，將P1和P2作為一對姐妹種，將P3作為與P1或P2具有潛在基因流的物種。統(tǒng)計(jì)具有ABBA和BABA等位基因模式的位點(diǎn)數(shù)量。D統(tǒng)計(jì)量來自計(jì)算D=（nABBA-nBABA）/（nABBA+nBABA），其中nABBA和nBABA分別為具有ABBA和BABA模式的位點(diǎn)總數(shù)。如果D≠0，Z-score gt;3和P值lt; 0.05，則存在基因流。根據(jù)葉綠體系統(tǒng)樹結(jié)果推測，與突肋茶近緣的六堡茶群體種樣品可能與突肋茶有基因流。鑒于此，我們進(jìn)一步根據(jù)核基因系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系選擇樣品分別作為P1、P2、P3、O進(jìn)行D檢驗(yàn)：P1分別用與六堡茶群體種近緣的12份栽培茶樣品（簡稱ZPC）、與六堡茶群體種近緣的其余4個(gè)茶組植物（簡稱NO-ZPC），與茶近緣的六堡茶群體種13份樣品（簡稱LP）；P2則分別用與突肋茶近緣的六堡茶群體種14份樣品（簡稱LP-TLC），與茶近緣的六堡茶群體種13份樣品（簡稱LP）；P3分別用突肋茶5份樣品（簡稱TLC）和與突肋茶近緣的2個(gè)物種（簡稱NO-TLC）；O為外類群，選擇系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系在茶、突肋茶和茶組物種外且相對近緣的包含3個(gè)物種的一分支為外類群。

1.3.5 六堡茶群體種樣品的葉綠體基因組分歧進(jìn)化時(shí)間估算 根據(jù)葉綠體基因組構(gòu)建的六堡茶群體種系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，選擇具有系統(tǒng)發(fā)育代表性的6份樣品，即分散在不同支系、代表不同來源的兩大類葉綠體基因組序列（見結(jié)果部分），將6份樣品的葉綠體基因組序列整合到已發(fā)表的山茶科分化時(shí)間估算所用的葉綠體基因組數(shù)據(jù)中（Yu et al.， 2017），共77份樣品，比對后矩陣長度為156 954 bp。參照Yu等（2017）的方法，用8個(gè)化石標(biāo)定點(diǎn)，使用BEAST 2.6.6軟件（Bouckaert et al.， 2014）估算六堡茶群體種葉綠體基因組序列分歧進(jìn)化暨關(guān)鍵演化事件發(fā)生的時(shí)間，具體設(shè)置：先驗(yàn)樹采用birth-death模型提供物種或基因分化的先驗(yàn)信息，并結(jié)合松弛分子鐘模型lognormal（UCLN）relaxed clock處理進(jìn)化速率的變異，運(yùn)行5億代，每5萬代取樣一次；使用Tracer 1.7.2軟件（Rambaut et al.， 2018）檢查收斂情況，以確保有效采樣值（ESS）均大于100；使用TreeAnnotator 2.6.6軟件（Bouckaert et al.， 2014）舍棄掉初始的20%樣本，利用剩余80%生成最大可信度時(shí)間樹（maximum credibility chronogram， MCC）；用FigTree 1.3.1軟件（Rambaut， 2010）對時(shí)間樹進(jìn)行展示和美化。

1.3.6 遺傳多樣性分析 利用DnaSP 5.10軟件（Librado amp; Rozas， 2009）對六堡茶群體種的葉綠體基因組序列矩陣和串聯(lián)核基因序列矩陣進(jìn)行遺傳多樣性分析：分別計(jì)算單倍型數(shù)目、單倍型多樣性、核苷酸多樣性、平均核苷酸差異、單倍型多樣性標(biāo)準(zhǔn)差以及單倍型多樣性方差。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉綠體基因組的基本結(jié)構(gòu)

27份六堡茶群體種的葉綠體基因組總長度范圍為156 430～157 131 bp，序列平均長度為156 928 bp，GC含量均為37.3%。六堡茶群體種的葉綠體基因組結(jié)構(gòu)為典型的環(huán)狀四分體，由一個(gè)大單拷貝區(qū)（large single copy， LSC），2個(gè)反向的重復(fù)區(qū)（inverted repeat， IR）以及一個(gè)小單拷貝區(qū)（small single copy， SSC）組成（圖1）。LSC的長度為85 531～86 669 bp，平均長度為86 513 bp；IR的長度為26 018～26 090 bp，平均長度為26 051 bp；SSC的長度為18 258～18 294 bp，平均長度為18 276 bp。27份六堡茶群體種樣品均包含132個(gè)基因，其中87個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因，37個(gè)tRNA基因，8個(gè)rRNA基因（表3）。

2.2 矩陣基本信息

葉綠體基因組構(gòu)成的矩陣比對后序列全長為162 774 bp，包含152 625個(gè)保守位點(diǎn)和5 457個(gè)變異位點(diǎn)；變異位點(diǎn)中包含1 578個(gè)簡約信息位點(diǎn)。135條序列的堿基含量平均值分別為A = 31.1%，T=31.6%，C=19.0%，G=18.3%，其中A+T（62.7%）的含量較高。

689個(gè)單拷貝核基因串聯(lián)矩陣全長為843 771 bp，包含772 399個(gè)保守位點(diǎn)和71 345個(gè)變異位點(diǎn)；變異位點(diǎn)中包含31 251個(gè)簡約信息位點(diǎn)；70條序列的堿基含量平均值分別為A=27.1%，T=26.5%，C=21.5%，G=24.9%，其中A+T（53.6%）的含量略高。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和種間雜交

葉綠體基因組最大似然樹（圖2）顯示，27份六堡茶群體種可分為系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系較遠(yuǎn)的2大組。其中，一組包含13份六堡茶群體種樣品，它們分散嵌入到主要由茶（C. sinensis）組成的一支內(nèi)部（BS=100%），該分支還嵌入幾個(gè)山茶屬其他物種；另一組包括了剩余的14份六堡茶群體種樣品，它們自成單系（BS=95%），與突肋茶（C. costata）最近緣（BS=98%），并且嵌入突肋茶內(nèi)部與其中一支突肋茶互為姐妹（BS=51%）。葉綠體基因組系統(tǒng)樹表明，27份六堡茶群體種的母本至少包括兩種來源，其中一組來自茶，另一組來自突肋茶。

基于核基因串聯(lián)矩陣構(gòu)建的最大似然樹（圖3）顯示，27份六堡茶群體種與栽培茶及其他幾個(gè)山茶屬物種構(gòu)成一個(gè)多歧（polytomy）分支（BS=68%），該分支與突肋茶系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系較遠(yuǎn)。由此表明，部分六堡茶群體種樣品在葉綠體基因組樹上與突肋茶最近緣最可能是因?yàn)殡s交，部分六堡茶群體種的祖先捕獲了突肋茶的葉綠體基因組。

2.4 基于核基因的六堡茶群體種和突肋茶基因流分析

基于核基因，對32份六堡茶群體種和突肋茶進(jìn)行遺傳混合程度分析結(jié)果表明，當(dāng)K=2時(shí)，CV誤差最小，即為最佳K值（圖4：A）。32份樣品可分為2個(gè)類群即六堡茶群體種和突肋茶，2個(gè)類群之間沒有遺傳物質(zhì)混合，即未檢測到基因流（圖4：B）。D檢驗(yàn)同樣檢測不到六堡茶群體種和突肋茶之間有基因流（表4）。上述核質(zhì)基因組系統(tǒng)發(fā)育矛盾已表明，部分六堡茶群體種的祖先曾與突肋茶發(fā)生過雜交事件，但可能因?yàn)殡s交后代作為母本又反復(fù)與父本六堡茶群體種發(fā)生了回交，經(jīng)過多代回交后，這些捕獲了突肋茶葉綠體基因組的雜交后代核基因組中的突肋茶基因已被充分稀釋，所以根據(jù)核基因序列已檢測不到基因流。

2.5 六堡茶群體種與突肋茶雜交的時(shí)間

基于葉綠體基因組數(shù)據(jù)估算的分子鐘結(jié)果（圖5）表明，部分六堡茶群體種的祖先大約于1.55百萬年前 （95% HPD：0.80～2.47 Ma）的第四紀(jì)時(shí)期與部分突肋茶的祖先發(fā)生了雜交，捕獲了突肋茶的葉綠體基因組。雜交事件遠(yuǎn)早于人類栽培和制作茶的歷史。

2.6 遺傳多樣性

六堡茶群體種的遺傳多樣性分析結(jié)果（表5）顯示，27份葉綠體基因組序列共定義了16個(gè)單倍型，單倍型多樣性為0.949，核苷酸多樣性為0.000 9，平均核苷酸差異為140.057，單倍型多樣性方差為0.000 62，單倍型多樣性標(biāo)準(zhǔn)差為0.025。而27份六堡茶群體種單拷貝核基因串聯(lián)序列共定義了27個(gè)單倍型，單倍型多樣性為1，核苷酸多樣性為0.004 72，平均核苷酸差異為2 598.37，單倍型多樣性方差為0.000 1，單倍型多樣性標(biāo)準(zhǔn)差為0.01。

3 討論與結(jié)論

3.1 六堡茶群體種雜交捕獲突肋茶葉綠體基因組的歷史過程

部分六堡茶群體種樣品在基于葉綠體基因組和核基因重建的系統(tǒng)樹上的位置顯著不同（核質(zhì)結(jié)果不一致）。在葉綠體樹上，部分六堡茶群體種樣品與突肋茶最近且嵌入其內(nèi)部，而在核基因樹上，這些樣品與突肋茶親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。除上述部分六堡茶群體種樣品以外，其余茶樣品在葉綠體和核基因樹上都與突肋茶親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。已有研究表明，葉綠體捕獲事件是核質(zhì)系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系不一致的重要原因之一（Fehrer et al.， 2007；Yi et al.， 2015；Liu et al.， 2017），葉綠體捕獲在同域分布（或分布區(qū)重疊）和生殖相容的物種間可能頻繁發(fā)生（Acosta amp; Premoli， 2010）。根據(jù)記載，野生突肋茶在廣東、廣西和貴州均有分布，尤其是廣西賀州昭平縣有豐富的野生突肋茶資源（李朝昌等，2019）。這表明六堡茶群體種與突肋茶的分布區(qū)有重疊，為雜交提供了可能性。因此，造成六堡茶群體種部分樣品在葉綠體樹上與突肋茶最近緣的最可能原因是它們的祖先與部分突肋茶的祖先發(fā)生了雜交，捕獲了突肋茶的葉綠體基因組。在串聯(lián)核基因樹上，含有突肋茶類型葉綠體基因組的六堡茶群體種樣品與其他六堡茶群體種樣品均不與突肋茶最近，表明這些樣品雖然為雜交后代，但可能因?yàn)殡s交后代作為母本又反復(fù)與父本六堡茶群體種發(fā)生了回交，經(jīng)過多代回交后，這些雜交后代核基因組中的突肋茶基因已被充分稀釋，所以沒有雜交后代個(gè)體在核基因樹上與突肋茶最近緣?；诤嘶虼?lián)矩陣的基因流分析也未檢測到六堡茶群體種樣品與突肋茶之間的基因流，這進(jìn)一步支持了雜交后代個(gè)體核基因組中突肋茶基因已被充分稀釋的推測。這一推測也與先前的研究相符，即當(dāng)不同物種發(fā)生雜交后，雜交后代與親本反復(fù)回交會導(dǎo)致葉綠體基因組從一個(gè)物種滲入到另一個(gè)物種，最終導(dǎo)致回交后代的細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)遺傳信息來自不同的物種（Rieseberg amp; Soltis， 1991；Acosta amp; Premoli， 2010；Kleinkopf et al.， 2019）。此外，雜交后代個(gè)體中，葉綠體基因組序列和核基因序列都有相當(dāng)程度的分化，這有兩種可能的解釋：一種是一次古老雜交產(chǎn)生的雜交后代發(fā)生了分化；另一種是含有不同單倍型的六堡茶群體種與突肋茶發(fā)生多次近期獨(dú)立雜交。鑒于雜交后代核基因與純系六堡茶群體種及其他茶品種最近而與突肋茶較遠(yuǎn)，并且雜交后代樣品在葉綠體樹上為單系并嵌入突肋茶內(nèi)部，以及雜交后代樣品與突肋茶在核基因組中未檢測到基因流，因此我們推測所取樣的六堡茶群體種雜交樣品更可能是其祖先與部分突肋茶祖先發(fā)生一次古老雜交的后代。分子鐘結(jié)果進(jìn)一步表明，六堡茶群體種父本祖先與突肋茶母本祖先在1.55百萬年前的第四紀(jì)時(shí)期發(fā)生了雜交和葉綠體基因組捕獲，該事件的發(fā)生遠(yuǎn)遠(yuǎn)早于人類栽培和制作茶的歷史。因此，現(xiàn)有六堡茶群體種多樣性應(yīng)是選育了具有不同母系來源的野生六堡茶，而非在栽培過程中人為介導(dǎo)了雜交。

3.2 六堡茶群體種遺傳多樣性

無論在葉綠體基因組上還是核基因上，六堡茶群體種的單倍型多樣性與核苷酸多樣性相比，單倍型多樣性都較高，這可能是因?yàn)樯倭繅A基突變能迅速增加單倍型多樣性，但核苷酸多樣性卻難以在短期內(nèi)迅速增加。六堡茶群體種葉綠體基因組的單倍型多樣性（0.949）遠(yuǎn)高于Petit等計(jì)算的170種植物的葉綠體DNA多樣性的平均值0.67（Petit et al.， 2005），這在一定程度上表明六堡茶群體種的遺傳多樣性較高，與王留彬等（2022）基于SSR對六堡茶群體種進(jìn)行的遺傳多樣性分析得出六堡茶群體種遺傳多樣性高的結(jié)論一致。Zhang等（2021）研究發(fā)現(xiàn)，雜交或基因漸滲會提高茶樹的遺傳多樣性。六堡茶群體種通過雜交捕獲了突肋茶的葉綠體基因組，從而使得六堡茶群體種遺傳多樣性較高。六堡茶群體種具有豐富的遺傳多樣性和較高的演化潛力，應(yīng)充分保護(hù)具有不同遺傳背景的個(gè)體， 這有利于六堡茶產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，并為進(jìn)一步的遺傳改良和品質(zhì)提升提供更多的選擇性和可能性。

3.3 六堡茶品種選育和資源開發(fā)利用

優(yōu)質(zhì)的茶樹品種是茶葉優(yōu)異品質(zhì)形成的重要因素（劉佳等，2013）。茶樹品種影響茶葉化學(xué)成分組成與含量，從而影響茶葉的品質(zhì)（郭桂義等，2010）。隨著六堡茶市場不斷擴(kuò)大，為滿足日益增長的需求，六堡茶的制作除了使用傳統(tǒng)的六堡茶群體種外，還引進(jìn)了其他外地的適制品種，如凌云白毫茶、臨桂白毫茶、資源大桂茶等，加之六堡茶茶園里茶樹品種來源不一，導(dǎo)致市場上部分六堡茶產(chǎn)品失去了其原來的品質(zhì)特點(diǎn)（劉曉東等，2013）。本研究顯示，六堡茶群體種具有不同的遺傳背景和演化歷史，具有較高遺傳多樣性。這為進(jìn)一步探索不同遺傳背景與農(nóng)藝性狀和茶品質(zhì)之間的關(guān)聯(lián)提供了契機(jī)。未來研究可通過遺傳的深入分析和農(nóng)藝性狀的評估，探索不同品種間的遺傳差異與茶葉品質(zhì)之間的關(guān)系，為高品質(zhì)的六堡茶株系或品種的選育、鑒定和開發(fā)利用提供新的思路和方案。此外，借鑒六堡茶與突肋茶間的自然雜交，可以開展種間或品種間人工雜交。通過定向雜交引入其他品種或種類的優(yōu)質(zhì)基因，可以進(jìn)一步改良六堡茶的品質(zhì)特點(diǎn)，獲得高品質(zhì)的新品種。

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（責(zé)任編輯 李 莉 王登惠）

基金項(xiàng)目：" 廣西創(chuàng)新驅(qū)動發(fā)展專項(xiàng)（桂科AA20302018-1）； 廣西自然科學(xué)基金（2023GXNSFAA026221）； 廣西喀斯特植物保育與恢復(fù)生態(tài)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目（22-035-26）。

第一作者： 姚淑婷（1998—），碩士研究生，主要從事植物系統(tǒng)發(fā)育研究，（E-mail）1150487855@qq.com。

*通信作者：" 覃信梅，碩士，助理研究員，主要從事植物系統(tǒng)演化和生物信息學(xué)研究，（E-mail）xinmeiqin2018@163.com。