基于引物交換反應(yīng)的非標(biāo)記熒光探針用于脫嘌呤/脫嘧啶核酸內(nèi)切酶1 的高靈敏檢測

摘要 脫嘌呤/脫嘧啶核酸內(nèi)切酶1（Apurinic/apyrimidinic endonuclease 1， APE 1）是一種多功能蛋白質(zhì)，在DNA 修復(fù)和基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮重要作用。由于APE 1 在多種癌癥中過表達(dá)，因此可作為癌癥生物標(biāo)志物，用于輔助臨床診斷、指導(dǎo)用藥及預(yù)后監(jiān)測。本研究采用引物交換反應(yīng)（Primer exchange reaction， PER）策略，設(shè)計了一種非標(biāo)記型熒光探針，用于APE 1 活性的高靈敏檢測。當(dāng)體系中不存在APE 1 時，催化發(fā)夾（Catalytic hairpin， HP）的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，無G-四鏈體（G-quadruplex）生成。此時，游離的硫磺素T（Thioflavin T，ThT）不發(fā)射熒光，體系的背景熒光很低。加入APE 1 后，催化發(fā)夾上的無嘌呤/嘧啶（Apurinic/apyrimidinic，AP）位點被特異性識別并切割，斷裂生成的短核酸序列可直接作為引物引發(fā)PER 擴增，生成大量G-四鏈體。游離的ThT 嵌入G-四鏈體結(jié)構(gòu)并發(fā)出熒光，導(dǎo)致傳感體系的熒光信號顯著增強。PER 擴增反應(yīng)策略和催化發(fā)夾的低背景設(shè)計使此探針展現(xiàn)出很高的靈敏度，線性檢測范圍為0.001～0.07 U/mL，檢出限（3σ）為0.0008 U/mL。此外，引物序列可由APE 1 切割直接生成而不需要額外添加，這不僅提高了反應(yīng)的特異性，還簡化了操作步驟。非標(biāo)記型熒光信號的使用大大降低了實驗成本，實現(xiàn)了APE 1 的快速檢測。利用此熒光探針檢測人血清樣品中APE 1 的含量，回收率在91%～104%之間，表明其在生物酶研究方面擁有巨大的應(yīng)用潛力。

關(guān)鍵詞 脫嘌呤/脫嘧啶核酸內(nèi)切酶1；引物交換反應(yīng)；G-四鏈體；硫磺素T；非標(biāo)記熒光探針

脫嘌呤/脫嘧啶核酸內(nèi)切酶1（Apurinic/apyrimidinic endonuclease 1， APE 1）是一種人體組織中廣泛存在的多功能蛋白質(zhì)，在堿基切除修復(fù)和基因表達(dá)調(diào)控中不可或缺[1-2]。作為細(xì)胞中重要的DNA 修復(fù)酶，APE 1 識別并催化切割雙鏈DNA 上的無嘌呤/嘧啶（Apurinic/apyrimidinic， AP）位點并產(chǎn)生缺口，然后通過聚合和連接反應(yīng)完成修復(fù)，從而確?；蚣易逋暾鸞3]。此外， APE 1 還可激活氧化應(yīng)激反應(yīng)中幾種重要的轉(zhuǎn)錄因子，如p53、AP-1、NF-κB、HIF-α和PAX-5 等，進而調(diào)控基因表達(dá)[4]。然而，這種在正常生理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的酶，在腫瘤細(xì)胞中卻呈現(xiàn)出異常的高表達(dá)。這種異常表達(dá)不僅通過促進細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡和增強細(xì)胞侵襲能力來促進多種腫瘤的生長和擴散，還通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子活性，影響腫瘤細(xì)胞對放化療的敏感性，進而降低治療效果[5-8]。因此， APE 1 可作為重要的癌癥標(biāo)志物輔助臨床診斷、指導(dǎo)用藥及預(yù)后監(jiān)測。

傳統(tǒng)的APE 1 活性測定方法包括酶聯(lián)免疫吸附分析法、電化學(xué)分析方法和化學(xué)發(fā)光免疫分析方法。這些方法具有靈敏度高、特異性好且結(jié)果可靠等優(yōu)勢，但存在操作復(fù)雜、耗時長和成本高等缺點[9-11]。熒光分析法具有快速、高時空分辨率以及儀器操作相對簡單等優(yōu)點，引起了廣泛關(guān)注[12-14]。Liu 等[13]將滾環(huán)擴增反應(yīng)（RCA）與G-四鏈體（G-quadruplex）相結(jié)合設(shè)計了一種熒光探針，用于APE 1 的靈敏檢測；Huang 等[14]利用聚合酶和內(nèi)切酶共同作用的等溫擴增技術(shù)與G-四鏈體相結(jié)合開發(fā)了一種可檢測APE 1的高靈敏傳感器。上述傳感器雖然具有較高的靈敏度，但在設(shè)計過程中需要T4 DNA 連接酶、核酸外切酶Ⅰ（ExonucleaseⅠ， ExoⅠ）和核酸外切酶Ⅲ（Exonuclease Ⅲ， Exo Ⅲ）的共同作用形成環(huán)狀模板，或需要內(nèi)切酶的輔助進行下一輪擴增。多種酶的聯(lián)合使用不僅會引起非特異性識別和假性信號的風(fēng)險，還會增加檢測的成本和操作的復(fù)雜性。因此，發(fā)展靈敏度高、特異性好且操作簡單的APE 1 檢測技術(shù)具有非常重要的意義。

引物交換反應(yīng)（Primer exchange reaction， PER）策略是一種新穎而強大的等溫核酸擴增技術(shù)，在新一代熒光放大生物傳感器的構(gòu)建方面展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用前景。該技術(shù)以催化發(fā)夾（Catalytic hairpin， HP）DNA 為模板，在聚合酶的作用下啟動可逆且重復(fù)的鏈置換反應(yīng)，最終以自主、可編程和等溫的方式合成多條特定的單鏈DNA[15]。與滾環(huán)擴增等其它擴增技術(shù)相比， PER 發(fā)夾設(shè)計簡單，只需一種聚合酶即可實現(xiàn)特異且快速的信號擴增[16-17]。Xie 等[18]將CRISPR/Cas 體系與PER 技術(shù)相結(jié)合構(gòu)建了一種高靈敏的生物探針用于核糖核酸酶H 檢測。Li 等[19]利用PER 技術(shù)開發(fā)了自主DNA 合成器，用于痕量的鼠傷寒沙門菌檢測。這些傳感器顯著提高了檢測的靈敏度和穩(wěn)定性，但需要復(fù)雜的核酸修飾或標(biāo)記過程。非標(biāo)記熒光探針無需對信號分子進行標(biāo)記，具有操作簡便、成本低以及可實時監(jiān)測生物體系動態(tài)變化等優(yōu)勢。

利用PER 技術(shù)簡潔的設(shè)計和良好的放大能力，本研究構(gòu)建了一種非標(biāo)記型的熒光探針，用于APE 1活性的快速、高靈敏檢測。由于催化發(fā)夾中的富G 序列被全部固定于發(fā)夾結(jié)構(gòu)的頸部，且結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，硫磺素T（Thioflavin T， ThT）游離于溶液中，體系的背景熒光很低。加入APE 1 后，催化發(fā)夾上的AP 位點被切割，生成的短核酸序列可作為引物引發(fā)PER 擴增，生成大量的G-四鏈體。游離的ThT 嵌入G-四鏈體結(jié)構(gòu)并發(fā)出熒光，導(dǎo)致體系的熒光信號顯著增強。PER 擴增反應(yīng)策略以及催化發(fā)夾的低背景設(shè)計使此傳感體系展現(xiàn)出較高的靈敏度。此外， PER 擴增不需要額外添加引物，簡化了操作步驟，而且非標(biāo)記型熒光信號的使用降低了實驗成本。將本方法用于人血清樣本中APE 1 活性分析，結(jié)果令人滿意。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

F-4500 熒光分光光度計（日本Hitachi 公司）；FE-28 pH 計（美國Mettler-Toledo 公司）。

APE 1、ExoⅠ、Exo Ⅲ、Bst DNA 聚合酶（Bst DNA polymerase）、脫氧核糖核酸酶Ⅰ（DnaseⅠ）和辣根過氧化物酶（HRP）購自美國New England Biolabs 公司；ThT、脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP）和催化發(fā)夾（5′-AAGGGTT/idSp/GGGTTAGGGTTAGGGCCCGGTTTTCCGGGCCCTAACCCTAACCCTAACCCTT-3′）由生工生物工程（上海）股份有限公司提供；NaCl、MgCl2、Tris-HCl 緩沖液和牛血清白蛋白（BSA）均購自北京索萊寶科技有限公司。1×NEB 2.1 緩沖液（50 mmol/L NaCl， 10 mmol/L Tris-HCl， 10 mmol/L MgCl2，100 μg/mL BSA， pH 7.9， 25 ℃）購自美國New England Biolabs 公司。以上試劑均為分析純，無需其它處理。實驗用水為MILI-Q 超純水系統(tǒng)（美國Millipore 公司）制備的超純水（18.2 MΩ·cm）。

1.2 實驗方法

1.2.1 APE 1 活性的檢測

將2 μL 不同濃度的APE 1、2 μL 催化發(fā)夾（10 μmol/L）、2 μL 10×NEB 緩沖液4 和4 μL DEPC 水混合均勻。在37 ℃反應(yīng)60 min 后，在65 ℃加熱20 min 使APE 1 失活。然后移取10 μL 上述反應(yīng)體系、2 μL Bst DNA 聚合酶（1 U/mL）、4 μL 10×ThermoPol 反應(yīng)緩沖液、4 μL 10×MgSO4溶液、1 mmol/L dNTP（dATP， dTTP， dGTP， dCTP）各4 μL和2 μL ThT（40 μmol/L）至EP 管中，補加DEPC 水至總體積為40 μL，混勻，于37 ℃孵育120 min。反應(yīng)結(jié)束后，繼續(xù)補加1×NEB 2.1 緩沖液至總體積為100 μL；在激發(fā)波長為425 nm、發(fā)射波長為480 nm 條件下測定體系的熒光強度。

1.2.2 實際樣品中APE 1 的測定

本研究中的血液樣本由山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院提供，并獲得了審查委員會的批準(zhǔn)和參與者的知情同意。血液樣本首先在4 ℃以10000 r/min 離心10 min，獲得上層血清，稀釋3 倍，于65 ℃加熱15 min，使血清中的蛋白酶失活。將不同濃度的APE 1 加入到上述血清中，并按1.2.1 節(jié)的方法測量熒光強度，計算血清樣品中APE 1 的回收率。

2 結(jié)果與討論

2.1 實驗原理

基于PER 策略的非標(biāo)記熒光探針設(shè)計原理如圖1 所示，靠近催化發(fā)夾的5′端含有AP 位點，便于目標(biāo)物APE 1 的識別；3′端修飾Inverted dT 以避免非特異性擴增[20]；靠近環(huán)狀部位含有一段終止序列（3 對G-C 堿基），用于終止擴增反應(yīng)。未加入APE 1 時，催化發(fā)夾的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，處于游離狀態(tài)的ThT 不發(fā)射熒光，傳感體系的背景熒光很低。加入APE 1 后， APE 1 特異性識別并切割催化發(fā)夾上的AP 位點，斷裂生成的短核酸序列（綠色）可作為PER 擴增的引物。隨后，在Bst DNA 聚合酶的催化作用下，引物利用加入的dNTP 進行延伸，直至到達(dá)終止序列時擴增結(jié)束。由于分子內(nèi)競爭雜交的影響，延長的DNA 序列移位并折疊成G-四鏈體，游離的ThT 嵌入G-四鏈體結(jié)構(gòu)且發(fā)出熒光，傳感體系的熒光信號顯著增強?；赑ER 策略的非標(biāo)記熒光探針為快速、靈敏測定APE 1 活性提供了一種新方法。

2.2 傳感體系的可行性分析

為了驗證此傳感體系檢測APE 1 的可行性，考察了不同實驗條件下溶液的熒光變化。如圖2A 所示，染料ThT 游離于溶液中，熒光信號很弱（曲線a）。加入催化發(fā)夾后，溶液的熒光信號幾乎與背景信號持平（曲線b），這表明催化發(fā)夾的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定， ThT 不能與之結(jié)合。加入dNTP 和Bst DNA 聚合酶，此傳感體系的熒光信號仍較低（曲線c）。加入APE 1 后，此傳感體系的熒光信號顯著增強（曲線d），這是由于APE 1 特異性地識別并切割催化發(fā)夾上的AP 位點，斷裂生成的短核酸序列直接作為引物引發(fā)PER 擴增，生成大量G-四鏈體。游離的ThT 嵌入G-四鏈體結(jié)構(gòu)并發(fā)出熒光。如圖2B 所示，加入APE 1 之前，在紫外光照射下未觀察到熒光（管1）；加入APE 1 后，觀測到明顯的熒光（管2），此結(jié)果與傳感體系熒光光譜的變化一致。上述結(jié)果表明，本傳感體系可用于APE 1 活性檢測。

2.3 實驗條件的優(yōu)化

為了使傳感體系的檢測性能達(dá)到最佳，對dNTP、Bst DNA 聚合酶和ThT 的濃度以及PER 擴增反應(yīng)時間等實驗條件進行優(yōu)化。利用傳感體系的熒光強度比值（F/F0）評價傳感體系的性能，其中， F 為存在APE 1 時的熒光強度， F0 為不存在APE 1 時的熒光強度。如圖3A 所示，隨著dNTP 濃度增大， F/F0 逐漸增大，當(dāng)dNTP 濃度增至100 nmol/L 時， F/F0 達(dá)到平臺期。Bst DNA 聚合酶濃度對此傳感體系性能的影響如圖3B 所示，當(dāng)Bst DNA 聚合酶濃度為1.6 U/mL 時， F/F0 達(dá)到最大值。ThT 濃度對此傳感體系性能的影響如圖3C 所示，在ThT 濃度為2 μmol/L 時， F/F0 達(dá)到峰值。PER 擴增反應(yīng)時間對此傳感體系性能的影響如圖3D 所示，隨著反應(yīng)時間延長， F/F0 逐漸增大，并在120 min 時達(dá)到峰值。此外，由于K+對G-四鏈體結(jié)構(gòu)的形成和穩(wěn)定有一定影響[21]，考察了KCl 濃度對此傳感體系性能的影響。如圖3E 所示，當(dāng)KCl 濃度從0 增至10 mmol/L 時， F/F0 未發(fā)生顯著變化，說明K+的加入對傳感體系的檢測性能基本無影響，這可能由于溶液中的Na+濃度足以使G-四鏈體形成穩(wěn)定的折疊結(jié)構(gòu)。

將此探針在4 ℃環(huán)境下保存不同時間后，測定其對APE 1 的熒光響應(yīng)，以評估探針的穩(wěn)定性。結(jié)果如圖3F 所示，探針在4 ℃環(huán)境中保存24 h 后， F/F0 只略微下降，表明其具有一定的穩(wěn)定性。

綜上所述，本研究選擇在傳感體系中加入100 nmol/L dNTP、1.6 U/mL Bst DNA 聚合酶和2 μmol/LThT，反應(yīng)120 min 后進行后續(xù)實驗。

2.4 傳感體系的分析性能

在最優(yōu)實驗條件下，評估了此傳感體系對不同濃度APE 1 的響應(yīng)性能，如圖4A 所示，不存在APE 1時，催化發(fā)夾的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，因此ThT 游離于溶液中，無熒光發(fā)射，傳感體系的背景熒光很低。隨著APE 1濃度增大，傳感體系的熒光強度隨之增強。這主要由于APE 1 切割催化發(fā)夾上的AP 位點，生成的引物經(jīng)PER 擴增后折疊成G-四鏈體結(jié)構(gòu)并與ThT 結(jié)合，顯著提升了熒光響應(yīng)。此傳感體系的F/F0 與APE 1濃度的關(guān)系如圖4B 所示，當(dāng)APE 1 濃度達(dá)到1 U/mL 時， F/F0 趨于穩(wěn)定。圖4B 插圖為此傳感體系檢測APE 1 的校正曲線，線性檢測范圍為0.001～0.07 U/mL，線性方程為y = 52.06x + 0.91，相關(guān)系數(shù)（R2）為0.995，檢出限（3σ）為0.0008 U/mL，與文獻報道的標(biāo)記性熒光傳感器（表1）靈敏度相當(dāng)甚至更優(yōu)，這主要歸因于發(fā)夾探針的低背景設(shè)計和PER 的高效擴增。

2.5 傳感體系的選擇性

為了考察此傳感體系對APE 1活性檢測的特異性，測定了其在ExoⅠ、ExoⅢ、DnaseⅠ、HRP以及BSA等干擾物存在時的熒光響應(yīng)。如圖5 所示，加入目標(biāo)物APE 1 時，傳感器顯示出較高的響應(yīng)信號（F/F0）；加入其它干擾物時，傳感器的熒光響應(yīng)與空白樣品相近，上述結(jié)果表明，此傳感體系對APE 1 具有良好的選擇性。

2.6 實際樣品中APE 1 的測定

采用本方法對人血清樣品中的APE 1 活性進行測定。向稀釋3 倍的人血清樣品中添加不同濃度的APE1，測定結(jié)果如表2 所示，血清樣品中APE 1 的加標(biāo)回收率為91%～104%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差lt;5.2%，表明此傳感體系可用于實際樣品中APE 1 活性分析。

3 結(jié)論

基于PER 擴增策略構(gòu)建了一種非標(biāo)記型熒光探針，用于APE 1 活性的高靈敏測定。催化發(fā)夾的低背景設(shè)計以及PER 的高效擴增使此探針展現(xiàn)出很高的靈敏度，檢出限低至0.0008 U/mL。此外， PER 擴增不需額外添加引物，簡化了操作步驟，而且非標(biāo)記型熒光信號的使用大大降低了實驗成本。將本方法用于人血清樣本中APE 1 活性分析，結(jié)果令人滿意。

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山西省自然科學(xué)基金項目（Nos. 202303021221139，202203021222259）、中國博士后科學(xué)基金項目（No. 2024M761887）和山西醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生理學(xué)教育部重點實驗室開放基金項目（No. CPOF202301）資助。