皮膚撕脫傷與血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡

李向東　魯開化

［中圖分類號(hào)］R641［文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼］A［文章編號(hào)］1008-6455(2001)01-0-0

當(dāng)今社會(huì)，由于車禍及其他機(jī)械性外傷數(shù)量猛增，皮膚撕脫已成為整形美容外科領(lǐng)域的重要研究課題，研究表明^〔1〕，皮膚撕脫傷所致的皮膚血管損傷和壞死，除與皮膚血管的直接損傷有關(guān)外，一個(gè)重要的原因就是繼發(fā)性血栓形成。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞(簡(jiǎn)稱VEC)凋亡的加速可能是又一個(gè)不可忽視的血栓形成因素。細(xì)胞凋亡是指一定生理和病理?xiàng)l件下，自身內(nèi)部特殊基因程序發(fā)生了改變，出現(xiàn)了程序性細(xì)胞死亡。因此，正確地理解VEC凋亡的發(fā)生發(fā)展規(guī)律，對(duì)尋找保護(hù)血管內(nèi)皮的措施具有重要的意義?，F(xiàn)就VEC的凋亡綜述如下。

1血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡后形態(tài)學(xué)改變1991年Bobaye等^〔2〕采用蘇木素和伊紅染色，電鏡觀察VEC凋亡時(shí)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)學(xué)發(fā)生如下改變：細(xì)胞為圓形，細(xì)胞膜泡狀突起，胞漿內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體腫大，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒，細(xì)胞核染色質(zhì)固縮、裂解，細(xì)胞器皺縮，橋粒、半橋粒等細(xì)胞間連接喪失，微絨毛消失，胞漿膜向細(xì)胞內(nèi)深陷，將細(xì)胞分成多個(gè)大小不等的不連接續(xù)凋亡小體。凋亡小體是內(nèi)有細(xì)胞器和核質(zhì)成分，外有胞漿膜包裹的小體，是細(xì)胞凋亡的重要特征。

2缺血再灌注時(shí)的氧自由基、鈣離子誘導(dǎo)的VEC凋亡

2.1氧自由基誘導(dǎo)的VEC凋亡VEC易受氧自由基和過(guò)氧化物(H₂O₂)的損傷。以往研究H₂O₂對(duì)VEC的損傷主要是高濃度H₂O₂的直接毒性，但De Bomo等^〔3〕通過(guò)低濃度的H₂O₂對(duì)主動(dòng)脈EC的影響發(fā)現(xiàn)：低濃度的H₂O₂引起的VEC凋亡比高濃度H₂O₂引起的VEC死亡影響的更加明顯，因?yàn)檠鼙谏系牡蛲黾?xì)胞影響VEC再生，血管壁損傷又增加白細(xì)胞粘附的機(jī)會(huì)。金惠銘^〔4〕也用低濃度(0～100μMol)H₂O₂對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠肺微血管的作用進(jìn)行了研究，認(rèn)為低濃度H₂O₂對(duì)VEC產(chǎn)生的是遲發(fā)性損傷效應(yīng)-凋亡。24h，其表現(xiàn)為EC增殖活性有劑量依賴性抑制，EC本身出現(xiàn)了核固縮、細(xì)胞收縮和不典型的凋亡小體，同時(shí)流式細(xì)胞儀DNA測(cè)定發(fā)現(xiàn)一典型的凋亡峰。De Bono等^〔5〕用自由基清除劑NMHH對(duì)抗氧化氫引起的VEC凋亡發(fā)現(xiàn)，VEC暴露于50～100μMol/L的H₂O₂ 10min～60min時(shí)，50μmol/L～200μMol/L的NMHH能阻止VEC凋亡的發(fā)生，這說(shuō)明自由基清除劑有防止VEC凋亡和缺血再灌注損傷時(shí)的保護(hù)作用。

2.2Ca〔2+〕誘導(dǎo)的VEC凋亡缺血再灌注損傷后血液及VEC內(nèi)Ca2+增加。Geeraerte等^〔6〕在研究自由基對(duì)VEC的損傷時(shí)認(rèn)為胞漿游離Ca2+水平升高的結(jié)果是作為第二信使激活了在細(xì)胞凋亡過(guò)程中起重要作用的Ca2+依賴性核酸內(nèi)切酶。此外，F(xiàn)unuya等^〔7〕用Ca2+依賴性ATP酶抑制性與非激素依賴性前列腺癌細(xì)胞作用，也獲得了同樣的結(jié)果。但也有不同的報(bào)道，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Ca2+的增高，而其增高與DNA的降解無(wú)關(guān)，細(xì)胞內(nèi)Ca2+的水平比體外實(shí)驗(yàn)時(shí)激活Ca2+/Mg2+-Enase所需者低100～1000倍〔8，9〕。因此，細(xì)胞內(nèi)Ca2+增高誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡機(jī)制可能是復(fù)雜的，所采取的細(xì)胞類型不同和誘導(dǎo)的細(xì)胞方法、條件不同，可能得出不同的結(jié)論。有人提出，細(xì)胞內(nèi)Ca2+誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡更多的是參與了信息傳遞，即Ca2+與鈣調(diào)節(jié)蛋白(CaM)結(jié)合，激活了CaM，活化的CaM又激活CaM依賴性蛋白酶(CaM-PK)，而CaM-PK又可以激活磷酸脂酶(PL)的磷酸化，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)Ca2+的增高又可激活胞膜Ca2+-ATPase啟動(dòng)Ca2+的外流，從而引起H+反向流動(dòng)，使細(xì)胞酸化，激活DNaseⅡ，促使細(xì)胞凋亡〔10〕。可見，VEC凋亡與細(xì)胞內(nèi)的Ca2+密切相關(guān)。各種不同刺激信號(hào)通過(guò)復(fù)雜的信息傳遞途徑引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+的變化。這種變化取決于細(xì)胞類型的不同和刺激信號(hào)的差異，但核酸內(nèi)切酶的激活以及基因組DNA的特征性降解是細(xì)胞凋亡的重要步驟。

3細(xì)胞因子誘導(dǎo)的VEC凋亡

3.1腫瘤壞死因子(TNF)誘導(dǎo)的VEC凋亡TNF分TNFα和TNFβ，以細(xì)胞膜結(jié)合型和可溶型兩種形式存在。TNF對(duì)敏感細(xì)胞的凋亡效應(yīng)是通過(guò)與細(xì)胞膜上特異性受體(TNFR，主要是TNFR₁)結(jié)合后，觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡和激活核轉(zhuǎn)錄因子NF-kB〔11〕。Haimovitz-Friedmen等〔12〕也有類似的報(bào)道，認(rèn)為TNF作用于跨膜受體后，引起鞘磷脂水解，產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)酰胺，再作為細(xì)胞凋亡的胞內(nèi)信號(hào)，誘導(dǎo)VEC凋亡。在誘導(dǎo)VEC凋亡中，Robaye等^〔2〕在原代培養(yǎng)的豬主動(dòng)脈EC中加入人重組TNF(2000u/ml)，孵育4h，結(jié)果9.4%VEC凋亡，DNA碎片定量為11%，而8h凋亡的細(xì)胞數(shù)達(dá)到22%，DNA碎片定量為20%，具有明顯時(shí)間依賴性，同時(shí)，應(yīng)用失活的人重組TNF或抗人重組TNF抗體，能夠阻止TNF誘導(dǎo)的VEC凋亡。有的物質(zhì)在TNF誘導(dǎo)的VEC凋亡時(shí)具有協(xié)同作用，如蛋白質(zhì)合成抑制劑放線菌酮〔13〕；能夠抑制TNFα誘導(dǎo)下兩種保護(hù)性蛋白的合成，使細(xì)胞的活力下降，同時(shí)對(duì)TNF細(xì)胞毒作用不敏感的細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，或?qū)NF敏感的細(xì)胞出現(xiàn)更強(qiáng)的凋亡效應(yīng)。也有的具有抑制作用，如肺泡Ⅱ型細(xì)胞釋放的熱穩(wěn)定多肽〔14〕。由此可見，TNF具有多種生物學(xué)活性，不僅增加白細(xì)胞與EC間的粘附，而且可以誘導(dǎo)VEC的凋亡。

3.2蛋白激酶C(PKC)誘導(dǎo)的VEC凋亡PKC在細(xì)胞增埴、分化、信號(hào)傳遞、腫瘤發(fā)生等生理和病理過(guò)程中發(fā)揮著作用，在細(xì)胞凋亡過(guò)程中也為一重要的參與細(xì)胞活動(dòng)、轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)生物信號(hào)的物質(zhì)。PKC的作用主要是促進(jìn)細(xì)胞的增殖和分化，抑制細(xì)胞的凋亡，其信號(hào)傳遞的機(jī)制附圖。

PKC接受外來(lái)的信號(hào)活化具有多種途徑，其中最主要的途徑是接受外來(lái)信息產(chǎn)生的二乙酰甘油(DAG)，DAG再活化PKC〔15〕。這種剌激物可以通過(guò)酪氨酸蛋白激酶(PTK)活化磷酸酶C(PLC)或磷酸酶A₂(PLA₂)，或者通過(guò)剌激性G蛋白(GS)途徑活化PLC。而PLC能催化4，5-二磷酸肌醇磷脂(PIP₂)水解產(chǎn)生1，4，5-三磷酸肌醇(IP₃)和DAG，IP₃可使Ca2+從細(xì)胞內(nèi)中釋放出來(lái)，從而使Ca2+和DAG激活PKC。細(xì)胞外信號(hào)也可以活化磷酸酶D(PLD)，再通過(guò)活化磷脂酰膽堿(PC)產(chǎn)生DAG，而活化PKC。外來(lái)信號(hào)激活PTK后，也可通過(guò)PLA₂使PC分解成不飽和脂肪酸(FFA)和溶血性磷酸脂酰膽堿(Lysopc)活化PKC。此外，佛波酯、抑制性G蛋白(Gi)以及P21〔ras〕蛋白也可引起PKC的活化〔16〕。PKC活化后的細(xì)胞是增殖還是凋亡：一般認(rèn)為G蛋白的活化因磷酸化而下調(diào)，引起cAMP水平的增高而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；但也有報(bào)道PKC活化引起細(xì)胞內(nèi)cAMP水平升高而導(dǎo)致細(xì)胞增殖和分化〔17〕。如果PKC活化后，轉(zhuǎn)錄因子如NF-kB磷酸化而解除了其復(fù)合物IKB的束縛，那么PKC就促進(jìn)了細(xì)胞的增殖。由此可見，PKC誘導(dǎo)細(xì)胞增殖和凋亡是復(fù)雜的過(guò)程。Fuks等〔18〕在培養(yǎng)的牛主動(dòng)脈EC內(nèi)加入bFGF，再用輻射導(dǎo)致EC凋亡時(shí)發(fā)現(xiàn)，bFGF能阻止細(xì)胞DNA斷裂及凋亡，這一作用是通過(guò)PKC完成的。bFGF和PTK受體結(jié)合后，使PTK從無(wú)活性狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚誀顟B(tài)，再通過(guò)DAG激活PKC阻止輻射所致的凋亡。用PKC的催化劑PMA和甘油二酯(DG)也能抑制輻射引起的牛主動(dòng)脈EC的凋亡，其作用機(jī)理也是通過(guò)激活PKC的途徑完成的〔19〕。在這里，激活的PKC表現(xiàn)的不是細(xì)胞凋亡，而是保護(hù)作用。這種保護(hù)作用在心肌細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞等均有報(bào)道。用蛋白激酶C(PKC)抑制1-(5-異喹啉磺?；?-2-甲基哌嗪(H-7)和槲皮素對(duì)血小板激活因子(PAF)體內(nèi)作用的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)：特異性PAF受體拮抗劑WEB2086可有效抑制LPS的致死毒性；PAF可誘導(dǎo)小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增高(1.0μg/kg)或死亡(25μg/kg)，而PKC抑制劑H-7、槲皮素對(duì)二者都具有顯著的抑制作用，說(shuō)明H-7和槲皮素抑制PAF毒性與保護(hù)EC有關(guān)；PAF在體內(nèi)對(duì)小鼠的毒性和對(duì)微血管的損傷，可能與PKC有關(guān)〔20〕。

4其他因素引起的VEC凋亡許多因素可引起VEC凋亡，如細(xì)胞內(nèi)PH值、LPS、輻射、氧化低密度脂蛋白等。細(xì)胞內(nèi)PH值降低可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制是酸化的細(xì)胞環(huán)境，容易激活DNaseⅡ誘導(dǎo)凋亡〔21〕，而細(xì)胞內(nèi)pH值的降低對(duì)細(xì)胞本身也具有直接毒性作用。LPS所致的VEC損傷是以VEC凋亡的形式出現(xiàn)。應(yīng)用LPS作為急性蛋白反應(yīng)誘導(dǎo)劑，預(yù)先處理主動(dòng)脈EC，可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，當(dāng)加熱或加入亞砷酸鈉鹽時(shí)，細(xì)胞凋亡更加明顯〔22〕。輻射誘導(dǎo)的VEC凋亡主要發(fā)生在Go～G₁期細(xì)胞，并不是輻射的細(xì)胞直接作用。氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)誘導(dǎo)血管和心內(nèi)膜EC凋亡是ox-LDL對(duì)培養(yǎng)新生小牛主動(dòng)脈EC及心內(nèi)膜細(xì)胞有損傷作用。VEC及心內(nèi)膜細(xì)胞具有典型凋亡形態(tài)學(xué)改變，DNA降解呈時(shí)間和劑量依賴性〔23〕。總之，VEC凋亡的機(jī)制復(fù)雜，作用的因素多，各種誘導(dǎo)因子和作用機(jī)制尚未研究清楚，存在彼此相互矛盾的情況，但有一點(diǎn)是明確的，細(xì)胞凋亡在機(jī)體的生理和病理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。

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作者簡(jiǎn)介：李向東男，1963年生，1987年畢業(yè)于第四軍醫(yī)大學(xué)，1993年獲醫(yī)學(xué)碩士學(xué)位，1997年入第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院從師魯開化教授攻讀博士學(xué)位。

收稿日期2000-05-10

編輯/姜如蓉