申屠旭萍　俞曉平　夏湛恩　徐紅星

摘要從浙江長興采集的銀杏莖中分離到一株內生真菌，編號為1028。本文對其產生的代謝產物進行了抑菌活性的初步研究，生測結果表明：離體條件下發(fā)酵液對番茄早疫病菌、黃瓜枯萎病菌、菜豆炭疽病菌、葡萄炭疽病菌、水稻紋枯病菌、黃瓜立枯病菌均有較強的抑制作用，對不同病原菌的抑制率分別為：66．7％、48．3％、64．6％、36．5％、57．1％、23．0％。抑菌活性成分在80℃以下趨于穩(wěn)定，pH為7～8時抑菌效果最強。

關鍵詞內生真菌；銀杏；抑菌活性

中圖分類號S 435．131．49

植物內生真菌(plant endophyticfungi)是一種新興的微生物資源，研究表明其對植物某些活性成分的形成有重要影響，通常會產生與其宿主植物相同或相似的生理活性物質。近年來，植物內生真菌本身及其次生代謝產物應用于醫(yī)藥和農業(yè)方面的研究逐漸成為熱點。而從銀杏中分離篩選內生真菌，其液體發(fā)酵產物用于抑制植物真菌病害病原菌的研究國內外未見報道。本文從浙江長興采集的銀杏莖中分離篩選到一株內生真菌，并進行其代謝產物對多種植物真菌病害病原菌的抑制作用的研究；同時也測定了活性成分在不同條件下抗菌效果的穩(wěn)定性，以便為該菌株的進一步開發(fā)利用提供理論和實踐基礎。

1材料與方法

1．1供試菌株及來源

從浙江長興銀杏長廊采集的銀杏莖中分離篩選到一株內生真菌，編號為1028，接種于試管斜面培養(yǎng)基，4℃保存。

供試病原菌：番茄早疫病菌(Alternaria sola—ni)、黃瓜枯萎病菌(Fusarium ox ysporum)、菜豆炭疽病菌(Colletotrichum capsici)、葡萄炭疽病菌(C．gloeos porioides)、水稻紋枯病菌(Thanate phoruscucumeris)和黃瓜立枯病菌(Rhizoctonia solani)，由浙江省農業(yè)科學院植物保護與微生物研究所提供，斜面保藏于4℃冰箱中，備用。

1．2培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基。用馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊旨20g，水1 000mL,pH自然。馬鈐薯去皮，切成塊煮沸0．5h，然后用紗布過濾，再加葡萄糖和瓊脂，溶化后補足水至1 000mL。

發(fā)酵培養(yǎng)基：黃豆餅粉10g，玉米粉7．5g，可溶性淀粉10g，麩皮5 g，蛋白胨4g，CaCO³2．5g，Nh⁴NO³1．5g,MgSO⁴0．5g，KH²PO⁴1．5g，水500mL。

1．3內生真菌發(fā)酵

將500mi。培養(yǎng)液分裝在300mL。的三角瓶中，每瓶裝液量為50mL。用接種鉤挑取少許No．1028菌絲接種于培養(yǎng)瓶中，置于27℃搖床，200 r／min，振蕩培養(yǎng)4d。發(fā)酵液5 000r／min離心8min，取上清液，棄菌絲體。

1．4發(fā)酵液抑菌活性測定

取No．1028菌株發(fā)酵液1mL。于無菌培養(yǎng)皿內，與9mL。冷卻至45℃的PDA培養(yǎng)基迅速混勻，冷卻后在每個培養(yǎng)基平面放1個供試菌的菌餅(直徑為4mm)，菌餅接于培養(yǎng)皿中央(培養(yǎng)皿直徑為9 cm)，置28℃培養(yǎng)，以無菌水處理作為對照，重復3次。其中，番茄早疫病菌、黃瓜枯萎病菌、菜豆炭疽病菌、葡萄炭疽病菌培養(yǎng)72h，水稻紋枯病菌和黃瓜立枯病菌培養(yǎng)18h，采用十字交叉法測定菌落直徑，計算抑制率。

1．5發(fā)酵液穩(wěn)定性的測定

1．5．1熱穩(wěn)定性

取3mL．No．1028菌株發(fā)酵液于50、60、70、80、90、100℃水浴鍋中分別處理2h，以未處理的發(fā)酵液做對照，重復3次。參照1．4方法測定菌絲生長直徑，根據直徑大小計算菌絲生長抑制率，并確定其熱穩(wěn)定性。

1．5．2酸堿穩(wěn)定性

分別取3 ml．No．1028菌株發(fā)酵液加入5支無菌試管中，用6 mol／L HCl和2 mol／I．NaOH分別調至pH為3、5、9、11，放置2h，做抑菌試驗，以未處理的發(fā)酵液(自然pH6．8)做對照，重復3次。參照1．4方法測定菌絲生長直徑，計算抑制率。

2結果與分析

2．1菌株發(fā)酵液對植物病原菌的抑制作用

從表1可以看出No，1028菌株發(fā)酵液對6種植物病原菌均有不同程度的抑制作用。其中對番茄早疫病菌、菜豆炭疽病菌、水稻紋枯病菌的抑制率都在50％以上，而對黃瓜枯萎病菌的抑制率在48％左右，對葡萄炭疽病菌、黃瓜立枯病菌的抑制率則分別在36％和23％。試驗結果可以說明No．1028發(fā)酵液抗菌譜較廣，抗菌效果較好。

2．2溫度對No．1028發(fā)酵液抑菌作用的影響

以黃瓜立枯病菌和水稻紋枯病菌為指示菌，測定不同溫度下No．1028內生真菌發(fā)酵液的抑菌活性。結果見圖1(以未處理的發(fā)酵液的抑菌效果為100％，其他溫度下處理后的抑菌效果與其相比較所得百分比為相對抑制效果)。由圖1可知，No．1028菌發(fā)酵液經不同溫度處理后其抑菌效果有一定的差別。當溫度超過80℃以上時對活性成分的穩(wěn)定性影響較大，抑菌效果變差，可能發(fā)生分解現象；處理溫度在40—70℃之間時，抑菌效果稍有減弱，但不明顯。這表明No．1028內生真菌發(fā)酵液中的抑菌活性成分在80℃以下具有較好的熱穩(wěn)定性。

2．3pH對No．1028發(fā)酵液抑菌作用的影響

同樣以黃瓜立枯病菌和水稻紋枯病菌為指示菌，研究pH對No．1028內生真菌發(fā)酵液抑菌活性的影響。結果見圖2(以發(fā)酵液自然pH的抑菌效果為100％，其他pH下處理后的抑菌效果與其相比較所得百分比為相對抑制效果)。在pH7—8，發(fā)酵液對黃瓜立枯病菌和水稻紋枯病菌的抑制效果相對較強。pH升高或降低對抑制效果有一定的影響，尤其是pH升至ll時，抑菌效果下降十分明顯。

3結論

通過本試驗，明確了銀杏內生真菌No．1028對6種植物病原菌有不同程度的抑制作用，說明銀杏內生真菌No．1028代謝產物是一個很有發(fā)展前景的抑菌活性物質；同時測定了No．1028發(fā)酵液在加熱、酸堿處理條件下的穩(wěn)定性，發(fā)現活性成分在80℃以下趨于穩(wěn)定，pH為7～8時抑菌效果最強。通過此項研究，為此菌株的進一步研究和產品開發(fā)奠定了堅實的基礎。

目前，研究工作正處于No．1028內生真菌發(fā)酵液中活性成分提純和結構論證階段，關于活性化合物的提取分離研究將在另文發(fā)表。