李增政　韋瑤　梁亞平　曹雪蓮　肖齊勝

摘 要 從百合鱗莖中發(fā)現(xiàn)一株產(chǎn)藍(lán)色素的放線菌，應(yīng)用發(fā)酵和平板培養(yǎng)兩種方法生產(chǎn)藍(lán)色素，采用酸堿法提取了該菌的藍(lán)色素粗提物，并對(duì)這兩種生產(chǎn)所得的藍(lán)色素粗提物分別進(jìn)行了抑菌活性、溫度等的實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該綠色素粗提物對(duì)肺炎雙球菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌等具有拮抗性；在4-60℃溫度下平板生產(chǎn)的色素比用發(fā)酵生產(chǎn)的色素要穩(wěn)定。

關(guān)鍵詞 藍(lán)色素 抑菌活性 溫度 酸堿法 發(fā)酵

中圖分類號(hào)：Q939.9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

0前言

次級(jí)代謝產(chǎn)物是指生物生長(zhǎng)到一定階段后通過次級(jí)代謝合成的分子結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜、對(duì)該生物無明顯生理功能，或并非是該生物生長(zhǎng)和繁殖所必需的小分子物質(zhì)，如抗生素、毒素、激素、色素等。色素廣泛應(yīng)用于食品、服裝、化妝品等行業(yè)，藍(lán)色素作為三種基本顏色之一，可與紅、黃色素調(diào)配稱多種色調(diào)，所以開發(fā)藍(lán)色素在各個(gè)領(lǐng)域中的應(yīng)用具有很大的現(xiàn)實(shí)意義和良好的市場(chǎng)前景。

1材料與方法

1.1 材料

1.1.1目標(biāo)菌株

從百合鱗莖中分離所得具有產(chǎn)生藍(lán)色素功能的放線菌。

1.1.2 主要試劑和藥品

75% 乙醇溶液、大量高溫滅菌的蒸餾水、無水乙醇、無水乙酸乙酯、甘油、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、重鉻酸鉀、制霉菌素、放線菌酮、萘啶酮酸等。

1.1.3主要器材及儀器

9cm培養(yǎng)皿、剪刀，鑷子，酒精燈，酒精棉球，移液槍，槍頭（藍(lán)色，黃色）、超凈工作臺(tái)、蒸汽滅菌鍋、搖床培養(yǎng)箱、1000ml錐形瓶、打孔器、離心機(jī)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、冷凍干燥機(jī)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基及抑菌劑的配制

改良高氏I號(hào)：可溶性淀粉 20 g；K2HPO4·3 H2O，0.5 g；MgSO4·7H2O，0.5 g；FeSO4·7H2O，0.01g；KNO31 g；NaCl0.5g；Distilled water1000ml；瓊脂18g。

抑菌劑：重鉻酸鉀（50 g/mL），萘啶酮酸（20 g/mL），放線菌酮（50 g/mL），制霉菌素（50 g/mL）。

發(fā)酵種子培養(yǎng)基：可溶性淀粉15g，葡萄糖5g，黃豆粉10g，氯化鈉1g，蛋白胨5g，酵母提取物5g，碳酸鈣5g，蒸餾水1000ml，PH7。

發(fā)酵培養(yǎng)基：黃豆餅粉20g，酵母粉15g，葡萄糖10g， K2HPO4 1g， 碳酸鈣3g，氯化鈉1g，蒸餾水1000mL，PH7.2左右。

1.2.2放線菌的培養(yǎng)

將所得的目標(biāo)菌株采用平板劃線法劃到改良高氏I號(hào)固體平板上，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度為23—26℃。培養(yǎng)5天左右就可以看到平板上的白色菌落，15天左右就可看到平板上有藍(lán)色素產(chǎn)生。

1.2.3發(fā)酵

從生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期的平板中挑取一定數(shù)量的單個(gè)菌落接種于種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，種子培養(yǎng)基于搖床中160r/min培養(yǎng)溫度26℃ 培養(yǎng)時(shí)間3天左右。種子培養(yǎng)基占發(fā)酵培養(yǎng)基的10%。

將活化兩天以后的種子培養(yǎng)基接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，溫度26℃ PH7.2置于160r/min搖床中發(fā)酵直至發(fā)酵培養(yǎng)基變成藍(lán)綠色為止。（方法一）

1.2.4平板培養(yǎng)法

將該菌采用平板劃線法劃到改良高氏I號(hào)固體平板上，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度為23—26℃。培養(yǎng)至平板完全變成藍(lán)色為止，然后將平板浸泡在無菌水中帶水溶液變成藍(lán)色為止。（方法二）

1.2.5色素提取

提取方法采用酸堿提取法，將發(fā)酵液和浸泡液分別調(diào)PH至12然后4℃ 4000r離心10分鐘：將離心后的上清PH調(diào)至1—2，再次4℃ 4000r離心10分鐘；最后去上清將沉淀物真空冷凍干燥得到藍(lán)色素粗提物。

1.2.6色素抑菌活性實(shí)驗(yàn)

抑菌活性采用濾紙片法濾紙片直徑為9mm，溶劑采用三種分別是蒸餾水（1）、99.9%乙醇（2）、乙酸乙酯（3），色素粗提物濃度均為0.003g/ml。操作時(shí)將濾紙片浸濕在色素粗提物溶液中然后待風(fēng)干以后再操作

方法一生產(chǎn)的色素抑菌活性：

方法二生產(chǎn)的色素抑菌活性

1.2.7溫度對(duì)色素粗提物的影響

方法二所生產(chǎn)的色素：

方法二生產(chǎn)的色素0.1g溶于50ml水中：

方法一生產(chǎn)的色素0.15g溶于50ml水中：

應(yīng)用兩種生產(chǎn)色素方法來生產(chǎn)色素，提取色素粗品以后進(jìn)行溶解時(shí)發(fā)現(xiàn)：方法一生產(chǎn)的色素需要將PH調(diào)為11—12（起始PH為2.8）才能變成藍(lán)色放置一段時(shí)間后溶液會(huì)變成黃色，而應(yīng)用方法二生產(chǎn)的色素溶于水以后溶液直接變成藍(lán)色長(zhǎng)時(shí)間保存不變色。

2結(jié)果及分析

應(yīng)用兩種方法生產(chǎn)所得的色素在色澤上差異很大。方法一所得的色素需要經(jīng)過調(diào)節(jié)PH才能呈現(xiàn)藍(lán)色但是暗淡，在常溫下放置一段時(shí)間后會(huì)變成黃色，在熱水80€凹？0€耙隕霞尤？0s會(huì)變成黃色在溫度對(duì)色素的影響實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)隨著溫度升高OD值逐步減小，顏色也越來越淡偏向黃色所以應(yīng)用該方法所生產(chǎn)的藍(lán)色素不穩(wěn)定；方法二所得的色素色澤鮮亮藍(lán)色明顯，常溫下放置不會(huì)變色加熱到90€耙膊換岜瀋琌D值也沒有呈現(xiàn)逐步減小，所以方法二所生產(chǎn)的色素相對(duì)比較穩(wěn)定。

在抑菌活性實(shí)驗(yàn)中，兩種方法所生產(chǎn)的色素均表現(xiàn)出了不同的抑菌活性其中金黃色葡萄球菌、肺炎雙球菌、大腸桿菌是兩種色素在乙醇和乙酸乙酯溶劑下都有抑菌活性，不同方法生產(chǎn)的色素在不同溶劑中表現(xiàn)出來的抑菌活性有著明顯不同，造成這種原因是因?yàn)樯a(chǎn)方式的不同；而相同色素在相同溶劑下對(duì)同一株菌的抑菌活性不同可能是因?yàn)樯厥谴痔嵛锢锩嫖镔|(zhì)多樣在不同溶劑中表現(xiàn)出了不同溶解度。

基金來源：國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目《一株產(chǎn)藍(lán)色素放線菌的色素提取及相關(guān)研究》項(xiàng)目編號(hào)：201610742073。

參考文獻(xiàn)

[1] 趙珂，等.攀西地區(qū)藥用植物內(nèi)生及根際放線菌的多樣性與抗菌活性研究[J]四川大學(xué)博士學(xué)位論文，2011：74-124.

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